ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות

Summary

באמצעות PCR כמותי, אנו מדגימים כיצד המודל ומבוססת חומוס CAM ניתן להשתמש כדי לנתח את כמותית גרורות של תאים סרטניים אנושיים לאיברים רחוקים.

Abstract

במהלך תאים סרטניים להפיץ גרורות מהגידול הראשוני, לפלוש לתוך הרקמות הסובבות, ומתפשטים לאיברים מרוחקים. גרורה היא תהליך מורכב זה יכול לערב סוגי רקמות רבות, בתקופות משך הזמן משתנה, ולעתים קרובות להתרחש עמוק בתוך איברים, ולכן קשה לחקור ולכמת. בנוסף, יעילות תהליך גרורתי מושפעת שלבים מרובים מפל גרורתית ולכן קשה להעריך את התרומה של היבט אחד של התנהגות תאים סרטניים. כתוצאה מכך, מבחני גרורות מבוצעות לעתים קרובות בחיות מעבדה לספק בהכרח בהקשר מציאותי שבו ללמוד גרורות. למרבה הצער, אלה הם מודלים מורכבים יותר על ידי הפיזיולוגיה המורכבת שלהם. עובר אפרוח הוא מודל ייחודי vivo כי מתגבר על מגבלות רבות ללימוד גרורות, בשל הנגישות של קרום chorioallantoic (רמ"א), היטב vascularized חוץ עובריים רקמות הממוקמת מתחת קליפת כי הוא פתוח xenografting של תאים סרטניים (איור 1). יתר על כן, מאז הוא עובר אפרוח immunodeficient טבעי, CAM בקלות תומך engraftment של רקמות הן נורמליות הגידול. והחשוב מכל, CAM העופות בהצלחה תומך המאפיינים תאים סרטניים ביותר כולל צמיחה, פלישה, אנגיוגנזה, שיפוץ של microenvironment. זה הופך את המודל שימושי במיוחד לצורך חקירה של מסלולים שיובילו גרורות סרטן כדי לחזות את התגובה של סרטן גרורתי כדי הרפוי פוטנציאליים חדשים. זיהוי של תאים המופץ על ידי מינים ספציפיים Alu PCR מאפשרת להעריך כמותית גרורות לאיברים כי הם יישבו על ידי כמה כמו 25 תאים. באמצעות קו קרצינומה האדם Epidermoid תא (HEp3) אנו משתמשים במודל זה כדי לנתח גרורות ספונטנית של תאים סרטניים לאיברים רחוקים, כולל הכבד חומוס ריאות. יתר על כן, באמצעות פרוטוקול Alu-PCR אנו מדגימים את רגישות שחזור של assay ככלי לניתוח לכמת, intravasation מעצר, extravasation, והקולוניזציה כמו אלמנטים בודדים של גרורות.

Protocol

1. הכנת ביצים xenografting (גרורות ספונטנית)

1. טרי הניח ביצים עוף מופרית מודגרת בתוך חממה מסתובב במשך 10 ימים ב 100 ° F ולחות 60%. ביצים הן מסובבות ארבע פעמים בכל שעה.
2. ביום התפתחותי 10 ביצים ממוקמים בצד שלהם במעמד ביצה. מקור אווז צוואר המנורה או אחרת אור מתאים משמש נר את הביצים על ידי זוהר אור לתוך קליפת בסוף בוטה של ​​הביצה שבה airsac ממוקם.
3. וריד chorioallantoic ממוקם ומסומן. וריד זה ממוקם בחלק העליון של קליפת הביצה שבה הוא צומת של מספר כלי דם גדולים. בשלב זה ענף כלי דם יורד למטה, הרחק CAM ומתחבר העובר. תיבת ריבוע 1cm מצוייר בעפרון על קליפת כ 1cm הרחק מנקודת סניף הווריד. האזור כולל סביב הכיכר הוא ניקה ואז באמצעות מקלון צמר גפן טבול יוד.
4. באמצעות כלי חיתוך מסתובבת (Dremel) מצויד אבן סיליקון קרביד שחיקה (חלק Dremel # 84922) הוא קדח חור דרך בקצה הקהה של הביצה אל שק אוויר. באמצעות כלי זה אותו הוא קדח חור בתוך הריבוע נמשך קודם לכן על גבי הביצה, עצירת קצר של קרום קליפת הביצה. מחט מד 25-מזרק עם ספחת קנס על קצה היא נהגה להכין חור קטן בקרום קליפת נזהרים שלא לקרוע את CAM הבסיסית. CAM היא מנותקת לאחר מכן מן קרום קליפת באזור הכיכר באמצעות שאיבה עדינה שנוצרו בעזרת פיפטה אוטומטית מצויד לצינור ¼ tygon "להציב מול החור airsac. עם החלת יניקה, כיס אוויר מתחת צריך החור בכיכר המסמנים כי CAM הופל בהצלחה הרחק קליפת הביצה. לאחר CAM הוא ירד, החור שק האוויר ואת החור ממוקם בכיכר ליד הווריד chorioallantoic אטום עם חתיכת סרט מעבדה הקלטת. הביצים מוטלות לאחר מכן ב 100 ° F ולחות 60% לתוך חממה נייח לקראת השתלת תאים סרטניים. ראה איור 1 עבור תיאור רציף.

