Method Article
נוזל הקשה הרוחב (LFP), מודל הוקמה של פגיעה מוחית טראומטית אצל עכברים, הוא הוכיח. LFP ממלא שלושת הקריטריונים העיקריים במודלים של בעלי חיים: התאמה, תוקף, אמינות קליני. ההליך המורכב craniotomy כירורגית, קיבעון של הרכזת ואחריו אינדוקציה של פגיעה, והתוצאה היא פגיעות מוקד ומפוזר, הוא תיאר.
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) יש תנופה מחודשת במחקר להשיג בשל המודעות הגוברת של פגיעות ראש, אשר התוצאה התחלואה והתמותה. בהתבסס על אופי הפגיעה העיקרית בעקבות התוצאה TBI, השלכות מורכבות משני הטרוגנית, אשר ואחריו 1,2 תהליכי ההתחדשות. פגיעה ראשונית יכול להיגרם על ידי contusion ישיר המוח מפני משבר בגולגולת או גז ומתיחות של עקירה רקמת המוח ולגרום עקב תנועה 3,4. המטומות וכתוצאה מכך, ופגיעות לגרום תגובה וסקולרית 3,5, והנזק מורפולוגית ופונקציונלית של החומר הלבן מוביל מפוזר פציעה axonal 6-8. שינויים נוספים משני נראית לרוב במוח הן בצקת לחץ תוך גולגולתי מוגבר 9. לאחר TBI יש שינויים מיקרוסקופיים הביוכימיים והפיזיולוגיים הכרוכים שחרור של נוירוטרנסמיטורים excitotoxic, מתווכים החיסונית רדיקלים 10-12, אשר בסופו של דבר התוצאה לטווח ארוך לקויות נוירולוגיות 13,14. לכן בחירת במודלים של בעלי חיים מתאים של TBI כי נוכח האירועים תאית ומולקולרית דומה TBI האדם מכרסם הוא קריטי לחקר המנגנונים פגיעה ותיקון.
דגמים ניסיוניים שונים של TBI פותחו כדי לשחזר היבטים של TBI נצפתה אצל בני אדם, ביניהם שלושה דגמים ספציפיים המותאמים נרחב מכרסמים: כלי הקשה נוזל, השפעת קליפת המוח ושחרר / השפעה משקל האצת 1. המכשיר הקשה נוזל מייצר פציעה דרך craniectomy ידי החלת הדופק קצר הלחץ על הנוזל על הדורה ללא פגע. הדופק הוא נוצר על ידי מטוטלת בולט בוכנה מאגר של נוזלים. הקשה מייצר תזוזה קצרה דפורמציה של רקמה עצבית 1,15. לעומת זאת, פגיעה בקליפת המוח השפעה מספקת אנרגיה מכנית על הדורה שלם באמצעות impactor נוקשה תחת לחץ פנאומטי 16,17. המודל ירידה / השפעה במשקל מתאפיינת נפילת מוט בעל מסה מסוימת על הגולגולת סגורה 18. בין הדגמים TBI, LFP הוא המודל הוקמה הכי נפוץ להעריך במוח מעורבים פציעה מוקדי מפוזר 19. זה לשחזור, והוא טופל על מנת לאפשר מניפולציה של פרמטרים פציעה. LFP פציעות משחזר נצפתה בבני אדם, ובכך טיוח זה רלוונטיות קלינית, ומאפשר בדיקה של הרפוי הרומן לתרגום קליניים 20.
אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לביצוע הליך LFP בעכברים. הפגיעה גרמה היא קלה עד בינונית, עם אזורים במוח כמו ההיפוקמפוס, קליפת המוח ואת כפיס המוח להיות פגיעים ביותר. משימות למידה בהיפוקמפוס מנוע נחקרים הבאים LFP.
