מעקבים שפעת העופות FTA עם כרטיסי: שיטות שדה, biosafety, וסוגיות התחבורה נפתר

Summary

שיטה לשמר, לזהות רצף הרנ"א מפני וירוסים שפעת העופות היה תוקף המורחבת באמצעות דגימות צואה טבעיים ציפורים. טכניקה זו מסירה את הצורך של שמירה על שרשרת מגניב וטיפול וירוסים זיהומיות ניתן ליישם תוכנית ההתקנה של תפוקה גבוהה 96-היטב.

Abstract

נגיפי שפעת העופות (AIVs) להדביק יונקים רבים, כולל בני אדם ^1. AIVs אלה הם מגוונים המארחים הטבעי שלהם, מחסה כמעט את כל תת ויראלי אפשרי ^2. מגיפות שפעת במקור של האדם נובעות AIVs ^3. במקרים רבים אדם קטלנית במהלך התפרצויות H5N1 בשנים האחרונות דווחו. באחרונה זן חדש AIV הקשורות ששטפו את האוכלוסייה האנושית, גרימת ⁴ של מגיפת שפעת החזירים ". למרות סחר אנושי פעילות התחבורה שנראה אחראי להתפשטות של זנים פתוגניים מאוד ^5, הפיזור יכול גם לייחס בחלקו ציפורי בר ^{6, 7.} עם זאת, המאגר בפועל של כל זני AIV הוא ציפורי בר.

בתגובה זו מול הפסדים מסחרי חמורה בענף העופות, תוכניות מעקב גדול יושמו ברחבי העולם כדי לאסוף מידע על האקולוגיה של AIVs, ולהתקין מערכות התרעה לגילוי זנים פתוגניים מסוימים מאוד ^8-12. שיטות מסורתיות דורשות virological וירוסים להיות שלמים מעובדים לפני ניתוח. זה מחייב רשתות קר מחמירים עם מקפיאים עמוק וכבד נהלים biosafety להיות במקום במהלך ההובלה. מעקב לטווח ארוך ולכן הוא מוגבל בדרך כלל תחנות בשדה כמה קרוב במעבדות מצוידות היטב. באזורים מרוחקים ולא ניתן שנדגמו אלא הליכים מסורבלים מבחינה לוגיסטית מיושמים. בעיות אלה הוכרו ^{13, 14} והשימוש אחסון חלופי ואסטרטגיות תחבורה נחקר (כהלים או guanidine) ^15-17. לאחרונה, הציג קראוס ואח'. ¹⁸ שיטה לאסוף, לאגור ולהעביר דגימות AIV, המבוסס על נייר מסנן מיוחד. FTA כרטיסים ¹⁹ לשמר RNA על בסיס אחסון יבש ²⁰ ו לדקלם פתוגנים פעיל במגע ^21. מחקר זה הראה כי כרטיסי FTA יכול לשמש כדי לזהות AIV רנ"א הפוכה שעתוק PCR וכי cDNA וכתוצאה מכך יכול להיות רצף גנים וירוס ונחוש.

במחקר של קראוס ואח'. ¹⁸ מעבדה לבודד של AIV היה בשימוש, דגימות טופלו בנפרד. בשנת ההארכה שהוצגו כאן, דגימות צואה מן ציפורי בר ממלכודת ברווז על ציפור Ottenby במצפה (SE שוודיה) נבדקו ישירות כדי להמחיש את התועלת של שיטות בתנאי שדה. לתפוס ברווזים אוסף מדגם ידי דגימות ביוב מודגם. פרוטוקול הנוכחית כוללת למעלה דרוג של זרימת עבודה מתוך טיפול צינור אחד לעצב 96-היטב. למרות רגיש פחות מאשר שיטות מסורתיות, שיטת FTA כרטיסי מספק תוספת מצוינת תוכניות מעקב גדולים. היא מאפשרת איסוף וניתוח של דגימות מכל מקום בעולם, ללא צורך בשמירה על שרשרת מגניב או תקנות הבטיחות לגבי משלוח של חומרים כימיים מסוכנים, כגון אלכוהול או guanidine.

