ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

Summary

שתוארו כאן הם השתמשו בפרוטוקולים כדי להמחיש את התהליך הדינמי של תיקון MG53 בתיווך קרום התא בבעלי חיים שלם ברמה התאית. שיטות אלה ניתן ליישם כדי לחקור את הביולוגיה של התא פותחת הממברנה הפלסמטית ורפואה רגנרטיבית.

Abstract

תיקון של פגיעה חריפה על קרום התא היא תהליך יסודי של הפיזיולוגיה הסלולר נורמלי, פגום לתיקון קרום נקשר הרבה מחלות אנושיות ניווניות. התגלית האחרונה של MG53 כמרכיב עיקרי של המנגנון פותחת הממברנה מאפשרת הבנה טובה יותר של מולקולרי הביולוגיה הבסיסית של תיקון רקמות, כמו גם עבור יישומים translational פוטנציאליים רפואה רגנרטיבית. כאן אנו בפירוט את פרוטוקולי הניסוי לבחינת תפקוד vivo של MG53 במצב של פציעה בשריר תוך שימוש בפרוטוקולים תרגיל הליכון על מודלים העכבר, לבדיקת vivo לשעבר קרום יכולת לתקן על ידי מדידת ערך צבע לתוך סיבי שריר מבודדים, לניטור תהליך דינמי סחר MG53 בתיווך שלפוחית ​​ואת קרום התא לתקן תאים בתרבית באמצעות מיקרוסקופ תא חי confocal.

Protocol

1. הליכון ריצה עבור חשיפת היקף לפגיעה בשרירים במודלים של עכברים

1. קבעו את הזווית של פני הליכון לשימוש במהלך פרוטוקול הריצה. באופן כללי, ברמה שטוחה או זווית בין 7 ° ו 15 DEGREES ° בירידה או בעלייה משמש. הליכונים יש במנגנון נפרד כדי להתאים את שיפוע בעוד שאחרים דורשים הליכון להיות גבוהות באמצעים אחרים.
2. מניחים על מגש או משטח המעבדה כחול מתחת ההליכון לפני שהכניס את בעלי החיים ההליכון לאסוף כל פסולת בעלי החיים במהלך פרוטוקול הריצה.
3. לפני עכברים ריצה צריך להיות acclimated לסביבה של ההליכון. זו כוללת הצבת חיות הליכון למשך 15 דקות עם רשת החשמל לסירוגין את המנוע כונן חגורה על חגורה אבל לא נעים (כלומר עם מהירות להגדיר 0 m / s).
4. הפעל לרשת החשמל מוטיבציה. עוצמת ותדירות הפולסים משמש בדרך כלל ניתן לשלוט על הליכונים אלא משתנה מיצרן אחד למשנהו. בדרך כלל, העוצמה המקסימלית אינו נדרש להניע העכברים לרוץ זמן בתדירות גבוהה (לפחות פעם אחת כל שתי שניות) יהיה לשפר את התאימות.
5. הפעל את החגורה הליכון להתחיל את הפרוטוקול פועל. המהירות ההתחלתית של כ 5 מטר / דקה אמור לשמש במשך תקופה חימום עבור העכברים. המהירות של ההליכון יכול להיות מואץ באיטיות, בדרך כלל על ידי הוספת 1-2 מטר / דקה עבור כל דקה לאחר תחילתו של ההליכון.
6. היענות של בעלי חיים ברוב הפרוטוקולים ניתן לשפר על ידי ביצוע סדרה של ריצות קצרות (5 דקות) במהירות לחמם במשך 3 עד 10 ימים לפני הריצה הניסוי מתחיל.
7. תרגיל תשישות חריפה בדרך כלל כרוך להגדיל את המהירות של ההליכון עם הזמן עד למהירות המרבית (בדרך כלל <30 מ '/ מ') מושגת ומתוחזק עד העכברים להראות סימני תשישות. קריטריונים לשיפוט תשישות להשתנות, אך בדרך כלל כוללים עכבר לבלות יותר ממחצית הזמן על רשת החשמל או 5 שניות רצופות על רשת החשמל מבלי לחזור אל פני השטח הליכון. לאחר עכבר הפרט הוא מותש אותו ניתן להסיר ההליכון ואת הזמן הכולל של ריצה ניתן להקליט.
8. שינוי הזווית של ההליכון יכול לשמש בניסויים ריצה חריפה להגדיל את עומס התרגיל (עם זווית בעלייה), או לגרום להתכווצויות אקסצנטרי נזק (עם זווית ירידה) כי לקרוע את הקרומים sarcolemmal של סיבי שריר ^1. אוונס כחול צבע יהיה ניתן להזריק לתוך החיות לפני נהלים כאלה לשימוש לצבוע היסטולוגית לזהות סיבי השריר שניזוקו ^2,3.
9. אימון סיבולת ריצה פרוטוקולים לספק עומס תרגיל החיה על פני תקופה ממושכת (עד חודשים) על מנת לייצר עיצוב מחדש של השריר או מערכת הלב וכלי הדם. חימום הליך זהה לעיל (שלב 1.5) אולם את המהירות המרבית היא בדרך כלל נמוכה יותר פעמים לרוץ יכול להיות ארוך למדי (> 1 שעה).
10. לאחר השלמת ריצה העכברים ניתן להחזיר את הכלובים. הליכונים בדרך כלל להיות מלוכלך למדי ואילו העכברים פועלות, בעיקר על פרוטוקולים ארוך. יש צורך לנקות את ההליכון, בדרך כלל עם תרסיס אתנול 70%, לאחר כל שימוש.