1. Craniectomy
2. אינדוקציה של פציעה
3. הערכה של המנוע, התוצאות קוגניטיביים היסטולוגית
4. נציג תוצאות:
הפגיעה הנגרמת על ידי המכשיר LFP ניתנת לשחזור מן החי מן החי, במיוחד עם הכשרה כירורגית מספיק. כדי לשמור על עקביות של הפגיעה, כמות הלחץ נשא את דורה על ידי המכשיר הוא במעקב. המטוטלת פוגעת מלא מים צילינדר אקרילי עם צינור בלחץ גבוה ו-Lok Luer הולם אשר מחובר לרכזת פציעה מודבקת באתר craniectomy על החיה (איור 1A). עבור פגיעה קלה עד בינונית, הזווית של המטוטלת נקבע כדי ליצור לחץ בטווח 0.9-2.1 atm ו אוסצילוסקופ מחוברים למגבר משמש כדי לחזות את הדופק לחץ (איור 1B). פגיעה מייצרת מגוון של ליישר פעמים רפלקס ואת התמותה הגוברים הקשורים בצקת ריאות. פציעה קלה נחשב זמן ליישר רפלקס מ 2 - 4 דקות ו 0 - שיעור התמותה של 5%. פגיעה מתונה נחשבת רפלקס ליישר זמן של 6 - 10 דקות ו 10 - שיעור התמותה 20%. יתר על כן, העכברים נתון LFP עשוי להפגין פוזה טוניק כי ניתן להצביע על התקף. תפיסה קשורה לעיתים קרובות עם הדורה בסכנה. ביחד, ממצאים אלה מראים כי הפגיעה היא גרימת נזק נוירולוגי. חיות שאם מחוברים למכשיר LFP אבל המטוטלת לא ישוחרר.
כדי להמחיש את הנזק הנגרם על ידי LFP, יש לנו לבצע immunocytochemistry באמצעות נוגדנים אשר מכירים האסטרוציטים ומקרופגים הן אלו סוגי תאים הקשורים בתגובה לפציעה. גליה חלבון Fibrillary חומציים (GFAP) מכתים מגלה דבקת מוגברת לאורך הקורטקס באזור הפציעה WHereas עכברים דמה אינם מציגים astrocytosis מוגברת באתר המקבילה מתחת craniectomy (איור 2 א ', ב). באופן דומה, MAC1 מכתים מדגים מקרופאגים יותר סביב האתר של פציעה לעומת עכברים נתון ניתוח הדמה. בנוסף, יש נזק פיזי לעיתים קרובות רקמת קליפת המוח לעין בעכברים נתון LFP אך לא דמה עכברים (איור 2 ג, ד).
בדיקות ההתנהגות הבאים LFP קלה ניתן להשתמש כדי להעריך את התוצאות הן קוגניטיבית ומוטורית. עם אמא משמש כדי לקבוע השפעות על למידה וזיכרון. באמצעות רמזים חזותיים בחדר בדיקות, עכברים דמה הפך במהירות יעילה יותר באיתור פלטפורמה עם כל יום של אימונים עוקבים במבוך מים. עכברים נתון LFP קלה להימשך זמן רב יותר כדי לאתר את פלטפורמת מוסתר על היומיים הראשונים של בדיקות דמה ביחס לעכברים, אבל אז מופיעים ללמוד את המשימה ביום השלישי (איור 3A). ממצאים אלה מראים כי הפגיעה מפחית את הקצב שבו העכברים יכולים לרכוש למידה מרחבית. כדי לקבוע את ההשפעה של הפגיעה על שימור זיכרון, במשפט מבוצעת בדיקה 1 יום אחרי האימון האחרון. עכברים שאם לבלות יותר זמן ברבע היעד לעומת העכברים נתון LFP קלה טוען כי הפציעה השפיעה על היכולת של העכברים לזכור את המיקום של איפה פלטפורמה המשמשת לישיבה (איור 3B). על מנת להעריך תפקוד של תנועה, עכברים נוסו על המכשיר rotarod. עכברים נתון LFP קלה יש החביון הממוצע קצר יותר ליפול לעומת העכברים דמה 1, 7 ו - 21 ימים שלאחר פציעה (dpi) (איור 3 ג). נתונים אלה מראים כי עכברים פצועים יש לקויי vestibulomotor משולבת פונקציה הסנסורית.
1. איור LFP המכשיר עקבות נציג אוסצילוסקופ המתקבל במהלך הפציעה. א) רכיבים של המכשיר LFP הם: המטוטלת קבוע לעמוד ולהגדיר בזווית קבועה מראש, כדי לספק את הכוח הרצוי, מים מלאים גליל אקרילי עם צינור בלחץ גבוה וכן ראוי זכר Luer-Lok המצורפת, מגבר, ו אוסצילוסקופ. ב) נציג שמץ של דופק לחץ אוסצילוסקופ. ערך שיא ל-השיא הוא 2.16 וולט המעיד על לחץ של atm 1.47.
