במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

Summary

הקרנית היא ייחודית בכך שהיא חסרה רקמות כלי הדם. עם זאת, כלי דם חזקים צמיחה והישרדות יכול להיגרם על הקרנית על ידי גורמים angiogenic עוצמה. לכן, הקרנית יכול לספק לנו עם כלי רב ערך עבור מחקרים angiogenic. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע את המודל של העכבר assay הקרנית כיס וכיצד להעריך את אנגיוגנזה המושרית על ידי גורמים angiogenic באמצעות המודל הזה.

Abstract

קרנית נורמלית ברורה של רקמות כלי הדם. עם זאת, כלי הדם יכול להיגרם לגדול לשרוד הקרנית כאשר גורמים angiogenic חזק מנוהלים ^1. הייחוד הזה הפך את הכיס הקרנית assay אחד המודלים הנפוצים ביותר ללימודי אנגיוגנזה. קרנית מלחינה מספר שכבות של תאים. לפיכך, ניתן להטביע גלולה המכילה את גורם angiogenic עניין הקרנית לחקור השפעה angiogenic שלה ^2,3. כאן, אנו מספקים צעד אחר צעד הפגנה של איך (אני) לייצר את גורם המכילים angiogenic גלולה (II) להטביע את הכדור לתוך הקרנית (III) לנתח את אנגיוגנזה הנגרמת על ידי גורם angiogenic של עניין. מאז פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF) ידוע בתור אחד הגורמים החזקים ביותר angiogenic ^4, הוא משמש כאן כדי לגרום אנגיוגנזה בתוך הקרנית.

Protocol

כל ציוד ריאגנטים בהם נעשה שימוש הם עקרים. פרוטוקול שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (ACUC) בשעה ניי / NIH (פרוטוקול המחקר בבעלי חיים ניי-553), וכן בוצע על פי הנחיות NIH והתקנות.

1. הפקת angiogenic גורם המכילים כדוריות

בחלק זה, כדורי המכיל את גורם angiogenic עניין מוכנים.

1. הפוך את 10% (w / v) פתרון sucralfate עם PBS. חנות מתחת לטמפרטורת החדר.
2. הפוך את 12% (w / v) poly-המה עם אתנול אבסולוטי. חנות מתחת לטמפרטורת החדר.
3. ודא 1 מיקרוגרם / פתרון bFGF μl. חנות ב -80 ° C.
4. כדי להפוך את 50 כדורי, לערבב 5 μl של poly-המה, 1μl של sucralfate ו 4 μl של פתרון מניות bFGF, מערבולת ביסודיות.
5. מניחים פיסת parafilm נקי בצלחת פטרי, לחשוף אותו תחת אור UV במשך 15 דקות במנדף בתרבית רקמה. Drop 0.2 μl של התערובת פתרון parafilm אחת גלולה. לפיכך, 10 μl של התערובת צריך פתרון תשואה 50 כדורי. בואו כדורי יבש בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. כדורי יבשים ניתן לאחסן 4 מעלות במשך כמה ימים, או -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
6. לאחר השימוש, לחלץ ולאסוף את כדורי בקצות בזוג מלקחיים. היזהרו מאוד לא לשבור אותם או להפוך אותם באביב משם.

2. ביצוע הקרנית עכבר assay כיס

בחלק זה, נדגים כיצד להכין כיס בתוך הקרנית העכבר כיצד להוסיף גלולה לכיס. גורם angiogenic הכלול גלולה ישוחררו בהדרגה והסביבה של הקרנית (איור 1). בהפגנה זו, אנו משתמשים 8 שבועות הנקבה C57/Bl6 עכברים.

1. העכבר הוא עמוק בהרדמה שיטתי בתערובת של קטמין (75 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (5mg/kg, הזרקת ip). זה ימשיך את העכבר תחת הרדמה מדינה דקות 30-60. הרדמה מקומית (0.5% proparacaine HCl) על הקרנית. לאחר 5 דקות, לתקן עין אחת תחת מיקרוסקופ לנתח.
2. חתך עדין מאוד מורכב באמצע של 1.2 מ"מ -1.4 קרנית מן לימבוס הקרנית (כפי שמוצג באיור 1) עם סכין גרפה קטרקט פון. היזהרו מאוד לא לחתוך הקרנית.
3. כיס עשוי מתחת לשכבת האפיתל של הקרנית על ידי החדרת אופקית את הסכין באמצע הקרנית ולהרחיב את הסכין לעבר בזהירות לימבוס (תמונה 1). גודלו של כיס צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל גורם אחד המכיל angiogenic גלולה. היזהרו מאוד לא לנקב דרך הקרנית.
4. הכנס גלולה עם זוג מלקחיים לכיס לאט. נסו להפוך את גלולה ישר ככל הניתן.
5. לאחר ההשתלה של גלולה, משחה אנטיביוטית אקטואלי עיניים מוחל על העין. מכשירים הם ניגב עם רפידות אלכוהול 70% בין בעלי חיים.
6. הזז את העכבר לאזור חם ויבש ולנטר אותו, עד שהוא מסוגל לשמור על יציבה זקופה, ואז להחזיר אותו בכלוב בבית שלה. משככי כאבים מערכתית (למשל, עצירות, 2 מ"ג / ק"ג, הזרקת IP) משחה אנטיביוטית מקומית (למשל גנטמיצין) ניתנות פעמיים ביום למשך 2 ימים לאחר הניתוח והעכבר הוא פיקוח הדוק במשך 3 ימים. ריפוי צפויה להשלים בתוך 48 השעות הראשונות שלאחר הניתוח. העין עם הכיס תיבחן תחת בהיקף biomicro מנורת סדק בין 4-10 ימים לאחר ההשתלה גלולה.

3. נציג תוצאות

1. שבעה ימים לאחר ההשתלה גלולה, העכבר הוא הרדים מערכתית ו topically כמתואר 2.1.
2. שים לב כלי דם בקרנית הנגרמת על ידי גורם angiogenic תחת מיקרוסקופ לנתח. ב הקרנית שטופלו רכב, צמיחה אין כלי דם ניתן לראות (איור 2A, רכב שטופלו הקרנית). ב הקרנית שטופלו bFGF, אנגיוגנזה חזקים ניתן לראות (איור 2 ב). צמיחת כלי הדם ניתן להעריך באמצעות האורך המרבי של כלי הדם (מכלי limbal נורמלי העליון של כלי דם חדשים), וכן כלי דם באזורים הכולל (איור 2B, שמסומן עם קו מקווקו אדום bFGF שטופלו הקרנית). שיטות כימות אחרים יש גם תיאר ^2,5.

באיור 1. הקרנית. רגיל עם H & E מכתים. אין כלי דם קיים קרנית רגילה. B. הפוך כיס מתחת לשכבת האפיתל של הקרנית. ג. הטבעת גלולה לכיס. ד. גורם angiogenic הוא שוחרר מן גלולה, ואת כלי דם חדשים לגדול מ כלי limbal נורמלי.

איור 2. התוצאה נציג חמישה ימים לאחר imמטע של גלולה.. קרנית עם גלולה המכילה רק את הרכב. ללא היווצרות כלי דם חדשים בתוך הקרנית. רק קיימים כלי limbal נורמלי גלויים. B. קרנית עם bFGF גלולה המכילה. חסון כלי דם חדשים (dot מצופה) גדל מ קיימים כלי limbal נורמלי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

קרנית העכבר כיס מודל assay תוארה לראשונה על ידי Muthukkaruppan VR ו R אורבך ⁶ בשנת 1979. פרוטוקולים מפורטים פורסמו על ידי מעבדות שונות ^2,3,7,8. במעבדה שלנו יש שינוי בשימוש בשיטה זו במחקרים שלנו במשך שנים רבות ^4. קרנית עכבר assay בכיס הוא מודל פשוט יחסית עם שחזור נהדר. יתר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ציוד	חברה	מספר קטלוגי
הביתור מיקרוסקופ	העולם מכשירי דיוק	PZMIV-BS
פון גרפה קטרקט סכין (להב 1.5x25mm, שטוחה)	אמבלר כירורגי	3401E
דומון # 5 מלקחיים	המדע כלים פיין	11252-50
מנורת סדק	Zeiss	30 SL-M

מגיב	חברה	קטלוג #	תגובות
bFGF (גורם בסיסי הצמיחה פיברובלסטים)	PEPROTECH בע"מ	100-18 ב
Sucralfate (octasulfate אלומיניום מורכבים סוכרוז)	סיגמא	S0652	10% PBS
poly-המה (פולי (2-hydroxyethyl methacrylate))	סיגמא	P3932	12% אתנול