2. Assay Ex Vivo של קיבולת ממברנה תיקון של סיבי שריר מבודדים בעקבות-UV לייזר נזק

1. לנתח את השכבה השטחית של השריר digitorum מכופף (FDB) brevis מרגל העכבר. ראשית, לחתוך את עור לפתוח את היחידה על קו החציון תוך הקפדה לא לפגוע בשרירים מתחת, ולאחר מכן לבצע חתכים אופקיים להסיר את העור. הגיד הלבן השטוח של שריר FDB (בגיד הפרוקסימלי) ניתן לראות מחוברת עצם calcaneus. בבוטות להפריד את גיד ידי מלקחיים לנתק את גיד קרוב לאתר של הקובץ המצורף, לתפוס את הגיד בחינם על ידי מלקחיים ומושכים אותו בעדינות כדי להפריד את FDB מן הרקמות הסובבות תוך צמצום כל רקמות החיבור שנותרו מחוברים. כאשר אדם רואה סניף גידים דיסטלי של ספרות הפרט FDB ניתן להסיר על ידי חיתוך שבו הגידים האלה להתחבר בשכבה עמוקה יותר של השריר.
2. מכניסים את צרור שריר FDB ב 1 מ"ל של תמיסת collagenase מראש לחמם 37 מעלות צלזיוס צינור 1.5 Eppendorf מ"ל, קלטת את הצינורית אוריינטציה אופקית 37 ° C מסלולית שייקר ולנער בסל"ד 200 דקות 65. הטיימס של דגירה יכול להיות מותאם על מנת להבטיח עיכול מספיק, אשר מסומן על ידי מראה בלוי צבע חיוור של השריר.
3. בזהירות להעביר את צרור FDB מעוכל לתוך צינור 1.5 צנטריפוגה μl המכיל ~ 600 μl של Tyrode 2.5 ⁺ Ca ² באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל עם סיום חתך בעל קוטר מספיק כדי לאפשר את צרור מתעכל בקלות לעבור ללא הפרעה. בעדינות להעיף את הצינור כדי לנער את סיבי משוחרר מן הצרור.
4. גזור טיפ 30 פיפטה μL כך דiameter רק במעט יותר מאשר צרור השריר (בין 15-20 מיקרומטר קוטר) השתמש pipettor כדי למשוך בעדינות את הצרור אל פיפטה ואז לדחוף אותו בחזרה לתוך התמיסה.. חזור על תהליך זה עד רוב הסיבים הם משויך מן הצרור.
5. מערבבים היטב על ידי סיבים משויך בעדינות מפנה את הצינור, לקחת סכום הרצוי ושחרר על צלחת זכוכית התחתונה דלתא טי. נפח לטעון תשתנה בהתאם יעילות הבידוד ומספר סיבי שימושי כי יש צורך בצלחת עבור פרוטוקול מסוים. הסיבים הנותרים ניתן לאחסן את הצינור על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 6 שעות מחקרים נוספים.
6. אפשר את המנה לשבת באין מפריע במשך 5 דקות. זה מאפשר הסיבים לדבוק תחתית הזכוכית של המנה.
7. מניחים את צלחת זכוכית על תחתית מיקרוסקופיה confocal מצויד לייזר UV. שים לב סיבים תחת מיקרוסקופ שלב בהגדלה> 100x כדי לבדוק נוכחות של דפוס striation נורמלי מוט ישר, כמו הצורה.
8. הוסף FM1-43-64 או FM4 צבעים styrylpyridinium ⁴ הפתרון לריכוז סופי של 2.5 מיקרומטר ^5.
9. כדי לגרום נזק למצב סיבים אותו בחלון הדמיה כך הסיב מכוונת בזווית 45 ° מן בפינה השמאלית העליונה של שדה הראייה בצד ימין למטה (איור 1). מקרינים שטח 5x5 פיקסלים (כ 0.9μmx0.9μm) של קרום הפלזמה באמצעות לייזר UV (80 mW או יותר, 351/364 ננומטר) מוגדר כוח מרבי למשך 5 שניות. האזור מוקרן צריך לפצל את הממברנה הפלסמטית, כלומר, מחצית תיבת 5x5 צריך להיות בתוך הסיב, והשאר צריך להיות מחוץ סיבים (איור 1).
10. צלמו תמונות של כניסה לתוך צבע הסיב במרווחים של 5 שניות כל אחד לתקופה של עד 5 דקות.
11. חזור על שלב 2.8 עבור לא יותר מ 3 סיבים לכל מאכל, כמו צבע פלואורסצנטי תהיה בסופו של דבר endocytosed לתוך סיב ו לסבך כל ניתוח הנתונים. לאחר 3 סיבי מאכל חדש צריך להיות מוכן משלב 2.5.
12. ניתוח נתונים על ידי חישוב השינוי בעוצמת הקרינה (ΔF / F ₀₎ בין כל מסגרת שנתפסו כדי למדוד את כמות כניסת לצבוע. זה דורש למדוד את הקרינה בשטח ממוצע של כ 200 מיקרומטר ² באמצעות תוכנת ניתוח כגון ImageJ זמין בפומבי (http://rsbweb.nih.gov/ij/). לשם השוואה בין הסיבים, החישוב הבא צריך להיעשות עבור כל מסגרת: ΔF / F _{0, 0} כאשר F הוא אומר הקרינה באזור של עניין במסגרת כבש ראשון (t = 0; לפני הפציעה), וכן הוא ΔF השינוי הקרינה של כל מסגרת הבאים (FF _0).

