מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים

Summary

γ-Herpesviruses (γ-HVs) להקים לאורך החיים התמדה ב המארח שלהם. זיהום של עכברים עם γ-HV68 מספק ממושמע גנטית In vivo מודל לאפיון של מחזור החיים / בפתוגנזה של γHVs. פרוטוקול זה מתאר את גילוי quantitation של זיהום γHV68 בשלבים חריפה בעקבות זיהום לטנטי על ידי המרכז, פלאק יוצרי זיהומיות, מבחני qPCR.

Abstract

γ-Herpesviruses (γ-HVs) בולטים על יכולתם להקים זיהומים סמויה של תאים הלימפה ^1. טווח צר של האדם המארח γ-HVs, כגון EBV ו KSHV, יש הפריע קשות מחקרים פתוגניים מפורט. Murine γ-ההרפס 68 (γHV68) מניות דמיון גנטי וביולוגי נרחב עם אדם γ-HVs והוא הפתוגן טבעית של מכרסמים murid ^2. לפיכך, ההערכה של זיהום γHV68 של עכברים זנים טהורים בשלבים שונים של זיהום ויראלי מספק מודל חשוב להבנת מחזור בפתוגנזה נגיפיים במהלך זיהום γ-HVs.

לאחר חיסון intranasal, γHV68 תוצאות זיהום viremia חריפה בריאה כי נפתרה מאוחר יותר לתוך זיהום לטנטי של splenocytes ותאים אחרים, אשר עשוי להיות מחדש לאורך חיי לארח את ^3,4. בפרוטוקול זה, נתאר כיצד להשתמש assay פלאק על התחתכייל של וירוס מדבק בריאה homogenates על monolayers תא Vero בשלב מוקדם (5 - 7 ימים) של זיהום שלאחר intranasal (dpi). בזמן זיהום חריף מנוקה ברובו 2-3 postinfection שבועות, זיהום לטנטי של γHV68 מוקמת סביב 14 dpi ומתוחזק בהמשך בטחול של העכברים. זיהום לטנטי בדרך כלל משפיע על אוכלוסייה קטנה מאוד של תאים ברקמות נגועות, לפיו הנגיף נשאר רדום ומכבה ביותר של ביטוי גנים שלה. Splenocytes רדום נגועים בנגיף באופן ספונטני מחדש על explanting בתרבות רקמות, אשר יכול להיות סיכם על ידי assay זיהומיות (IC) המרכז כדי לקבוע את עומס ויראלי סמוי. כדי להמשיך להעריך את כמות העותקים של הגנום הנגיפי בחריפות ו / או רקמות נגועות רדום, כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) משמש הרגישות המקסימלית שלה ואת הדיוק. מנתח בשילוב של תוצאות assay qPCR ורובד, ו / או assay IC יחשפו את הפרופילים spatiotemporal של נגיפישכפול infectivity in vivo.

Protocol

פרוטוקול הבא יתאר את המחקר של titers וירוס והמון הגנום הנגיפי במחזור זיהום ממס לבין הכמוס של γHV68 בעכברים, אשר יכולים תיאורטית לשמש כדי להעריך זיהום על ידי וירוסים אחרים שיתוף אורח חיים דומה לזה של γHV68.

1. הגברה של γHV68

1. הפשירי בקבוקון קפוא של γHV68 ב 37 ° C אמבט מים.
2. הוסף inoculums ויראלי NIH3T12 או תרבית תאים 3T3 (~ 50% confluency) ב 10 מנות ס"מ התרבות תאים נגועים ב 37 מעלות 5% CO _2.
3. בדוק את התרבות על ידי מיקרוסקופיה להשפעת cytopathic (CPE) ולאסוף את התקשורת בזמן יותר מ 80% של תאים להראות CPE 4 ~ 5 ימים לאחר ההדבקה. כדי למקסם את התשואה של הנגיף, התרבות תא נגוע יכול להיות קפוא-and-מופשר פעמיים לשחרר את כל התא הקשורים γHV68.
4. צנטריפוגה התקשורת שנאספו 1000 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר שאריות תאים.
5. בזהירות העברת supernatants לצינורות חדשים (מהירות גבוהה צינור צנטריפוגות) בלי לגעת פסולת התא בתחתית.
6. במהירות גבוהה צנטריפוגות ב 12,000 סל"ד (עבור Sorvall SA-600) בשעה 4 ° C לפחות 1.5 שעות להתרכז חלקיקים נגיפיים.
7. בטל supernatants לתוך פתרון אקונומיקה 10γ בזהירות מחדש להשעות את גלולה (וירוס ופסולת תא שיורית) עם 1ml בסרום ללא DMEM. מעבירים את גלולה מחדש מושעה לתוך צינור 1.5 מיקרו צנטריפוגות מ"ל ומערבבים היטב על ידי vortexing.
8. צנטריפוגה 2 דקות במהירות המרבית כדי להסיר שאריות פסולת התא ולהעביר את supernatant (מניות וירוס) על צינור חדש. זהו מלאי ויראלי הסופי זיהום. כייל של המניה נקבע על ידי וירוס assay פלאק (ראה להלן).

2. זיהום Intranasal של עכברים עם γHV68

1. להדביק עכברים ב ~ 6 שבועות של גיל עם 1000 ~ 5000 יוצרי הפלאק יחידות (PFU) של γHV68 עכברים לכל.
2. להרדיםעכברים על ידי הזרקה של קטמין / xylazine (60 μl / עכבר מתערובת של קטמין 80 מ"ג / מ"ל ​​ו - 12 מ"ג / מ"ל ​​xylazine) לתוך חלל הצפק. צג הרדמה על ידי צובט את הבוהן עכברים. בדרך כלל לוקח 50-10 דקות ~. אם העכברים אינם בהרדמה מלאה, הם להתעטש את הנגיף.
3. כאשר סמן העכבר נמצא בהרדמה מלאה, להשתמש פיפטה לחסן ~ 30 μl של PBS המכיל γHV68 (15 μl בכל נחיר) לעכברים טיפה אחר טיפה לאט אך בהתמדה. הקפד העכבר הוא אכן שאיפת טיפות מבלי לנסות ליצור בועות.
4. אפשר העכבר כדי להתאושש במשך 10-15 דקות ולנטר את רווחתם של העכברים (למשל, מודעות לנשימה, וכו ') לפני החזרה אותם לכלוב. בעלי חיים נבדקים מדי יום מחלה הלימות של מזון, מים ותנאים מצעים. אם הסימנים הקליניים של מחלת כאב, מצוקה או לפתח, אבחון שגרתי כדי לקבוע את האטיולוגיה יתנהל. בעלי חיים לאבד יותר מ -20% ממשקל גופם תירשם לירידה במשקל מרביו מורדמים. ההחלטה הסופית לבצע המתת חסד היא לפי שיקול דעתו של הווטרינר הקליני עשוי לאחר התייעצות עם החוקר הראשי.

3. רובד Assay כדי לקבוע את כייל הנגיף ריאות אינפקטד בחריפות

1. Infectivity titers וירוס נקבעים על ידי היווצרות פלאק על monolayers של תאים Vero.
2. תאים Vero הם זורעים על 2.5x10 ⁴ תאים / היטב היטב 12 צלחות יום לפני assay פלאק. התאים צריך להיות מופץ באופן שווה את צפיפות התאים צריך להגיע 30-40% ביום assay פלאק.
3. הכן 0.5% (w / v) methylcellulose (MC) כיסוי בינוני (טבלה 1).
4. הקורבן γHV68 עכברים נגועים 5-7 ימים לאחר ההדבקה intranasal לקבוע חד פאזי titers וירוס בריאות. עבור euthanization קטמין הידרוכלוריד (8-10 מ"ג / ק"ג SC, IM, IP) יהיה המנוהלים על ידי IM בעקבות מנת יתר תוך ורידי של Na pentobarbital (IP מ"ג / ק"ג 30-50). שיטה זו לא אושרה על ידיהוא האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית.
5. קציר הריאות ולשטוף פעמיים עם 1 x PBS להסיר כדוריות הדם. איסוף בצד אחד של הריאות ב 1 מ"ל מדיום קר כקרח DMEM להשלים ולשמור על הקרח. במהירות להקפיא את הצד השני של הריאות חנות ב -80 ° C לבדיקת עומסים ה-DNA הנגיפי בתוך הריאות על ידי qPCR (ראה להלן).
6. השתמש homogenizer רקמות homogenize רקמות הריאה במהירות המרבית עבור 1 sec, להקפיא-and-להפשיר שלוש פעמים. שטפו את homogenizer עם אתנול 70% על כל צעד ושעל בעת החלפת המדגם.
7. צנטריפוגה רקמת הומוגני בסל"ד 3000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. אסוף את supernatant ולהעביר צינורות חדשים assay פלאק.
8. הכן דילולים סדרתי (בדרך כלל 10-10 ° ^-8) של דגימות ריאה homogenate ב 1.5 מ"ל מיקרו צנטריפוגות מבחנות עם DMEM רגיל על ידי מערבולת. מלא מראש את המספר המתאים של צינורות עם 540 DMEM μl ו לדלל 60 homogenate μl לתוך הצינור הראשון. העברת 60 μl מהצינור הראשונהלא הבא, וכן הלאה.
9. לשאוב מן התקשורת monolayers Vero מוכן ב 12 גם צלחות לטעון 200 μl / homogenate גם בדילול סדרתי המכיל וירוסים זיהומיות בסדר הפוך (מ ^-8 עד 10 ° 10). השתמש שתי בארות עבור כל טיטרציה (בשני עותקים).
10. דגירה תאים Vero עם hr וירוס 1 inoculums ב 37 ° C. מערבולת בעדינות את הצלחות כל 15 דקות כדי לפזר באופן שווה את הנגיף על monolayer.
11. הסר את inoculums ולהחליף אותו מ"ל 2 / היטב של המדיום כיסוי (טבלה 1). דגירה הצלחות במשך שבוע אחד בכל 37 ° C.
12. הסרת כיסוי בינוני (לא צריך להיות שלם) ולהחליפו לתקן את / בינוני כתם assay פלאק (טבלה 1) ו דגירה עבור שעה לפחות 1 ב RT.
13. כאשר הלוחות הם מיובשים, לספור את מספר לוחות מבודדים היטב על כל דילול. כדי למזער את השגיאה, רק בארות המכיל בין 10 לוחות ו - 100 נספרות.
14. חשב את כייל הנגיף באמצעות folloאגף הנוסחה: כייל (pfu / ml) = [(מספר לוחות / טוב) / (נפח inoculums / טוב)] x גורם לדילול.

4. מרכז Assay זיהומיות כדי לקבוע את עומס הנגיף רדום Splenocytes מאשרום

1. עומס ויראלי סמוי נקבעת על ידי assay זיהומיות (IC) על מרכז monolayer של תאים Vero. יום לפני IC, ​​assay תאים זרע Vero ב 6 גם צלחות (1 -. 2.5 X 10 ⁵ תאים / גם אנחנו בדרך כלל לשימוש 11 בארות לדגימה הטחול, 10 בארות ישמש ההשעיה splenocytes בדילול סדרתי ואף אחד גם לבדיקה מחדש ספונטנית של הנגיף לאחר להקפיא להפשיר מחזורים.
2. הקורבן עכברים נגועים לאחר חביון הוא הוקם (12 - 14 ימים לאחר ההדבקה). קציר את הטחול העכבר בריכה אותם לתוך 1 מ"ל DMEM צונן.
3. ניתוק מכני של הטחול העכבר. העבירו את העכבר spleens מבודד טרי לתוך צלחת 10 ס"מ ומוסיפים 10 מ"ל של מדיום הרצוי כגון DMEM עם 2% FBS. הרטיבה שתי חלבית סוף זכוכית microscאופ שקופיות עם מדיום קר כקרח. מניחים את הטחול בצד חלבית של שקופית אחת ניק הקפסולה עם הקצה של הקצה הקפואה של השקופית אחרים. מבחינה מכנית לנתק את הטחול בין שתי שקופיות עד שכל הגושים האדומים כתוש (גם להסיר חלקיקי שומן אם קיים).
4. לשטוף עם שקופיות DMEM להתאושש התאים הנותרים בשקופיות שניהם.
5. מעבירים את ההשעיה הרקמה כולה בעדינות דרך מסננת התא (40 ניילון רשת מיקרומטר) לתוך שפופרת 50 מ"ל הברגה כובע חרוטי. לשטוף את צלחת 10 ס"מ המכיל את homogenates הטחול עם 10 מ"ל PBS ולהעביר תוך סינון.
6. צנטריפוגה התא השעיות יחיד 10 דק 'ב 375 XG וזורקים supernatant. פליק את כדורי לתא לפרק את גושי התאים הקיימים. הוסף 5 מ"ל חיץ ACK (טבלה 1) כדי lyse את כדוריות הדם האדומות. דגירה 5 דקות ו צנטריפוגות שוב x 375 גרם
7. בטל supernatant מחדש להשעות את כדורי, ביסודיות, אך בעדינות, ב-PBS עם 2% FBS. שמור את התאים ב 4 ° C. השתמש כדי פיפטהלהסיר שאריות, אם בכלל. ספירת תאים קיימא באמצעות דלפק תא אוטומטי (Bio-Rad).
8. ספין למטה PBS-XG resuspended splenocytes ב 375 דקות 4. בטל supernatant ו resuspend התאים 4 מ"ל DMEM להשלים (2 x 1 מ"ל ישמש assay IC ההשעיה המקורי; 0.6 מ"ל המשמש דילול פי חמישה סדרתי assay IC: 0.4 מ"ל להכנת דנ"א qPCR ויראלי, ו 1 מ"ל ההשעיה ישמש כדי להעריך מחדש ספונטנית של הנגיף רדום לאחר שלושה מחזורים להקפיא להפשיר)
9. הכינו סידורי פי חמישה דילולים (כלומר 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) של השעיה splenocytes ב כפילויות. מלא מראש של 15 צינורות חרוטי מ"ל עם 2.4 מ"ל ו DMEM לדלל 600 μl ההשעיה splenocytes לתוך הצינור הראשון ומערבבים היטב. העברת 600 μl מהצינור הקודם לתוך הצינור הבא, וכו 'אל מערבולת!
10. לשאוב את המדיום של monolayer 6-מוכן היטב של תאים Vero. 1 מ"ל של זרעי splenocytes סדרתי, בדילול מלא על תאים Vero עם dupl כל דילולicated (10 בארות ישמש 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 דילולים).
11. דגירה צלחות 8-12 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לא יעלה על 24 שעות. לשאוב את ההשעיה splenocytes seeded עומס 4 מ"ל כיסוי התקשורת (טבלה 1) היטב כל אחד. דגירה עבור 6 ימים נוספים.
12. קביעת רמות של מרכזי הטחול זיהומיות על ידי מכתים את הצלחות עם 0.2% (w / v) סגול גביש כפי שמוצג assay פלאק.

5. כימות של גנום ויראלי

1. חלץ הדנ"א הגנומי הכולל של γHV68 רקמות נגועים, כגון הריאות והטחול דגימות בניסוי הזה. השתמש דם DNeasy & ערכת רקמות (Qiagen), בעקבות פרוטוקול של היצרן.
2. קבע את ריכוז ה-DNA של מדגם זה על מנת להבטיח את אותה הכמות של DNA בשימוש עבור assay qPCR. עיצוב ספציפיים וירוס primers (~ 200 amplicon נ"ב היא המועדפת assay qPCR). השתמשנו γHV68 ORF56 ספציפי primers (פריימר קדימה: 5 & יחסי ציבורIME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; פריימר הפוך: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3 ") עבור assay זה β-אקטין primers (קדימה פריימר:" פריימר הפוך: 5'-3-gtgaggatcttcatgaggtagtc "5'-cacccacactgtggcccatcat-3) כמו שליטה על התגובה qPCR.
3. מערבבים את דגימת DNA (100-500 ng טוב) ו primers המתאים עם 2 x SYBR מאסטר מיקס (Bio-Rad IQ SYBR גרין Supermix). השתמש Bio-Rad Real-Time PCR מערכת לכמת את העומס הנגיפי ברקמות נגועות. ביצוע PCR בתנאי הבא: 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ו - 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 60 ° C למשך 30 דקות, ו - 72 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ואחריו ניתוח עקומת התכה, הן עבור ויראלי אקטין amplicons.
4. כדי להפוך את עקומת תקן כימות של הגנום הנגיפי, לדלל את כמויות סדרתי ידוע של ה-DNA γHV68 bacmid עם הדנ"א הגנומי מבודדים תאים נגוע. הפעל qPCR במקביל DNAs מאוחזר infecטד רקמות באמצעות ערכות אותו וירוס ספציפי primers.
5. נוכח העומס הגנום הנגיפי ברקמות כמספר להעתיק נגיפי DNA ליחידה (למשל 100 או 500 ng ng) של הדנ"א הגנומי לאחר נורמליזציה אקטין.

6. נציג תוצאות:

איור 1 מתאר את התוכנית הכוללת של הניסויים למדידת זיהום γHV68 בעכברים in vivo. תוצאות נציג titers הנגיף לריאות במהלך דלקת חריפה של γHV68, כפי שנקבע על ידי assay פלאק, הוצגו איור 2A. זן מוטנטי של γHV68 המכיל שאינם פונקציונליים ויראלי Bcl-2 (vBcl-2) משוכפל ברמות להשוות wild-type γHV68 הריאות אחרי 7 ימים של זיהום intranasal BALB / c עכברים (6-7 עכברים בכל קבוצה). אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין titers הריאות של הנגיף התגלו בין שתי הקבוצות. נתונים אלו עולה כי vBcl-2 הוא לא גורם מכריע עבור הזיהום החריף של γHV68 בעכברים. עם זאת, על ידי postinfection 28 ימים, כייל הנגיף vBcl 2-מוטציה ב spleens ירד 6 - עד 10 - לקפל לעומת WT, כפי שנמדד על ידי assay זיהומיות במרכז (תרשים 2B), מה שמרמז כי vBcl-2 מוטציה γHV68 וירוס פגום בשמירה על חביון הטחול לאחר ההדבקה. בהסכם עם titers מופחת מרכז זיהומיות, לטעון את הגנום הנגיפי של נגיף vBcl-2 מוטציה צומצם קשות בהשוואה לזו של וירוסים WT ביום 28 בניסויים חוזרים ונשנים, כפי שמוצג באיור 2 ג. המתאם ההדוק בין המון הגנום הנגיפי ואת התדירות של סמויה, HV68vBcl-2 מחדש מוטציה vivo לשעבר הנגיף בשלב לטנטי של זיהום מדגיש פגם חביון של זיהום זה וירוס מוטנטי.

באיור 1. תרשים סכמטי למדידת זיהום γHV68 בעכברים באמצעות היווצרות הפלאק, מרכז מידבקות, assay qPCRs.

באיור 2. זיהום ממס ו סמויה של WT γHV68 וירוסים ו מוטציה in vivo. שכפול חריפה (A) של WT ו מוטנטים vBcl-2 γHV68 וירוסים הריאות של העכברים BALB / c ב 7 dpi (זיהום שלאחר יום) נקבע על ידי assay פלאק. (B ו-C) מרכזי זיהומיות הטחול (B) עומס הגנום הנגיפי (ג) ב spleens של עכברים נגועים נמדדו 28 dpi ידי assay מרכז qPCR זיהומיות, בהתאמה. הקווים האדומים, הממוצעים של ערכי המצוינות. ns, לא משמעותי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

γHV68 כבר בשימוש נרחב כמודל להבין את הפתוגנזה של ^2,4,5 אדם γ-HVs. בפרוטוקול זה, אנו תיאר שלוש שיטות בשימוש שגרתי, כולל assay פלאק עבור כייל הנגיף מדבק, assay IC עבור עומס ויראלי סמוי, ועל qPCR עבור עומס הגנום הנגיפי, כדי להעריך את זיהום חריף הכמוס של γHV68 לאחר חיסון intranasal בעכברים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
חומר שם	הכנת נוהל
Methylcellulose (MC) כיסוי בינוני assay פלאק נגיפי	מחממים ~ 250 מ"ל של מים מזוקקים בבקבוק TC כדי> 80 ° C (רותחים במשך 3 דקות במיקרוגל) מוסיפים בהדרגה את אבקת 2.5 גרם MC לתוך המים מחוממים, תוך ערבוב על להבה נמוכה עד שהיא נמסה. מיד החיטוי במשך 15 דקות בכל מחזור נוזלי. ערבוב התקשורת autoclaved MC ב 4 ° C למשך הלילה. מערבבים 250 מ"ל MC התקשורת עם 200 מ"ל 2 x ממ (Gibco-BRL) + 50 מ"ל FBS לתת 500 מ"ל התקשורת כיסוי.
תקן / כתם בינוני assay פלאק	0.2% (w / v) גביש סגול באתנול 20%.
תמוגה ACK הצפת	NH 4 Cl 0.15M, KHCO 3 10mm, EDTA 0.1mm
השלם DMEM	שונה Dulbecco הנשר של המדיום(DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברית (FBS, Invitrogen), 2 מ"מ L-גלוטמין ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין (Gibco-BRL).

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
קטמין	Sigma-Aldrich	K2753
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1251
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512-250
2 x ממ	Life Technologies	11935
תא מסננת	BD Faclon	352340
אומני רקמות homogenizer	אומני הבינלאומי	TH115
דם DNeasy & ערכת רקמות	Qiagen	69504
iQTM SYBRH גרין Supermix	BioRad	170-8882
CFX96 בזמן אמת, מערכת ה-PCR	Bio-Rad	184-5072
תא נגד	Bio-Rad	145-0001
Sorvall SA-600	Thermo Scientific	096-124022