הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

Summary

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

Abstract

ב 40 השנים האחרונות, ארצות הברית השקיעה מעל 200 מליארד דולרים בחקר הסרטן, וכתוצאה מכך רק ירידה של 5% בשיעור תמותה. מכשול עיקרי בדרך לשיפור תוצאות מטופל הוא ההבנה הלקויה של מנגנוני נדידה סלולרית קשורה לסרטן תאי פלישה, גרורות אגרסיביות והתנגדות טיפולית ^1. Glioblastoma multiforme (GBM), גידול הממאיר הנפוץ ביותר העיקרי מבוגר מוח ^2, מדגים קושי זה. למרות ניתוח, הקרנות וכימותרפיה סטנדרטיות, חציון הישרדות חולה היא רק 15 חודשים, עקב חדירה אגרסיבית למוח GBM סמוך והישנות הסרטן מהירה ^2. האינטראקציות של מנגנונים החריגים של תאים נודדים וגידול microenvironment סביר להבדיל מסרטן התאים נורמלים ^3. לכן, שיפור גישות טיפוליות לGBM דורש הבנה טובה יותר של מנגנוני נדידת תאים סרטניים. העבודה האחרונה עולה thaתת אוכלוסיות קטנות ta של תאים בתוך GBM, תא גידול בגזע המוח (BTSC), עשויים להיות אחראים על התנגדות והישנות טיפוליות. מנגנונים בבסיס יכולת הנדידה BTSC רק מתחילים להיות ^1,4 אפיין.

בשל הגבלה בבדיקה ויזואלית ומניפולציה גיאומטרית, מבחני הגירה קונבנציונלית ⁵ מוגבלים לכימות אוכלוסיות תאים כוללות. לעומת זאת, מכשירי microfluidic להתיר ניתוח תא בודד בגלל תאימות עם מיקרוסקופיה ושליטה על מייקרו הסביבה ^6-9 המודרניות.

אנו מציגים שיטה לאפיון מפורט של הגירת BTSC באמצעות מכשירי microfluidic מידור. התקנים אלה PDMS התוצרת להטיל סביבת תרביות רקמה לשלושה תאים המחוברים: זריעה קאמרית, מקבל חדר וגישור microchannels. אנחנו מותאמים מכשיר כזה ששני התאים להחזיק תקשורת המספיקה כדי לתמוך BTSC קיימא עבור 4-5 דהys ללא מדיה חליפין. BTSCs מאוד נייד הציג בתחילה לתא מבודד הזריעה לאחר הגירה למרות גישור microchannels לחדר קבלה המקביל. הגירה זה מדמה התפשטות הסרטן סלולרי דרך חללי ביניים של המוח. תמונות החיות של שלב מורפולוגיה תא, במהלך הנדידה נרשמות על פני כמה ימים. BTSC מאוד נדידה ולכן יכול להיות מבודד, recultured, ונתח יותר.

מיקרופלואידיקה מידור יכולה להיות פלטפורמה תכליתית למחקר הנדידה של BTSCs ותאי גזע סרטני אחרים. על ידי שילוב של המחוללים הדרגתיים, טיפול בנוזלים, מייקרו אלקטרודות ומודולים microfluidic אחרים, מכשירים אלה יכולים גם לשמש לסריקת תרופות ואבחון מחלה ^6. בידודו של תת אוכלוסיות אגרסיביות של תאים נודדים יאפשר מחקרים של מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס.

Protocol

1. התא של BTSC דיסוציאציה

BTSCs נגזרים מתרבויות קיימות מראש שגודלו בתאי גזע בינוני סרום ללא כneurospheres. התרבות אשר מתוארת ^{10, 11} בעבר.