3. חיים הדמיה תא Confocal כדי לפקח על תהליך דינמי של תיקון קרום התא

1. Micropipettes נעשו פיירקס נימים. נימי הושם על חולץ micropipette ומשך לפי תוכנית שנקבעה מראש (חום = 695; משוך = 50; לוול ךיב .= 55; זמן = 250).
2. Micropipette צורפה micromanipulator 3 ציר (xyz).
3. תאים הם transfected עם פלסמיד דנ"א באמצעות שיטות נורמלי על צלחת זכוכית התחתונה דלתא טי. התקשורת צריכה להיות עברה 2.5mm Ca ^{2 +} חיץ Tyrode לפני ניסויים להתחיל.
4. צלחות זכוכית המכיל תאים transfected הונחו על לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal עם 40X אובייקטיבי שמן 1.3NA טבילה.
5. נזק חמור לחיות תאים בוצעה על ידי הוספת micropipette לתוך קרום התא, ואז מהר לחזור micropipette מחוץ לתא ^3,6. ברציפות תמונות תא חי התקבלו בהפרש של 1.54 s / מסגרת.
6. עבור assay שיבוש saponin המושרה קרום, saponin 0.005% (Sigma) ב 2.5mm Ca ^{2 +} חיץ Tyrode היה perfused ידי מערכת אישית התאספו הכבידה זרימה זלוף ^7. שיעור זלוף הוא כ 1 / ml דקות ועל קצה זלוף צריך להיות ממוקם ישירות מעל התא להיות הדמיה.

4. נציג תוצאות:

הסרט מייצג של ריצה על הליכון העכבר יכול להתבצע במהלך הצילומים. הסרט יהיה להדגים את היכולת לרוץ מופחת של mg53-/ - בעכברים עקב פגיעה בשריר השלד.

היקף הנזק שנגרם על ידי פרוטוקול-UV לייזר הנזק כמפורט לעיל תלוי ביכולת לתקן קרום של סיבים ניתחו. יכולת זו מושפעת גנוטיפ של העכבר שממנו סיב בודד, בתנאים תאיים, וכל שינויים בביטוי החלבונים (transfection או זיהום). סיבים נורמלי סוג בר יאפשר קלה עד בינונית כניסה צבען (איור 2 א). סיבי שריר נגזר mg53-/ - עכברים עם יכולת להתפשר תיקון קרום יציג כניסה משמעותית יותר של צבע לתוך הסיב (איור 2b).

תוצאות אופייניות של טרנסלוקציה פציעה להראות microelectrode של MG53 המכילים vesicles לאתר פציעה. איור 3 א ו 3 ב מראים GFP-MG53 transfected C2C12 myotubes נפגע על ידי החדרת micropipette לתוך קרום התא. בתא לפני נזק micropipette, GFP-MG53 ממוקם על הממברנה פלזמה וגם בציטופלסמה ^3. בעקבות החדירה micropipette, GFP-MG53 שלפוחית ​​המכילה נעו לעבר אתרי נזק (כפי שצוין על ידי ראש חץ). איור 3c מראה GFP-MG53 transfected C2C12 myoblasts שטופלו של 0.005% saponin, חומר ניקוי שיכולים permeabilize הממברנה הפלסמטית. לאחר טיפול saponin, GFP-MG53 translocated מ cytosol אל קרום התא.

Weisleder, et al. באיור 1. סיבים יישור האזור הגדרה פציעה. אוריינטציה תקין של סיבי שריר מבודדים בתוך שדה הראייה ואת ההגדרה של האזור הראו פגיעה.

Weisleder, et al. איור 2. נזק לייזר UV של FDB. תמונות סיבים להראות סיבים לפני הפציעה (0 שניות, משמאל) על פגיעה פוסט 200 שניות (מימין). סיבים מן העכבר סוג בר (א) להראות פציעה קלה. סיבים מעכברים עם תיקון הממברנה נפגעת (ב) לאפשר לצבוע יותר להיכנס.

Weisleder, et al. איור 3. Microelectrode ו saponin נזק תאים בתרבית. תמונות להראות C2C12 myotubes (a, b) ו myoblast C2C12 (ג) לפני הפציעה (לעיל) פגיעה פוסט (התחתון). תאים עם פצועים microelectrode (א, ב) להראות MG53 טרנסלוקציה לאתרים פציעה (חיצים). תאים שטופלו saponin (ג) להראות MG53 טרנסלוקציה על קרום התא.

Discussion

ריצה הליכון היא מתודולוגיה שימושי על מתן עומס התרגיל של בעלי חיים שטופלו. כפי מתודולוגיה עבור מדידת תפקוד השרירים או יכולת סיבולת היא גישה רועש לשמצה שקשה לבצע באופן עקבי לשחזור ^8. באופן כללי, פעמים כדי תשישות יכולה לשמש נקודת הסיום כדי לפתור הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי, כגון אלה בין כמה קווי עכבר נוקאאוט ועכברים סוג בר ^9. מניפולציות ניסויית המייצרים הבדל דק יותר, כגון כמה ניסויים התרופות, לא יכול לפתור חילוקי מעל הרעש הקשורות טכניקה זו. על מנת למקסם את reproducibility ורגישות של טכניקות אלה חשוב לשמור על תנאים מושב למושב מאוד הדוק. הזמן של היום חיות ימומשו, כמו גם תקופת התנאים להתחמם בשימוש, הם גורמים חשובים וצריכים להישאר עקבי ממשפט למשפט.

השפעת מתח יכול להיות השפעה משמעותית על עיצוב של פרוטוקולים הליכון כמו זנים מסוימים של עכברים יכול לרוץ הרבה יותר זמן על ההליכון מאשר זנים אחרים מגיבים באופן שונה תרגיל סיבולת ^10. כקו מנחה כללי, עכברים רבים יוכלו לרוץ 200-300 מטר הכולל במחקר תשישות עם עלייה מתמדת במהירות של ההליכון (5 מ '/ מ' מהירות ראשוני עם 1 מ '/ מ' מוסף עבור כל דקה אחרי ההתחלה). עבור תרגיל סיבולת העכברים ניתן לרוץ בין 9-12 מ '/ מ' במשך 30 דקות 2 או 3 פעמים בשבוע. עם זאת, מחקרים בודדים בדרך כלל דורשים אופטימיזציה של פרוטוקול כדי להתאים לצרכים ניסיוניים בודדים.

ההליך-UV לייזר נזק הוכח להיות שיטה יעילה למדידת תיקון קרום קיבולת של סיבי שריר השלד ^3,6,11. אחת מרכיב חיוני להצלחת ניסויים אלה היא להשתמש בסיבי השריר היחיד להציג מראה ישר, בצורת מוט עם דפוס קבוע של פסי ו sarcolemma חלק שאינו מופיע מקומט. אם סיבי השריר אחרים נבחרו נזק הקרום עשוי להיות כבר נוכח אלה סיבים הפרשנות של תוצאות ניסויים אלה עשוי להיות מסובך. חשוב גם כי הכיוון של הסיבים ואת ההגדרה של האזור מוקרן להיות מוגדרת כ באיור 1. זה מספק פגיעה בגודל לשחזור, ובכך מאפשר השוואה בין הסיבים. אם האזור מוגדר של פגיעה נמצא לחלוטין בתוך הסיב, פגיעה פנימית תיווצר במקום לשבש את sarcolemma. בנוסף, ערך מחושב עבור ΔF / F ₀ רגיש מאוד באזור של עניין שנבחרו מדידת הקרינה מתכוון. שטח של כ 200μm ^2, סמוך ובכלל במקום הפציעה, הוא המתאים. בניגוד לאזור שהוגדר עבור פציעה, אזור זה צריך לשקר לחלוטין בתוך הסיב. אם תכלול שטח מחוץ סיבים, שטח ריק וכתוצאה מכך יגדל ΔF / F ₀ בסיבים עם כניסה לצבוע מעט תוך הפחתת ΔF / F ₀ בסיבים עם פנוטיפ חמור יותר. זה מקטין את הרגישות של assay, ובכך השוואה בין סיבי קשה יותר.

עבור assay את הנזק micropipette, את הזווית בין micropipette והתחתון צלחת זכוכית צריך להיות כ 45 מעלות על מנת ביעילות נזק של קרום התא. התאים נבחרו נזק micropipette יש לצרף בחוזקה אל החלק התחתון של התבשיל תאים מעוגלים לא אמור לשמש מאז סביר להניח שהם תנתק לאחר micropipette תוקעת. Permeabilzation ניסויים Saponin פחות תובענית מבחינה טכנית יחסית מהר לבצע לעומת micropipette מבחני חדירה. עם זאת, ישנן מספר מגבלות לנזק saponin, ובכלל זה רק תא אחד יכול לשמש לכל צלחת מאז saponin יהיה מפוזר נזק לתאים אחרים בכלי זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
מכרסמים הליכון	קולומבוס מכשירים Exer 3 / 6 או שווה ערך
70% אתנול	ISC Bioexpress
Dissection כלים כולל מלקחיים טיפ יפה, המספריים אביב	העולם מכשירי דיוק
2 מ"ג / מ"ל ​​collagenase סוג אני	סיגמא
0 Ca 2 + Tyrode חיץ (140 mM NaCl, KCl 5 mM, HEPES 10 מ"מ, 2 מ"מ MgCl 2, pH 7.2, 290 mosm)	סיגמא
2.5mm Ca 2 + Tyrode חיץ (140 mM NaCl, 2.5 מ"מ CaCl 2, 5 מ"מ KCl, HEPES 10 מ"מ, 2 מ"מ MgCl 2, pH 7.2, 290 mosm)	סיגמא
טמפרטורה לשליטה מסלולית שייקר	ניו ברונסוויק או שווה ערך
דלתא תבשיל TPG	פישר סיינטיפיק	1207133
LSM 510 מיקרוסקופ confocal עם לייזר 80 mW Enterprise UV או מיקרוסקופ confocal המקבילה	Zeiss
FM1-43-64 או FM4 צבעים	Invitrogen
בורוסיליקט נימים גודל 0.8-1.0 X 100 מ"מ	פיירקס	חלק מס '9530-2
Micropipette חולץ	סאטר מכשירים	דגם P-97
3 ציר micromanipulator	Narishige	MHW-3
2100 Radiance סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal מיקרוסקופ או שווה ערך	BioRad	MHW-3
Saponin	סיגמא	47036