2. הכנת ביצים הזרקה תוך ורידית (גרורות ניסיוני)

1. טרי הניח ביצים עוף מופרית מודגרת בתוך חממה מסתובב במשך 12 ימים 100 ° F ולחות 60%. ביצים הן מסובבות ארבע פעמים בכל שעה.
2. ביום התפתחותי 12 ביצים ממוקמים בצד שלהם במעמד ביצה. מקור אווז צוואר המנורה או אחרת אור מתאים משמש נר את הביצים על ידי זוהר אור לתוך קליפת בסוף בוטה של ​​הביצה שבה airsac ממוקם.
3. וריד chorioallantoic ממוקם ומסומן. 1cm על ידי מלבן 0.5 ס"מ מצוירת בעיפרון על קליפת הביצה ישירות מעל הווריד. האזור כולל סביב הכיכר הוא ניקה ואז באמצעות מקלון צמר גפן טבול יוד.
4. חלון קטן נוצרת קליפת במיקום נמשך באמצעות המקדח Dremmel (# 118). החלון מוסר לחשוף את קרום קליפת הבסיסית אשר מוצג לאחר מכן שקוף עם טיפה של שמן מינרלי. ראה 5A הנתון תיאור גרפי.
5. בשלב זה החור שק האוויר ואת החור ממוקם בכיכר ליד הווריד chorioallantoic אטום עם חתיכת סרט מעבדה הקלטת. הביצים מוטלות לאחר מכן ב 100 ° F ולחות 60% לתוך חממה נייח לקראת הזרקת תאים סרטניים.

3. הכנת תאים סרטניים עבור השתלת או בהזרקה.

1. עבור xenografting, תאים את הגידול מנותקים מן הכלים התרבות שלהם באמצעות טריפסין / EDTA ורחץ עם 10 כרכים של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) על מנת להסיר כל התקשורת שיורית, טריפסין, או EDTA.
2. עבור זריקה IV, תאים בתרבית מנותקים באמצעות פתרון nonenzymatic התא דיסוציאציה, ורחץ עם סרום ללא DMEM. ו)
3. תאים נספרים עם hemacytometer ו resuspended ב PBS ב 1-40 תאים / מ"ל ​​עבור השתלת, או לחילופין resuspended ב 1 מיליון תאים / מ"ל ​​להזרקה IV בסרום ללא DMEM.

4. השתלת תאים סרטניים אל CAM שנחשפו לאחרונה (גרורה ספונטנית)