איור 2. דבקת משופרת תגובה דלקתית LFP הבא מדגים את מידת הפציעה. סעיפים רוחבי קפואים (20μm) דרך המוח של עכבר נתון דמה ניתוח (A, C) או פציעה LFP (B, D) 7 ימים שלאחר פציעה (dpi). תמונות קליפתיים נלקחים במוקד craniectomy. (A, B) רקמה צבעונית עם נוגדן לזהות האסטרוציטים. גליה Fibrillary חומציים (GFAP) חלבון נוגדן (MAB360, Chemicon, 1:400) מגלה מספר גבוה יותר של האסטרוציטים ברחבי קליפת המוח של העכבר נתון פציעה LFP (חיצים) לעומת ניתוח הדמה. נוגדן הוא משני עז אנטי העכבר 594 (1:1000). (ג ד) רקמה צבעונית עם נוגדן לזהות מקרופאגים. MAC1 נוגדן (MAC1 אלפא השרשרת CD11b, BD Biosciences, 01:50) מגלה macrophges יותר ו / או מופעל microglia סביב האתר של פגיעה בקליפת המוח (חיצים) לעומת ניתוח הדמה. נוגדנים משני הוא עכברוש עז אנטי CY3 (01:50). בר סולם = 200μm ב A ו-B, 100μm ב C ו-D
איור 3. בדיקות ההתנהגות הבאים LFP קלה מדגים ליקויים נפצעו לעומת עכברים דמה. א) עכברים נתון LFP קלה להימשך זמן רב יותר ללמוד את המשימה של מציאת פלטפורמה עם אמא מאשר עכברים דמה. שאם לעומת LFP (שד 'שניות ± SEM) 1 יום 34.21 ± 3.02 לעומת 38.64 ± 2.63; 2 ביום 24.52 ± 2.84 לעומת 2.11 ± 27.21, יום 3 22.47 ± 2.00 לעומת 2.52 ± 22.08 (1 dpi, n = 9 דמה, 10 LFP) . ב) עכברים נתון LFP קל להשקיע פחות זמן ברבע היעד במהלך המשפט 24 שעות בדיקה לאחר האימון האחרון ביחס לעכברים עם אמא דמה (21 dpi, n = 10). ג) עכברים נתון LFP קל ליפול המכשיר rotarod מוקדם יותר מאשר עכברים דמה (1, 7, ו - 21 dpi, n = 5 מזויף, 8 LFP). ברים שגיאה מייצגים SE.
השיטה המוצגת כאן LFP דגמים רבים של התוצאות neuropathalogical והתנהגותיים של קל עד בינוני פגיעה מוחית טראומטית וזו הסיבה היא הפכה מודל החיה בשימוש נרחב של TBI. ישנם מספר שלבים קריטיים לשקול על מנת להגביר את תקפות ומהימנות של טכניקה זו. לדוגמה, חשוב כי בעלי החיים היחידים שבהם את היושרה של דורה לא נפגע במהלך craniectomy להיות חשוף LFP בשימוש במחקר. יתר על כן, אם הוא craniectomy occluded על ידי דבק או מלט כזה חלק הדורה מתחת craniectomy לא נחשף הכוח של לחץ הנוזלים, החיה יש לסלק מן המחקר. לבסוף, אם הזמן ליישר רפלקס או שיעור התמותה אינו בטווח הרצוי, החיה לא צריך להיות שנכללו במחקר. עוצמת הדופק הלחץ ניתן להגדיל ליצור פציעות חמורות יותר.
כפי שניתן לראות בתרשים 1, את התצורה של המכשיר LFP היא פשוטה יחסית, שחזור של מידת הפגיעה מתוחזק על ידי ניטור אטמוספרות הלחץ על אוסילוסקופ. הצורה חלקה של העקום על עקבות אוסצילוסקופ מציין כי אין בועות אוויר בנוזל שעשוי להפריע אינדוקציה הפגיעה LFP. בדיקת הדופק צריך להיות מועברת לפני גרימת פציעה ואם זכר אוסצילוסקופ אינו התערוכה עקומה חלקה, בועות אוויר להסירו. משך הדופק הוא כ 20 msec המייצגת את זמן הגיוס נמדד סימולציות מבחן ההתרסקות. פציעות של פולסים קצרים יותר עשויים לייצר פציעות מוקד יותר. לכן, זה משך מודלים הדופק האדם TBI.