Protocol

1. ברווז השמנה סחיטה ביוב

1. מלכודת שכשוך ברווזים של אנס הסוג (או ציפורים אחרות) בכלוב ידי משיכת אותם עם ברווזים לפתות או מזון, והכניס אותם לתוך קופסאות לוח הפרט כרטיס. זמן תחבורה בתיבת צריכה להיות מינימלית, למשל, על ידי התקנת תחנת השדה במרחק קצר אל המלכודת. בנסיבות לוגיסטיים עשויים להשתנות במחקר זה. העצה ואישור של החיה הרלוונטית ועדת האתיקה צריכה להיות חיפשו כל חדש הגדרת. לחלופין, גם צייד הציפורים נורו ניתן שנדגמו.
2. קח את הברווז של התיבה על ידי החזקת כנפיו הדוקה לגוף שלה. לדוגמא הטלת טרי, אשר יהיה נוכח ברוב המקרים, ישירות מהחלק התחתון של התיבה. לאסוף אותם עם ספוגית סטרילית וליישם את נוזל לכרטיס Whatman FTA. אם לא, לבצע שטיפת ביוב.
3. הפעל את הברווז על גבו. זה מאפשר גישה אל הביב ומקל הדגימה. הביב הוא מבנה בולט ממוקם מתחת בבטן, קרוב לבסיס הזנב. אדם מנוסה יכול להחזיק המדגם ציפור באותו זמן, או אחר אדם נוסף יכול לסייע.
4. בזהירות להכניס פלסטיק סטרילית זהורית ספוגית (קופאן, איטליה) כ 1 ס"מ וליצור מערבולת עדינה של הביב. מגלגלים את ספוגית עם הנוזלים מן הביב על פני השטח של כרטיס Whatman FTA. שחרור מיידי לאחר שבוצעה דגימה של החיה רצוי.
5. יבש את הקלפים FTA בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 1, אז כל חנות בנפרד מדגם בשקיות נייר (מעטפות, לדוגמה). אחסון אפשרי בטמפרטורת החדר, אולי עם חרוזי סיליקה באקלים לח. שליחה וקבלה של biosafety "מוסדות קצינים יכולים להרשות לשלוח כרטיסי FTA בדואר רגיל, שכן פתוגנים הופכים פעיל במגע עם המשטח כרטיס FTA.

2. בידוד נגיפי RNA

1. חלץ את החומר כרטיס FTA כולל צואה / נוזל ביוב. Punch שלוש דיסקיות עם אגרופן האריס 2 מ"מ במקום כל אלה לתוך באר של צלחת חינם 96well RNase. בין כל דגימה חדשה, לנקות את אגרופן בזהירות עם אלכוהול דיוק קים לנגב (Kimtech). השתמש תמיד שולט חיוביים ושליליים. פקד חיובית יכולה להיות מורכבת זן מעבדה להחיל טרי לכרטיס FTA, או מדגם טבעי שהוא יודע להניב תוצאה חיובית. כפי בקרה שלילית, אגרוף החוצה דיסקים מכרטיס FTA ריק. בנוסף, לעזוב נוסף חינם גם עבור פקד ה-PCR בהמשך הניסוי שלך (עם המים כתבנית).
2. הוסף 70μl RNA פתרון מהיר החילוץ (Ambion) וחום חותם את הצלחת (AbGene Thermo-אוטם). דגירה 5 דקות על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר במהירות נקבע כי אינו גורם לשפוך מעל (זה תלוי את המודל המשמש צלחת שייקר; בדיקה מראש).
3. Carry ויראלי בידוד RNA על פי פרוטוקולים של היצרן עם MagMAX-96 נגיפי RNA ערכת בידוד (Ambion). בקיצור: הוסף 130μl מוכן תמוגה / פתרון מחייב (מ בערכה) היטב כל אחד. העברת 50μl חילוץ חומר FTA כרטיס היטב כל אחד. Shake צלחת דקה 1.
4. הוסף 20μl לערבב חרוז מוכן (מ בערכה) לדגום כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. תלחצו על מהירות נחוש במשך 5 דקות. מולקולות רנ"א יהיה לאגד את חרוזים מגנטיים.
5. הזז את צלחת מגנטי 96-היטב לעמוד כדי ללכוד את החרוזים. בהתאם לדגם של מעמד מגנטי בשימוש, זה יכול לקחת יותר מ 5 דקות. כאשר הפתרון הפך ברור לחלוטין, להסיר ולסלק supernatant. ואז להסיר את צלחת מדוכן מגנטי.
6. שטפו את החרוזים פעמיים עם פתרון לרחוץ 1 ופעמיים עם פתרון לשטוף 2 (מ בערכה). עבור כל אחד 4 שלבים לשטוף להוסיף לשטוף 150μl פתרון מוכן מדגם זה, ללחוץ במשך דקה 1 על מהירות נחוש, לעבור את הצלחת לעמוד המגנטי, ללכוד חרוזים כ -5 דקות (או עד הפתרון הוא ברור לחלוטין), הסר להשליך את supernatant. ואז להסיר את צלחת מדוכן מגנטי, להוסיף את הפתרון לשטוף הבא, ולבצע את הצעדים כביסה כמו בעבר. לאחר שלב הכביסה האחרון, להסיר פתרון לשטוף כמה שיותר אוויר יבש החרוזים בטמפרטורת החדר ב שייקר צלחת במשך 2 דקות.
7. הוסף 50μl של חיץ elution (מ בערכה) לשחרר RNA מן החרוזים ולנער במשך 4 דקות על שייקר צלחת. לכידת חרוזים כפי שתואר לעיל. Supernatant כרגע המכיל את הרנ"א מבודדים אשר מוכן יישומים במורד הזרם.

3. RT-PCR של מטריקס AIV ג'ין

ביצוע PCR שעתוק הפוך (RT-PCR) עם One-Step RT-PCR גישה למערכת (Promega) ב 25 תגובות μl (מנוכה מן קראוס ואח' ¹⁸ ו Fouchier ואח' ^22..):

Nuclease מים חינם	1.5μl
AMV / Tfl5 חיץ	5μl
dNTPs	0.5μl
פריימר M52C 22 (10 מיקרומטר)	2.5μl
פריימר M253R 22 (10 מיקרומטר)	2.5μl
MgSO 4 (25 מ"מ)	7μl
AMV הפוך transcriptase (5u/μl)	0.5μl
פולימראז TFL (5u/μl)	0.5μl
רנ"א מדגם	5μl

תנאי ה-PCR ב T1 Biometra thermocycler הם: שעתוק לאחור הראשונית של 45 דקות 45 ° C, ואחריו denaturation 2 דקות הראשונית ב 94 ° C ו 40 מחזורים של: 94 ° C עבור 1 דקה, 56 ° C למשך דקה 1, 68 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. התארכות נוסף 7 דקות 68 ° C מסכם את ההגברה.

4. הקרנת עבור AI חיובי דוגמאות וטיהור של קטעים מתוך ממוקד ג'ל

1. טען 2μl של המוצר PCR מעורבב עם צבע 2μl טעינת 5x (BioRad) ומים 6μl על 1% agarose ג'ל (Roche) מוכתם ברומיד ethidium 1% (2.5μl לכל ג'ל מ"ל 100) להקרנה מראש.
2. הרץ את הג'ל שעה 1 ב 120V, יחד עם תקן ה-DNA גודל (עומס BioRad EZ 100 סולם bp), לדמיין עם מערכת תיעוד ג'ל. ראה דוגמה באיור 1.
3. בחר דגימות עם שברי מוגבר בטווח גודל הצפוי (בין 200 נ"ב ל -300 נ"ב (שבר היעד הוא 244 נקודות בסיס). טעינת נפח תגובה כל PCR (מתוכם ~ 23μl נותרים) של מועמדים אלה עם צבע 6μl טעינת 5x על 2 ethidium ברומיד% מוכתם agarose ג'ל ולהפעיל למשך 2 שעות.
4. מניחים את הג'ל על transilluminator-UV (Bioblock מדעי) ובחן ויזואלית. ראה דוגמה באיור 2. להקות והבלו הגודל הנכון של ג'ל עם אזמל והניח לתוך צינורות בודדים 1.5 תגובה מ"ל. לטהר שברי מן ג'ל, למשל עם השחזור Zymoclean ג'ל DNA Kit (Zymo מחקר).

5. סידור וזיהוי של PCR מוצרים

1. ביצוע סנגר רצף של שברי היעד, למשל על ברצף ABI 3730 נימי עם ABI ביג דיי 3.1 כימיה (Applied Biosystems). הכן התגובות ברצף בכמויות 10μl המכיל 10-20 ng ג'ל מטוהרים cDNA תבנית, דילול 1.75μl 5x חיץ, 0.5μl ביג premix דיי v3.1, 1 פריימר קדימה μl (M52C ^20, 10 מ"מ), ו ddH2O. תנאי רכיבה על אופניים הם: 1 denaturation דקות הראשונית, ואחריו 25 מחזורים של: 10 שניות על 96 מעלות צלזיוס, 5 ים ב 45 ° C ו 4 דק 'ב 60 ° C. לטהר ולהכין את התגובה סידור לפי פרוטוקולים פנימיים שלך.
2. זיהוי וכתוצאה מכך רצפי cDNA מול מסדי נתונים נוקלאוטיד כגון GenBank23, למשל על ידי כלים מבוססי אינטרנט כגון תפציץ במרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (צמח השדה, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).

6. נציג תוצאות:

מולארד (אנס platyrhynchos) נדגמו על Ottenby Bird Observatory בדצמבר 2007. מתוך כל ברכייה מדגם על FTA כרטיס נלקח כמתואר בפרוטוקול זה. לאחר המשלוח, הקלפים FTA נשמרו במקפיא ב -20 ° C למשך שנתיים. המדגם אותו כרטיס FTA המעבדה לבודד נבדק קראוס ואח'. ¹⁸ נכלל כביקורת חיובית, כמו גם תשעה דילולים סדרתי פי עשרה מזה. שני פקדים היו שליליות i) מיצוי מכרטיס FTA ריקה, כדי לבחון אם יש לשאת מעל מ אגרופן, ואת ii) RT-PCR תגובה שבה מים nuclease חינם שימש כתבנית, כדי לבדוק אם הזיהום התרחשו במהלך, או כהכנה התגובה PCR.

84 דגימות נותחו. תמונה ג'ל של מוצרי ה-PCR מתוך 84 דגימות אלה ניתן למצוא באיור 1. ממדגמים טבעי מספר רב של להקות נוקבים ניתן לצפות בשל נוכחותם של זיהומים חיידקים שונים הצואה. עם זאת, שבר היעד של הצמד פריימר הוא 244 נ"ב ארוך. נפח כולו PCR-תגובת משנה של דגימות שהפיקה שברי בטווח של כ הגודל הנכון (בין 200 נ"ב ל -300 נ"ב) הועמס על ג'ל (איור 1). איור של איזה להקות קוצצו מן הג'ל ניתן למצוא באיור משלים 1. בנוסף שליטה חיובית, שניים דגימות אלה (69,899 ו 69,912) היו חיוביות ידי פרוטוקול חדש. חיפוש תפציץ נגד באתר צמח השדה נוקלאוטיד חשפה את זהותם כמו AI מטריצה ​​גן (איור 3), בעוד כל הלהקות האחרות דמה רצפים חיידקי צמוד ביותר, או לא הניב רצף קריא בכלל.

באיור 1. ג'ל תמונה של סינון ראשוני של מוצרי ה-PCR. 2 μl מוצר ה-PCR חיובי של שליטה, שלדילולים erial שליטה חיובית, שני פקדים שלילית 84 דגימות ביוב הועמסו. 48 דגימות מוצגים בלוח ג'ל העליון, 48 דגימות בלוח התחתון. החיצים האדומים מציינים נתיבים ג'ל המשמש 100 רגיל בגודל bp-DNA. לצורך המחשה, עיגולים אדומים להראות להקות טווח הגודל המצופה. חוגים כחול עולה amplicon נוקבים (למעלה משמאל) או דימר פריימר artefact להלן 100 נ"ב בגודל (מימין למטה).

איור 2. דוגמאות מבחר דוגמאות עם שברי בטווח הגודל הנכון. עם להקות בין 200 נ"ב ל -300 נ"ב (שבר יעד 244 נ"ב) נבחרו. החץ הירוק מצביע על שליטה חיובית, שני החצים האדומים מצביעים על דגימות אשר אושרו להיות חיוביים AIV ידי השוואת רצפי cDNA שלהם באתר צמח השדה נוקלאוטיד.

איור 3. לכידת מסך של חיפוש פיצוץ היציג באותו צמח השדה. אחד רצפי cDNA שהתקבלו שברי נכרת היה שאילתה מול מסד הנתונים של נוקלאוטיד באתר צמח השדה. המדגם מזוהה כהלכה כמו שבר גן מטריקס AI. כדי לצפות בגרסה בגודל מלא של תמונה זו, לחץ כאן.

איור משלים S1. להקות של דגימות נבחר נכרת מן ג'ל. תמונה זו נלקח הג'ל מתואר באיור 1 אחרי להקות מועמד בין 200 נ"ב ל -300 נ"ב נחתכו החוצה.

Discussion

פרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה משלים מסך דגימות צואה או דומה לנוכחות של AIV. הוא תוכנן במיוחד כדי להפוך אוסף מדגם מהירה וקלה. זה מאפשר לאנשים מיומנים פחות, כמו ציידים או מנהלי טבע, לתרום מעקב AI. אין רשתות מגניב צריך להיות מיושם, למרות הקפאת דגימות מומלץ במידת האפשר. כמה ימים של בטמפרטורת החדר, למשל במהלך ההובלה למעבדה, לא היו בעיה של מולקולות RNA על כרטיסי FTA, כל עוד כרטיסים נותרו יבשות. אחרים ללא כוונת מקורר מערכות אחסון מוערכים כיום על ידי קהילת המחקר, כגון אלכוהול ¹⁵ או ¹⁶ guanidine, דורשים הסדרים משלוח מיוחד בשל אופיו מסוכנים שלהם. לעומת זאת, השיטה כרטיס FTA אינו מחייב משלוח של חומרים מסוכנים. עם זאת, אחר בינוני אחסון מעניין בהקשר זה הוא RNAlater ™ זה לא מסוכן, או ^17. ניתוח לדוגמה יכול להתבצע במעבדה כל מולקולרי רגיל. אין ציוד מיוחד אחר מאשר כרגיל PCR תגובות וסדר נימי היה צורך. כל השלבים יכול להתבצע ללא רמה biosafety כי כבר אוסף המדגם סוכני פתוגניים פוטנציאל היו מומת על ידי פעילות נגד חיידקים נגיפים של כרטיס FTA.

חוצה זיהום ובעקבות דגימות חיוביות כוזבות לא נצפו בניסויים שלנו עם דגימות צפור פראית. עם זאת, כאשר עובדים עם RNA ו-PCR זה תמיד רצוי להקדיש תשומת לב מיוחדת לנקות מקומות עבודה בחדרים נפרדים עבור שלבים לפני ואחרי-PCR. עבודה במנדף עשן מקטין את הסיכון של זיהום אירוסול במעבדה. Pipetting צריך להתבצע עם טיפים הסינון.

ממחקר קודם על דגימות שנלקחו בעת ובעונה אחת מן ברווזים אותו אנו יודעים כי שישה מתוך 84 דגימות היו חיוביות ידי RealTime המסורתי RT-PCR שיטה ²⁴ והערכים Ct מ RealTime RT-PCR ידועים. שתי דגימות חיוביות זוהה על ידי גזע השיטה שלנו ברווזים שהיו ערכים Ct <30 (המעיד על ריכוז גבוה של רנ"א נגיפי). ארבע הדוגמאות האחרות אשר היו חיוביות עם פרוטוקול המסורתי היו לערכים Ct> 30 (מרוכז פחות) לא יכול להיות מזוהים על ידי פרוטוקול שלנו.

דגימות נגיף רק עם titers גבוהה יחסית היו חיוביות assay שלנו, סביר להניח כי הרגישות של השיטה היה מקור הכישלון כדי לזהות את כל דגימות חיוביות. יתר על כן, גודל המדגם במחקר הנוכחי היה נמוך מאוד ואת השיטה ניתן לפתח לחלוטין להעריך אם ניסויים מבוקרים יותר קפדני מתבצעות. עם זאת, אם אלה היו דוגמאות שנאספו באזור מרוחק, ניתוח מסורתי לא היה אפשרי בכלל. בנוסף, אלה התוצאות הראשונות נובעות ניסויי פיילוט אשר צריך אופטימיזציה נוספת. תקופה של שנתיים אחסון בתוך מקפיא רגיל -20 ° C לאחר איסוף דגימת כנראה השפיע גם על האיכות של רנ"א נגיפי. זו השפלה אפשרי RNA הוא נושא חשוב בהתמודדות עם אחסון בטמפרטורת חדר של וירוסים מומת. דוגמאות מאוחסנים נוזלים חלופה כאמור סובלים השפלה משמעותי אשר משפיע על ניתוח מותח יותר של הגנום הויראלי ^16. אמנם לא נבדק במחקר שלנו, כרטיסי FTA הוכיחו להיות מתאים גם כדי לשמור על שלמות מולקולות RNA אחרות מערכות רנ"א דומים מאוד נגיפי שפעת העופות ^{25, 26.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב או מכשיר	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
פלסטיק זהורית יבש ספוגית	קופאן, איטליה	167KS01
כרטיס FTA	Whatman		כמה אפשרויות
האריס מיקרו אגרוף 2mm עם מחצלת	Whatman	1154409
RNase חינם 96well צלחת	גריינר Bio-One	652290	או דומה
קים דיוק מגבונים	Kimtech	75512
RNA פתרון מהיר החילוץ	Ambion	AM9775
MagMAX-96 ערכת בידוד נגיפי	Ambion	AM1836
One-Step RT-PCR גישה למערכת	Promega	A1250	או דומה
Agarose MP	רוש	1388991001	רב תכליתי agarose
טעינת 5x חיץ	BioRad		נמסר עם סולם DNA
EZ 100 נ"ב לטעון סולם	BioRad	170-8353	או דומה
Ethidium ברומיד 1%	Fluka	46067	או דומה
תגובה צינורות 1.5ml	Eppendorf		או דומה
Zymoclean ג'ל DNA התאוששות ערכת	Zymo מחקר	D4001	או דומה
ABI גדול לצבוע 3.1 כימיה	Applied Biosystems		או דומה