1. הכן את השעית תא מneurospheres BTSC נגזרות. neurospheres BTSC-derived נאסף בצינור חרוטים 15 מ"ל וcentrifuged ב900 סל"ד במשך 5 דקות. צנטריפוגה מהר יכולה גזירה ו / או ניזק neurospheres. Supernatant הוא aspirated ותרבות neurosphere היא resuspended ב 0.5 מ"ל של Accutase מראש מחומם. פתרון זה הודגרו למשך 5-10 דקות על 37 מעלות צלזיוס ומאפשר את neurospheres כדי לשחרר. תאים הם שבשו מכאניים עם 10-20 משייכות עדינות של פיפטה P100 ולאחר מכן 1.5 מ"ל של מדיום תאי גזע יתווסף לתאים לנטרל Accutase.
2. את BTSCs מכן centrifuged ב1300 סל"ד במשך 5 דקות, וresuspended ב 1 מ"ל של מדיום בתאי גזע.
3. Aliquot μl 50 הוא להסיר את suspensיון והניח לתוך צינור microcentrifuge לספירת תאים. 50 μl של trypan כחול מתווסף לצינור אפנדורף וההשעיה ממוקמת בhemocytometer לספירת תאים.
4. אם נדרש לאחר ספירת תאים, תאי גזע בינוני נוספת מתווסף להשעית BTSC לתת צפיפות תאים של 20,000 תאים חיים / מדיה μl.

2. המצאה של סו 8 אדון דו שכבתי ודפוס של חותמת PDMS (ראה תרשים 1)

אנו משתמשים ליתוגרפיה האופטית ליתוגרפיה רכה ולפברק su-8 אדון וחותמת PDMS, שהם חיוניים להרכבה של מכשירי microfluidic. מעט שונה מההליך הרגיל ^12, סו 8-אדוננו מורכב משתי שכבות. את microchannels-3-מיקרומטר הגבוה הם casted בשכבה הראשונה / תחתונה מוקדם יותר בתהליך, ואילו תאי זריעה וקבלת 250-מיקרומטר-הגבוהים הם בשכבה השנייה / העליונה. על מנת שחיבור נכון בין שני מדורי תרבות (microchannelשל ותאים), שתי שכבות צריכות להיות מיושרות במדויק בתפקיד. עם זאת, עובי ואטימות של השכבה השנייה הם גדולים מספיק כדי לחסום את aligner fiducial / אופטי גישה לתכונות התחתונות. כאן אנו מעצבים את המסכות עם סמני fiducial שמוצבים מרחוק. לפיכך, סמנים אלה בשכבה הראשונה יכולים להיות מוגנים באופן סלקטיבי תוך ספינינג השכבה השנייה. כתוצאה מכך, שתי השכבות של תכונות נעשות באדון אחד ומוכן לדפוס בתבליט של בול PDMS.

1. לתכנן ולהכין שתי תמונות מסכות. מסכה אחת מורכבת משני סמני fiducial ומערך של microchannels (400 מיקרומטר ארוך ורחב 10-50 מיקרומטר) לשכבה הראשונה. עוד מסכה מורכבת מזריעה וקבלת תאים (2 מ"מ ארוך ורחב 600 מיקרומטר) לשכבה השנייה. שני המסכות נועדו בIllustrator (Adobe, קליפורניה), הליזר מודפס על גבי סרטי שקיפות (חלקי מתכת דקים, קולורדו), ניקו עם isopropanol ואוויר יבש.
2. הפוך את השכבה הראשונה עםsu-8 photoresist (MicroChem, מסצ'וסטס) על פי חוברת הוראות של מוצר מספק. ראשית, ספין מעייל רקיק הידית (חומרי WRS, קליפורניה) עם photoresist 3-מיקרומטר בעובי של su-8 (5), ואחריו רך של אפייה. Photoresist אז סגול חשוף ונרפא עם המסיכה המתאימה במגע קרוב, ואחרי שלאחר אפייה ובפיתוח.
3. ספין מעייל השכבה השנייה עם 250 מיקרומטר העבה su-8 (2100). על מנת למנוע photoresist העבה מחסימת סמני fiducial מהשכבה הראשונה, אנחנו מכסים שטחים אלו בנייר דבק בלפני ספין ציפוי של השכבה השנייה. אז הקלטת התקלפה לחשוף את הסמנים למטרת יישור.
4. UV-לחשוף את השכבה השנייה עם המסכה 2. עם סמני היישור גילו, זה פשוט, כדי ליישר אותם לאלה במסכה השנייה באמצעות aligner מסיכה אופטית. השכבה השנייה של photoresist אז סגול חשופה ורפא במגע קרוב, ואחרי אפיית הודעה ופיתוח.
5. מעייל נגד מקל ההורים הביאו. כדי לסייע בהסרת PDMS נרפא, סו 8-האדון ניתן silanized באמצעות שיקוע כדי ליצור את משטח ציפוי טפלון סוג. פשוט מניח אותה לייבוש למשך שעה אחת לפחות, עם כמה טיפין של trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) פתרון silane תחת ואקום.
6. עובש PDMS עם האב. מערבב בסיס prepolymer וידעונית של PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, מישיגן) ב10:01 יחס יסודיות. מקם אותו בתא ייבוש לdegassing ואקום עד שלא נראית בועת אוויר. יוצק את התערובת על המסכה והדגה שוב אם בועת האוויר חדשה הוא הציג. לרפא את העובש על פלטה חשמלית ברמה של 2 שעות ב90 ג לאחר שהיא מתקררת לטמפרטורת חדר, משחרר בעדינויות את חותמת PDMS. לפיכך, ערוצי culturing חקוקים בPDMS ומוכן להרכבה של מכשיר. האדון הוא לשימוש חוזר עבור דפוס עד שהוא סדוק או שחוק. הציפוי נגד המקל צריך להתבצע שוב כאשר הדביקות חוזרת.

3.הרכבה של מכשירי microfluidic וculturing תא (איור 2)

כדי תאי תרבות, חותמת PDMS תכונה החקוקה מצורפת לcoverslip זכוכית ליצירת ערוצים סגורים. מפרצונים ונוצרים שקעים לטעינת התרבות / תקשורת. בינתיים, ניקוי והליכים אחרים למצע הזכוכית וחותמת PDMS נחוצים כדי להבטיח את תא התאימות.

1. הפוך מאגרים באמצעות חותמת PDMS באמצעות אגרופן חור ביופסיה. אנחנו בוחרים קוטרם להיות 6 מ"מ. מאגרים אלה משמשים לשתי מטרות. אחת הוא להחזיק תזונתי נוספת לצמיחת תאים. השני הוא לגישה של טעינת פיפטה ושאיפת אבק.
2. משרה את חותמת PDMS ב70% אתנול למשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף אותו עם מים לא מיוננים למשך 10 דקות נוספות. המטרה היא לנקות את השאריות אורגניות פוטנציאליות הציגו במהלך תהליך ייצור, וuncrosslinked זיהום PDMS. תהליכי ניקוי יותר אינטנסיביים ויסודיים כגון מיצוי אורגני ¹³ וחילוץ Soxhlet ¹⁴ שמשו במקום אחר. עם זאת, מצא אותו מיותר בתרבות BTSC.
3. לעקר את חותמת PDMS באמצעות חיטוי (121 ° C, 35 דקות). צעד זה נוסף משלים את תגובת crosslink של PDMS. החל מהשלב הזה ועד שלב 3.6, כל ההליכים נלקחים באופן סטרילי.
4. אז חותמת PDMS מונחת על coverslip זכוכית, אשר מצופה בעבר עם פולי-L-ליזין. ^15-17 מכשיר אז מצופה laminin ידי מילוי הערוץ עם פתרון laminin הלילה בשעת 37 ° C. Laminin הוא aspirated מהמכשיר והמכשיר הוא שטף עם מדיום בתאי גזע.
5. טען השעית תא של שלב 1 לתוך מאגרים ותעלות. 11 μl של תאים ניתקו ממוקם במאגר זריעה אחד. שאיפת ואקום משמש להפוך תאים לתוך תא הזריעה, במידת צורך. 7 μl נוסף של תאים מוקם מאגר הזריעה הסמוכה. הערה: ממוצע צפיפות תאים היא 20,000 תאים / μl תקשורת. בירכתי הספינהאה חמש דקות, הזריעה ומאגרים שקבלו מוצפים באמצעי תקשורת.
6. הנח 0.5-1 גיליון PDMS מראש autoclaved מ"מ על גבי. הידבקות המשטח התרחש באופן טבעי, בין שתי פיסות PDMS תעשה תרבית התאים אטומות ומוכנה להובלה, דגירה והדמיה מיקרוסקופית.

4. לטווח ארוך הדמית זמן לשגות של BTSC הגירה עם BioStation IM (ניקון מכשירי Inc, מלוויל, ארה"ב).

שילוב של מצלמה, תוכנה וחממה כל אחד בתיבה, מערכת מיקרוסקופית זה מאפשר לתרבית תאי תמונה ללא הפרעה במשך ימים. בנוסף, עיצוב המנוע הייחודי שלה מעביר את העדשה האובייקטיבית ושומר במת מדגם נייח בתכונת נקודת ביקור-. זה עושה את זה מעשי לניסויים מקבילים תמונה ותנועת תאים במסלול בדיקת תפוקה גבוהה.

1. טרום לאזן IM Biostation במשך 45 דקות כדי לייצב את אספקת טמפרטורה, לחות ואוויר. תוספת של כמה מי המשךמנות ained בחדר מדגם משמשת כדי לשמור על לחות מתאימה.
2. טען את המכשיר סלולרי, המתקיים קאמרי המדגם של מיקרוסקופ, ומרכז אותה באמצעות פינצטה מייקרו.
3. הגדר את המיקוד, מיקום נקודות וזמן-נקודות בתוכנה ולהתחיל Biostation הזמן לשגות.

5. תוצאות נציג:

דוגמאות לבדיקה חזותית ואפיון של נדידת תאי הסרטן באמצעות מכשיר microfluidic מידור מומחשות באיור 3 ואיור 4. תא אונליין הוא BTSC. עם ההתקנה הנוכחית שלנו, תמונות שלב של תרבית תאים ניתן להקליט ברציפות במשך זמן רב ככל 5 ימים (איור 3) ותכוף כמו כל 2 שניות (איור 4). מעבר 5 ימים, תקשורת התרבות צריכה להיות מוחלפת למילוי ופסולת תזונתיים הוסר. לטווח ארוך הזמן לשגות שלנו מזהה רצף מסתובב של שישה שלבים סלולריים במהלך נדידתו מבוססת על השינויים מורפולוגיים. כillustrated באיור 3, שמתארים אותם כ( ט) לפני ההגירה, (ii) ייזום, (iii) נתיב חיפושים, (iv) שיוט, יעד-exloration (v) ולאחר ההגירה (vi). בחדר הקבלה, תאי כישור בצורה להישאר בשלב (i) כמו בגידולים בתפזורת כי הם מסוגלים לגדול, להתחלק ולהעביר בהדרגה. ככל שהם מתקרבים לכניסת microchannel, כמה תאים להמשיך לביים (ii) כאשר הם להרחיב וליצור בליטת דבק. רק אחד מהם הוא מסוגל לכבוש את הכניסה ולהמשיך לשלב (ג), שיכול לחקור את כיוון הנדידה. לאחר התא מקובע את כיוון הנדידה, הוא ממשיך ושלב (ד) לשיוט דרך microchannel במהירות קבועה וגבוהה, אשר נעשית דרך microchannel כולו. בסוף תמורת microchannel, תאים לבמה (v) כדי לחקור את החלל הפתוח של קבלת חדר, ולאחר מכן לבמה (vi). בmicrochannel, כוח נודד נוצר בעיקר על ידי פעילות blebbing כפי שמודגם באיור 4, בדומה לזה של amoeboid celאני. blebbing תא ועיוות קרום נרשמים באופן מלא כאן.

איור 1. שרטוטים של ייצור של מכשיר microfluidic. התהליך כולו מתבצע על פרוסות סיליקון ידית סיליקון 3-inch באמצעות טכניקה שונה של ליתוגרפיה הרכה. microchannels 3-מיקרומטר-גבוה וסמני יישור נעשים כמו בשכבה הראשונה. אז su-8 250 מיקרומטר בעובי הוא ספין מצופה, ואילו סמני היישור מכוסים בנייר דבק, כך שאינם יכול מאוחר יותר להיות נגיש כדי להסוות aligner ללא חסימת ראייה על ידי photoresist העבה. לפיכך, תכונות קאמריות יכולות להתבצע כשכבה השנייה ומדויקת מיושר לשכבה הראשונה. חותמת PDMS מעוצבת סופו של דבר את האדון שהתקבל.

איור 2. שרטוטים של הרכבת מכשיר ותהליך זריעת תא. מוקף PDMS וglcoverslip תחת, חלל culturing 3D מורכב מתאים, מאגרים וmicrochannels. קאמרי זריעה מלאה בתרבית תאים, ואילו התא המקבל תחילה מלא בתקשורת סלולרית בחינם. את microchannels שמתחבר ביניהם לספק שביל תא נודד מצד לזריעת קבלת צד.

איור 3. הגירת BTSC דרך microchannel. עליון: תצלומים של זמן לשגות להראות תא בודד (מודגש בירוק) נודד מעל 400 מיקרומטר מצד הזריעה לצד המקבל. כל המסע לוקח בערך 2 ימים, הכולל רצף של שינויים מורפולוגיים סלולריים. סרגל קנה המידה הוא 40 מיקרומטר. הנמך: ייצוג קריקטורה של שישה שלבי הגירה. טרום הגירה (i): בחדר זריעה, תאי כישוריות וdividable להעביר בהדרגה לאורך אחד את השני. תאי הגזע ליד כניסת microchannel אחד עם השני על ידי קיטוב גוף תא ודואר xerting בליטת lamellipodia. ייזום (ii): התא הנודד עם הקיבולת הגבוהה ביותר תופס את כניסת הערוץ בעוד מתחרתה תיסוג. נתיב חיפושים (iii): שינויי התאים הנודדים למצב amoeboid עם קוטביות קטנה. מצב הגירה זה מאוד ניע ומסוגל לחקור נתיב בכל הכיוונים על ידי blebbing בליטות קטנות בממברנה. שיוט (ד): ברגע שנתיב הנדידה נקבע, התא הופך למצב amoeboid הותאם על ידי שמירה על בליטה גדולה נוספת בדרך קדימה. בדרך זו, תא מקיימת תנועתיות גבוהות, כמו גם כיוון ומהירות קבוע. יעד חיפושים-(v): עם נתיב הקצה, התא מאט ומפתחת filopodias לחקור את חדר קבלה לכל מטרת פלישה. לאחר הגירה (vi): אחרי שנכנס לחדר הקבלה, תא הופך לצורת כוכב ושומר על תנועתיות גבוה, אך ללא כיוון נקבע.

"/>
. איור 4 תצלומים של זמן לשגות להראות מעגל blebbing עיוות פעילות וקרום של BTSC: (AB). ייזום; (BD). התרחבות; (DF). הכחשה. החיצים ועקומים הקווים מייצגים את הכיוון ומיקום של עיוות קרום, בהתאמה. את התמונות נאספות כל 8 שניות.

Discussion

מכשיר microfluidic וטכניקת הקלטת תמונה המוצגת כאן מאפשרים אפיון חזותי של מורפולוגיה סלולרית בעת הנדידה. בהשוואה לשיטות קונבנציונליות קיימות, כוללת פלטפורמת microfluidic יתרונות של עלות יעילה, תפוקה גבוהה וגמישות בעיצוב. מערכת ההדמיה המיקרוסקופית הציגה מאפשרת מחקר והקלטה של ​​נדידת תאים חייה לטווח ארוך. תכונת עדשה הממונעת מאפשרת לעקוב אחר נתיבי נדידה מרובים בתמונה ברזולוציה גבוהה מבלי להפריע למדגם.

במהלך ההרכבה של המכשיר, חותמת PDMS היא ערובה שאינן לצמיתות coverslip הזכוכית לנוחיות ציפוי PDL (שלב 3.4). זה קריטי להשגת איטום טוב להצלחתו של פרוטוקול זה. זיהום הציג מייצור המכשיר, כגון בועת אוויר בחותמת או אבק / לכלוך על פני המצע, יכול לסכן את המליטה והתוצאה בנוזל דולף. לכן, treating המכשיר באופן נטול אבק הוא חשוב כדי למנוע כשל בהתקן. לפני PDL-הציפוי, coverslips הזכוכית היא חומצה חנקתית טופלה ופתרון PDL הוא centrifuged לחסל אבק / לכלוך. אנחנו מוצאים את נייר דבק, אלכוהול לשטוף, ואמבט מים מאוד עוזר בהסרת אבק / לכלוך מבול PDMS, אם חדר נקי הוא לא נגיש. לאחר חותמת PDMS יצירת קשר עם coverslip הזכוכית, קשה על החותמת בעדינות עם פינצטה מקל את החותם.

BTSCs ניתן להעשיר מחדר ניתוח דגימות אנושיות דרך התרבות בתחום תאי גזע בינוני, בדומה לתרבות של תאי גזע עצביים נורמלים ^10. BTSCs מועשר באופן זה להדגים תכונות גזע תאים דמויים, כגון ביטוי של סמני תאי גזע (CD133, nestin), בידול לשושלות עצביות מרובות (גליה ועצבית), וייזום גידול במודל עכבר immunodeficient orthotopic עם כמה כמו 100 תאים ^18. למרות שחלק ויכוח קיים לגבי purifiקטיון ותחזוקה של ^{1 BTSCs, 19-21,} BTSCs תחום התוצרת טובה יותר לשמור על פנוטיפ וגנוטיפ של גידול ההורי ^22-24.

המרחב הממודר מחקה את הסביבה הפיזיולוגית לנדידת תאים. במכשיר שלנו, BTSC מפגין יכולת חזקה של הגירה דרך שטח מוגבל בגודל על ידי ויסות מורפולוגיה תאית. האפיון של השינויים מורפולוגיים הסלולריים שלנו מצביע על מצב תמורות ברצף שלב 6 שיכולים לעצב תיאור מפורט חדש אפשרי של פלישת BTSC של מוח הסמוך. בשלבים מוקדמים, התאים לקבל כמות משמעותית של קוטביות וליצור בליטות דבקות ביעילות לעגן את עצמם בתוך microchannel. ברגע שתפוסת התא בmicrochannel היא הוקמה, היא ממירה למצב שיוט ושומרת על מצב זה במשך כל הנסיעה דרך microchannel. בשלב זה, לשמור על תנועתיות BTSC גבוהה וכיוון עקבי אך לחסוך באנרגיה. בתוךterestingly, נראה כי אחד microchannel מוגבל לתא שיוט אחד בכל פעם, כך שכאשר תמורה יחידה סלולרית לשלב הזה, נסים תאים אחרים מmicrochannel. מנגנון זה מבטיח סיכוי יעילות של גידול ומונע התפשטות יתר של חומרים מזינים בmicrochannel. לאחר השלים נדידה על פני microchannel, תא חוזר לנטייתו לבליטות multidirectional ובדיקה נוספת למטרות פלישה או נתיבי הגירה חדשים. מכשיר microfluidic המידור מציע רומן במבחנה של יצירת משמעות microenvironment ללימוד חדירת BTSC של המוח parenchyma.

שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאמת למחקר של תאי גזע סרטניים (CSC) ושורות תאים נודדות הנגזרות מסוגי גידולים אחרים. תאי culturing במכשיר microfluidic ניתן לבצע בכל מעבדת ביולוגיה מודרנית שמצוידת באינקובטור ומומחיות תרבית רקמה. מצויד בסו 8 מאסטר, PDMSליהוק והרכבת מכשיר הם אפשריים עם קצת אימון בסיסי ליתוגרפיה הרכה. בנוסף, פלטפורמה זו עלולה להיות גם מורחבת עבור יישומים אחרים עם שילוב מודולים פונקציונליים אחרים כגון מיקסר שיפוע, דפוסי פני שטח, שליטה נוזלת וmicroelectrode.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
המדיום של Dulbecco העדכון של הנשר (DMEM), רמת הסוכר גבוה	Gibco / Invitrogen	11965	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
F12 של שינקין	Gibco / Invitrogen	31765	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
תוסף הוויטמין B27 מינוס	Gibco / Invitrogen	12587-010	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
אנטיביוטיקת Antimycotic (PSA)	Gibco / Invitrogen	15240	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
פקטור צמיחה אפידרמיס (EGF), רקומביננטי אדם	Gibco / Invitrogen	PHG0313	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
פקטור בסיסי גדילה (bFGF), רקומביננטי אדם	Gibco / Invitrogen	PHG0021	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
מלח נתרן הפארין, מרירית מעי חזירית	סיגמא	H1027-250KU	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
Laminin (עכבר טבעי)	Gibco / Invitrogen	23017-015	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
Accutase	Millipore	SCR005	תא מוח גידול בגזע (BTSC) אספקת התרבות
גזע בינוני תא			30% החמס F12 70% DMEM 1% האנטיביוטיקה antimycotic 2% B27 ללא ויטמין EGF (20 ng / mL) וbFGF / הפרין (20 ng/ המ"ל bFGF, הפרין 5 מ"ג / מ"ל) מרכיבים ומערבבים מסנן סטריליים לפני השימוש
גורם בסיסי גדילה (bFGF) / הפארין			ריכוז aliquot 20 מיקרוגרם / מ"ל עבור 25 מיקרוגרם: הוסף 1.25 מ"ל של הפרין 5mg/mL לbFGF מיקרוגרם 25. עבור 250 מיקרוגרם: הוסף 1 המ"ל הפרין 5mg/mL לbFGF מיקרוגרם 250. העברה עד 15 מיליליטר חרוטים ולהוסיף המ"ל הפרין 11.5 5 מ"ג / מ"ל ​​לקונים. חנות כמו 50 או 250 aliquots μl μl ב -80 ° C.
גורם גדילה באפידרמיס (EGF)			ריכוז aliquot 20 מיקרוגרם / מ"ל עבור 200 מיקרוגרם: הוסף 1 המ"ל סטרילי DMEM (Gibco 11965-118) לEGF מיקרוגרם 200. העברה עד 15 מיליליטר חרוטים ולהוסיף 9 המ"ל DMEM. עבור 500 מיקרוגרם: הוסף 1 המ"ל סטרילי DMEM (Gibco 11965-118) לEGF מיקרוגרם 200. העברה ל50 מיליליטר חרוטים ולהוסיף 24 המ"ל DMEM. לאחסן 50 & mu, אני או 250 aliquots μl ב-80 ° C.
הפארין			ריכוז aliquot 5 מ"ג / מ"ל תשקול את הפרין מ"ג 100. הוסף הפרין מ"ג 100-20 מ"ל (70%) DMEM-(30%) F12-(% 1) PSA (14 המ"ל DMEM, 6 המ"ל F12, 200 PSA μL) סינון סטרילי חנות כמו 50 או 250 aliquots μl μl ב -80 ° C
su-8 photoresist	MicroChem
רקיק ידית סיליקון	חומרי WRS	3P01-5SSP-INV
trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	סיגמה אולדריץ	448931
PDMS Sylgard 184	Dow Corning
laminin	BD Bioscience		50 מיקרוגרם /מ"ל ב PBS חיץ לריכוז הסופי
Biostation IM	ניקון מכשירים