1. הביצים יוסרו מן החממה ואת חלון קטן הוא חתך במיקום הכיכר נמשך בעבר שבו כיס אוויר חדש נוצר. הדבר נעשה בקלות עם כלי רוטרי מצויד גלגל חיתוך (כלי Dremel עם גלגל חיתוך עגול 409 #). צמד של מחט מלקחיים האף משמש כדי להסיר את קטע קטן של קליפת ולחשוף את CAM הבסיסית.
2. באמצעות מטוש צמר גפן שקצהו (מותג פישר # 23-400-001) CAM היא הכתה 5 פעמים. קצת דם צריך להיות ברור על הכותנה. מיד לאחר פגיעה CAM, 25μl ההשעיה התא ממוקם על שטח פגום. מספר אופטימלי של תאים הדואר נקבעmpirically אבל יכול לנוע בין ⁵ ל 0.5X10 1x10 ^6. החלון ביצה היא סגורה היטב עם קלטת האפרוחים נשארים עומדים במשך 10-15 דקות על מנת לאפשר לתאים להתיישב. לאחר 15 דקות הביצים מוחזרים החממה נייח.
3. גידולים מותר לגדול במשך 5-8 ימים בהתאם ליישום ספציפי ואת אופי של קו תאים סרטניים בשימוש. ראה איור 1 עבור תיאור רציף.

5. הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים (גרורות ניסויית)

1. באמצעות מד מזרק אינסולין 30 100μl ההשעיה תא מוזרק לתוך הווריד allantoic של העובר כל הביצים הוחזרו חממה נייח ונשאר שם במשך 1-7 ימים נוספים.
2. בנקודות זמן שונות, הריאות או CAM נמוך נקצרים מעובר כל מעובד לצורך זיהוי של תאים סרטניים, כמתואר להלן.

6. גידולים מסיק ורקמות חומוס

1. אזור לנתיחה מוכן. Assay מזהה תאים גרורתי על ידי לכימות DNA אנושי באמצעות גישה רגישה PCR. לכן חשוב מאוד על מנת למנוע זיהום חיצוני עם ה-DNA. והניתוחים מבוצעים בשטח ייעודי ברחבי והניתוחים הכלים מנקים בין כל חיה. על מנת למנוע זיהום צולבות של דגימות שלך לאורך כל תהליך לנתיחה 3 סטים נפרדים של כלים משמשים: קבוצה אחת לחיתוך את הביצה, סט אחד להסרת הגידול הראשוני ו סט אחד של הסרת איברים פנימיים. בנוסף, ארבעה מיכלי לשטוף משמשים רציפים שטיפה של כלים בין כל חיה. בתוך רצף שוטף אלה הם: 1) מים מזוקקים כפול, 2) מים מזוקקים פעמיים, 3) תמיסת כלור, ו 4) 70% אתנול.
2. הביצים יוסרו מן האינקובטור נייחים דגש על קרח במשך 15 דקות כדי להרדים ו להרדים את החיות. החלונות נפתחים כך הגידולים להיות גלוי. פתיחת חלונות גדולים יותר על ידי הסרת חלק קליפת הביצה עשוי להיות נחוץ. הגידולים העיקריים הם resected מ CAM, שקל, ומעובד היסטולוגיה.
3. חומוס יוסר קליפת הביצה על ידי חיתוך המעטפת רדיאלית לשני חצאים שווים. העובר הוא יצק מן הקליפה לחתוך והועברו צד השד נקי לשקול הסירה. היא חיה עם גזור באמצעות מערך טרי, נקי של כלים. חיה נפתח על ידי חיתוך דרך עצם החזה. לאחר העובר פתוח, חתיכת הכבד משני האונה הימנית או השמאלית נאסף. איברים פנימיים מוסרים לאחר מכן על ידי משיכת בעדינות על הוושט מחוברת קורקבן ועל קיצוץ visera המחברים את האיברים. על מנת לאסוף את הריאות לחתוך כלוב הצלעות הוא פתח את צלחת השד מופרדת ואת הלב מוסר. בשלב זה אפשר לחתוך סביב ארבעת הצדדים של הריאה (העליון הקרוב בראש הצד השמאלי לאורך כלוב הצלעות, החלק התחתון ליד הסרעפת בצד ימין לאורך קנה הנשימה). לשם עקביות, הריאות באותו נאסף כל חיה. דגימות רקמה שנקטפו מאוחסנים ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר או יכול להיות מעובד מיד לבידוד DNA.

7. בידוד DNA הגנום כמותי ניתוח PCR

1. הדנ"א הגנומי מופק באמצעות רקמות הירוק חלץ Sybr-N-Amp רקמות PCR Kit (סיגמא אולדריץ קטלוג # XNATRG). הדנ"א מופק ניתן להעביר צינור Eppendorf נקי המאוחסן -20 ° C או להשתמש מיד. חשוב לדלל את ה-DNA 1:50 במים nuclease חינם לפני השימוש בו בתגובת PCR הבאים. לחילופין, ה-DNA ניתן לחלץ באמצעות מספר כלשהו של תקן החילוץ פרוטוקולי ה-DNA (Zijlstra et al., 2002).
2. ה-DNA האנושי מתגלה ברקמות חומוס באמצעות PCR כמותי מסוים עבור האדם רצפי Alu. באמצעות PCR כמותי Alu ספציפי primers מתבצע באמצעות הגברה ירוק SYBR מתיק Exract-N-Amp. ערכת ה-PCR מגיעה עם תערובת תגובה 2x המכיל SYBR ירוק, חיץ, dNTPS מלחים, פולימראז תקי ואת נוגדן תקי Jumpstart. לערבב התגובה מורכב בכרך האחרון של 15μl, עם 0.4μM של כל פריימר. ברוב המקרים באמצעות DNA חילוץ בדילול 01:50 תספק נתונים כמותיים, לעומת זאת, כמות אופטימלית של ה-DNA עשויה התבנית צריך להיות מותאם באופן אמפירי. עוף primers GAPDH משמשים בקרה פנימית PCR היא לפעול תחת התנאים הבאים עבור רצפי Alu: הפעלת פולימראז על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואחריו 30 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 ש ', 63 ° C למשך 30 s. , 72 ° C למשך 30 s. תנאי תגובה עבור עוף GAPDH זהים לאלה המתוארים עבור Alu אולם ייתכן שיהיה צורך להרחיב את ה-PCR ל -40 מחזורים.
3. ניתוח כמותי של גרורות מתבצע בשיטת ΔΔCt השוואת קבוצות הניסוי לקבוצת הביקורת (Schmittgen ו Livak, 2008;. Zijlstra ואח', 2002). לחילופין עקומת סטנדרט ניתן להפיק באמצעות סדרה דילול של תאים סרטניים אנושיים חילוץ באמצעות חלץ-N-Amp Kit (Zijlstra et al., 2002). משמעות סטטיסטיים מוערך באמצעות Student T-test או ניתוח אנובה השליטה קבוצות הניסוי.

8. נציג תוצאות:

באיור 1. העובר עוף גרורות במודל. א) תרשים פאנל four הממחישות את המראה של הדגם חתך בבית שלבים עיקריים: 1. לאחר 10 ימי דגירה. CAM הגיע כמעט הגודל המרבי. העורקים והוורידים נראים בבירור עם הווריד Allantoic נגד ממוצבת העליון של הביצה. 2. הביצה מיד לאחר קידוח שני חורים קליפת הביצה: האחד לתוך airsac ואחד סמוך לנקודת ההתקשרות על הווריד allantoic. 3. המראה לאחר ואקום קל נעשה שימוש כדי לפנות את airsac ושחרר את CAM. תאים סרטניים (כחול) מוחלים CAM ירד. 4. לאחר המאפשר תאים סרטניים מורכבים לגדול, יחד עם הגידול והרקמות מעובר העוף נקצרים לניתוח B) תיאור סדרתי של המודל: 1.. דוגרים על הביצים., 2. סימון המיקום של הווריד allantoic., 3. קידוח חורים קליפת הביצה., 4. הפלת CAM., 5. חיתוך פתח השתלת תאים סרטניים., 6. יישום תאים סרטניים., 7. קירור את הביצים על הקרח לפני איסוף רקמות., 8. מסיק את הגידול לאחר 7 ימים של צמיחה.

איור 2. היסטולוגיה של גידולים CAM. רקמות שנלקחו קרום נושאות הגידול chorioallantoic נקבע בפורמלין, מחולק ומעובד עם כתם trichrome. א) HEp3 הגידול לאחר שבעה ימים של צמיחה על CAM. B ו-C להראות אזורים מוגדל מן stroma הן הגידול מראה. ד) הנורמלים CAM.

איור 3. ניתוח האורך כמותי של גרורות. גרסאות עבור הראש קרצינומה HEp3 הצוואר עם היכולת גרורתי גבוה או נמוך (HEp3 M (גבוהה) ו HEp3 M (נמוכה) בהתאמה) נותחו על יכולתם להפיץ באמצעות Alu PCR. עשרת החיות נותחו בכל נקודת זמן למשך 7 ימים. דגימות אלה היו לכמת נגד עקומת סטנדרט והביע לאחר מכן כמו # cells/50mg רקמות.

איור 4. עיכוב של תאים גרורות ספונטנית חיות שטופלו 1A5 גרורות עיכוב נוגדן. גידולים שנוצרו באמצעות 5X10 ⁵ HEp3 תאים להחיל CAM היום-10 עוברים. שלושה ימים לאחר החלת תאים סרטניים במחצית חיות שטופלו נוגדן אנטי CD151 1A5. הריאות מן הגידול נושאות חיות נבצרו כעבור יומיים נתון כמותי בזמן אמת Alu PCR. כמותי לעומת זאת בזמן אמת PCR של chGAPDH שימש לאשר את קיומו של כמויות שוות ערך של הדנ"א הגנומי מארח (שיטת ΔΔCt שימש להשוות את שתי הקבוצות כמותית (B).

איור 5. הערכת מעצר, צמיחה, intravasation במפל גרורתי. ביסודו של דבר, גרורות לאיבר משנית מוגדרת על ידי תרומות של שלושה היבטים: מעצר שיעור הצמיחה, שיעור intravasation. אלה ניתן לכמת באמצעות שילוב של גרורות ניסיוני (א) ו גרורות ספונטנית (B). שימוש ניסיוני גרורות (א) מעצר מוגדר כמספר התא זוהה הזרקת הודעה 2hr. הישרדות וצמיחה של תאים נעצר נקבע השינוי במספר הזרקת תא שלאחר 24 שעות ביממה. צמיחה מוגדרת בשיעור של התפשטות בימים 3-7. Intravasation נקבעת באמצעות גרורות ספונטנית (ב) שבו מספר תאים intravasated מוגדר להציג את הנטל גרורתי ביום 7 העולה על הערך החזוי על ידי צמיחה של הנטל גרורתי להציג ביום 6.

איור 6. הרחבת חזותי של גרורתי CAM. HEp3 תאים להביע GFP היו מוזרק לווריד על 12 יום התפתחותית. ב 1 יום, 3 ו 5 ביצה הוקרב וקטע CAM היה צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. על רקע ירוק כהה נוצר על ידי קליפת הביצה, vasculature גלוי כקווים שחורים, ועל תאים סרטניים נראים כמו כתמים ירוקים בהירים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

CAM חומוס שימש במשך עשרות שנים כמודל למערכת ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה בסרטן גרורתי התקדמות. הערכה עקרון היכולות גרורתי בוצעו במודל זה על ידי מגוון של קבוצות, כולל ניתוח של תרדמת (אגירה Ghiso et al, 1999;. Ossowski ו רייך, 1983), שיפוץ רקמות (Deryugina et al, 2005;. האן-Dantona . et al,<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
1X Dulbecco של הנשר השתנה בינוני (DMEM)	Invitrogen	11995073
של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים (D-PBS) (1X), נוזל	Invitrogen	14190250	pH 7.4
טריפסין, 0.05% (1X) עם EDTA 4Na, נוזל	Invitrogen	25300054
ספורטסמן האצ'	ברי היל	1550HA	חממות אלה הם חלק הכי זמינים. עם זאת, וידאו תציג ציוד שונים.
ספורטסמן חממה	ברי היל	1502EA
Dremel רוטרי כלי	Dremel
Dremel גלגלי החיתוך לא. 36	Dremel	409
סיוע Portable פיפטה	דיג	1368115E
כותנה והרים קלות Applicators	דיג	23-400-001)
ביצים מופרות	שונים		הספק שונים רבים יכולים לשמש. ביצים צריכות להיות כ 35-55 גרם. תרנגולות מניח כי אותם צריך להיות בין 36 לבין 55 שבועות.
Hemocytometer	האוסר מדעי, VWR	15170-090
סיבים אופטיים מיקרוסקופ המאייר	Amscope	HL250-AY	150W
25 מחט מד
Sybr הירוק חלץ-N-Amp רקמות PCR Kit	סיגמא אולדריץ	XNATRG