שינויים מורפולוגיים הסלולר הבא LFP כוללות נזק פיזי לרקמות כמו גם מספר גדל של האסטרוציטים ומקרופגים כפי שמודגם באיור 2. היא מבוססת היטב כי אחד מסימני ההיכר של הפציעה היא היפרפלזיה של האסטרוציטים ויצירת צלקת גליה. הצלקת גליה הוכח יש גם השפעות חיוביות ופוגעות 24. באופן דומה, מקרופאגים ידועים להצטבר ברקמות שונות במהלך הפציעה לאחר שלב כאשר את תהליך הריפוי מתחיל 25. לפיכך, מספר גדל של GFAP ו MAC1 תאים חיובי דגימות LFP יחסי שולט דמה מעיד על אינדוקציה של פציעה. חוסר הביטוי של אלה סמנים ספציפיים התא שולט דמה עולה כי המניפולציות כירורגית לבד אין השלכות שליליות על בריאותם של רקמת המוח, וכי שינויים בביטוי חלבונים ספציפיים הפרדיגמה פציעה.
השלכות התנהגותיות של LFP קלה באיור 3 כוללים לבעיות קוגניטיביות ומוטוריות. הממצאים מצביעים על כך עם אמא עכברים LFP בסופו של דבר ללמוד את המשימה, אך בקצב איטי יותר מאשר עכברים מזויף והם לא זוכר את המשימה כמו גם יום אחד אחרי אימון. לכן, גם עכברים נפצעו המעטה הם פחות יעיל מאשר העכברים דמה בבית באמצעות רמזים חיצוניים לתהליך, לאחד ולאחסן מידע מרחבי, אשר חייב להאסף במהלך הבדיקה שלאחר מכן. אחרים בהיפוקמפוס תלויי משימות קוגניטיביות כגון תגובת פחד מותנה הוכחו להיפגע בעכברים נתון LFP 26. לבסוף, חביון קצר ליפול על ידי עכברים LFP ביחס לעכברים דמה של הפרדיגמה rotarod עד 3 שבועות בעקבות פציעה קלה הוא אינדיקטור של גירעונות vestibulomotor משולבת פונקציה הסנסורית. פגיעה מתונה יותר יחשוף שינויים בולט יותר בתפקוד הקוגניטיבי והמוטורי כפי שהוכח על ידי קבוצות אחרות 27-30.
לסיכום, LFP היא מודל תקף TBI אדם משום שהוא ממלא את הקריטריונים של רבים מהצפוי. LFP מספק תוקף לבנות בכך שהיא משחזרת את תהליכי האטיולוגית כי לגרום TBI בבני אדם. באופן ספציפי, את עוצמת הכוח ואת שיעור התמותה דומה לזו המתרחשת בספורט מתון מתון פציעות הקשורות מכונית עם אזהרה כי מראש פגיעה התערבויות כירורגיות ייחודיים המודל החי. LFP גם מפגין תוקף פנים כי משחזר LFP רבים אנטומי, השפעות ביוכימיות neuropathological והתנהגותיים שנצפתה TBI האדם. ישנם שני שינויים מוקד ומפוזר זוהה לאחר LFP ואת lateralization ההשפעה מאפשר להשוות את הנזק מורפולוגיים בצד ipsilateral לפגיעה לזה בצד הנגדי. אזהרה אחת היא כי השפעות קוגניטיביות המנוע יכול להיות עדין יותר כתוצאה של פגיעה באונה אחת בלבד. לבסוף, מוצגים LFP תוקף ניבוי ואת האמינות של הטכניקה LFP מאפשר הערכה של מניפולציות גנטיות שונות תרופתי לפני או אחרי הגיוס של פגיעה 20. משתנים פיסיולוגיים כמו לחץ דם, חומציות דם לדםגזי יהיה צורך למדוד את נוכחות והיעדרות של התרופה מבחן כדי לקבוע את מנגנון הפעולה של הסוכן טיפולית. עם זאת, בשל האופי המורכב של ההשלכות הראשוני והמשני של TBI, היא משימה קשה לזהות התערבות יחיד שיכול להקל על כל הסימפטומים.
שיקול עתיד טכניקה LFP ניתן להשתמש הקשה מיקרו נוזל המעסיקה מעבד מבוקר, מכשיר מונע פניאומטית כדי לבטל את הצורך בכיול הכוח מועברים על ידי המטוטלת ולהימנע משתנים תפעוליים כגון בועות אוויר בנוזל 15 . עם זאת, הגישה LFP תקן הוכח על ידי חוקרים רבים להיות טכניקה אמין ופשוט לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס נזק והתאוששות הבאים TBI שיוביל התערבויות ותרופות טוב יותר.
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
עבודה זו ממומנת על ידי ניו ג'רזי ועדת המחקר פגיעה מוחית.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved