קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Summary

תקשורת זה מובאים נתונים על דיוק ועל שחזור של ספקטרופוטומטר UV-VIS BioSpec ננו עבור dsDNA ו quantitation חלבון. אפילו עם כמויות קטנות במיוחד (1 עד 2 ליטר), שחזור מצוין, בעוד פונקציה מנגב אוטומטי משפר את התפוקה ואת התוצאות שריד מינימלי תוצאות מדויקות יותר.

Abstract

גרעין quantitation נהלים חומצה יש מתקדמות באופן משמעותי בשלושת העשורים האחרונים. יותר ויותר, ביולוגים מולקולריים דורשים ניתוח בקנה אחד קטן בנפח של דגימות חומצות גרעין עבור הניסויים שלהם. BioSpec ננו מספק פתרון אפשרי לבעיות לא מדויק, לא לשחזור תוצאות, הטמון שיטות quantitation הנוכחית DNA, באמצעות האופטיקה המקצועית גלאי PDA רגיש. BioSpec ננו יש גם פונקציונליות אוטומטיות כזו הרכבה, מדידה, ניקוי נעשים על ידי המכשיר, ובכך למנוע השמה משעמם, חוזר על עצמו, וגם לא עקבית של אלמנט סיב אופטי ניקוי ידני.

במחקר זה, הנתונים שהוצגו על כימות של דנ"א וחלבונים, כמו גם על שחזור מדידה ודיוק. מגע מדגם אוטומטי לסריקה מהירה מאפשר מדידה תוך שלוש שניות, וכתוצאה מכך תפוקה מעולה. ניתוח הנתונים מבוצע באמצעות תכונות מובנות של התוכנה. הנוסחה המשמשת לחישוב ריכוז ה-DNA הוא:

לדוגמא ריכוז = DF ° (OD260-OD320) · NACF (1)

איפה DF = דילול מדגם גורם ו NACF = גורם גרעין ריכוז החומצה.

גורם גרעין ריכוז חומצה מוגדר בהתאם אנליטי שנבחר ^1.

ריכוז תוצאות חלבון ניתן לבטא מיקרוגרם / מ"ל ​​או שומות / L ידי הזנת e280 וערכים משקל מולקולרי בהתאמה. כאשר ערכים שאריות של Tyr, TRP ו - ציסטאין (SS האג"ח) מוזנים בכרטיסיה e280Calc, מקדם את הערכים הכחדה מחושבים e280 = 5,500 x (שאריות TRP) + 1490 x (שאריות Tyr) + 125 x (ציסטאין אס האג"ח) . ערך e280 משמש תוכנה לחישוב ריכוז.

בנוסף לקביעת ריכוז של חומצות גרעין וחלבונים, BioSpec ננו יכול לשמש ספקטרופוטומטר מיקרו נפח אולטרה עבור analytes רבים אחרים או ספקטרופוטומטר תקן באמצעות 5 pathlength תאים מ"מ.

Protocol

1. נוהל quantitation DNA

1. הפוך על המכשיר.
2. פתח את תוכנת BioSpec ננו משולחן העבודה במחשב.
3. לחץ על הכרטיסייה פשוט חומצה dsDNA גרעין (איור 1).
4. התוכנה יהיה ליצור תקשורת עם המכשיר ולהפעיל רצף האתחול. זה מוודא כי המכשיר מתפקד בהתאם למפרט.
5. בחר 0.7 או 0.2 מ"מ על המחוון pathlength. זה בוחר את pathlength וכל החישובים מבוססים על pathlength שנבחר.
6. הבא BioSpec ננו ההתקנה לחץ על הגדרת-Autowiping תוכנה. בחר 1 או 2.
7. פיפטה 2 μL (0.7 מ"מ) H ₂ O או חיץ על הכן.
8. לחץ ריק או F6 למדידת ריק. בכל פעם pathlength חדשה נבחרה יש צורך להקליט ריק.
9. פיפטה 2 μL של המדגם על הכן.
10. לחץ על התחל בתוכנה או ללחוץ על הכפתור להתחיל על המכשיר. החלון העליון מהלכים ליצור קשר עם רביב המדגם. מהבהב קסנון ניתן לצפות.
11. חזור על מדגם זהה 3 פעמים כדי לקבוע reproducibility.
12. כל הנתונים נרשם נשמר כקובץ. ניצן.
13. כדי לשמור כקובץ. Pdf או. קובץ CSV לחץ על שמור PDF / csv או F9. תוצאות ניתן גם לשמור כקובץ csv. באמצעות בחירה בלשונית המתאימה לשמור.

2. פרוטוקול quantitation חלבון

1. בחר quantitation הכרטיסייה חלבון (איור 2).
2. הזן את e280 מקדם הכחדה, אם הוא ידוע.
3. אם e280 אינו ידוע לחשב אותו באמצעות e280Calc.
4. בחר 0.7 או 0.2 מ"מ על המחוון pathlength.
5. לחץ על Setup-Autowiping ההתקנה. בחר 2 ומעלה.
6. פיפטה 3 μL (0.2 מ"מ) H ₂ O או חיץ על הכן.
7. לחץ ריק או F6 למדידת ריק.
8. פיפטה 3 μL מדגם חלבון על הכן.
9. לחץ על התחל בתוכנה או ללחוץ על הכפתור להתחיל על המכשיר.
10. חזור על מדגם זהה 3 פעמים כדי לקבוע reproducibility.
11. כל הנתונים נרשם נשמר כקובץ. ניצן
12. כדי לשמור כקובץ. Pdf או. קובץ CSV לחץ על שמור PDF / csv או F9.

3. נציג תוצאות:

1. תוצאות עבור quantitation DNA

איור 3 מציג את נתוני מדידות על דגימת DNA גדילי כפול טיפוסי. ריכוז ו OD 260/280 יחס מחושב מוצגים גם. איור 4 מכיל מבחן reproducibility תוצאות quantitation DNA. הנתונים איורים 3 ו -4 תוצאות מראה ולייצר מאוד כפי שעולה סטיית תקן נמוכה יחסית של 0.26%.

הערה 1:

אי דיוק quantitation DNA יכול לנבוע נוכחות של רכיבים חיץ אשר עשוי לספוג באזור UV. זהו גם צורך להשתמש בפתרון מדגם הומוגני. ככל שכמות מדגם pipetted להיות רק 1-2 pipetting μL, נזהר כרכים מדויק ללא הקדמה של בועות בכל הנדרש.

2. תוצאות עבור quantitation חלבון

איור 5 מייצג ריכוז חלבון ניתוח BSA. ריכוז מיקרוגרם / מ"ל ​​חלבון מבוססת על ערך e280. איור 6 מציג ניתוח שחזור. ברור מן סטיית התקן היחסית של 0.51% כי BioSpec ננו ריכוז אמצעים בדיוק - לא רק דנ"א אלא גם חלבונים.

הערה 2: גורמים המשפיעים על ריכוז חלבון

קביעת ריכוז מדויק של חלבון אפשרית כאשר יש תופעות מינימום מחוסר יציבות הנגרמת על ידי ה-pH, מאגרים, טמפרטורה או תוספים. חלבונים מטוהרים רוב עובר שלבים שונים של עיבוד, ולכן ייתכן כי החלבון עשוי להכיל חומרים פעילי שטח או תוספים אחרים שעשויים להפריע ליצירת טיפה. לקבלת דוגמיות כאלה, באמצעות 5 מ"מ pathlength תא קוורץ מומלץ מאוד.

1. איור אנליטי מבחר חלון quantitation DNA גדילי כפול

2. איור אנליטי מבחר חלון quantitation ללא חלבון הנקרא

איור 3. נציג נתונים עבור quantitation DNA

איור 4. שחזור נתונים quantitation DNA

איור 5. נציג נתונים עבור quantitation חלבון

איור 6. שחזור נתונים עבור quantitation חלבון

Discussion

BioSpec-nano תוכנן כדי לפתור את הבעיות הנוכחיות הטמון שיטות quantitation DNA, כגון תוצאות לא עקביות ועל עבודת כפיים מייגעת. מדידת כל לוקח רק 3 שניות, מה שמאפשר ביולוג מולקולרי מנוסה לנתח דגימות מרובות על 3-6 תוך דקה. תכונת מגב ייחודי לא רק משפרת את התפוקה של המדידה, היא גם מבטלת את הצורך בניקוי ידני של כנים, וכתוצאה מכך שריד זניח בין המדידות. יתר על כן, רק 2 בדיקות באמצעות מגבונים עבור דגימות DNA המכיל 1000 ng / μL, ציין שריד פחות מ 2 ng / μL.

הזמינות של תא pathlength 5 מ"מ מספק אפשרות לנתח חומצות גרעין לדלל דגימות חלבון, מרחיב את השימוש במכשיר זה עבור יישומים אחרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpec-nano	Shimadzu Corporation
Calf Thymus DNA	Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich