JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של התקן מולקולרי בקנה מידה מופעל על ידי חלבון topoisomerase. לבנות הוא חיישן ביולוגי מולקולרי אשר תוויות שני סוגים עיקריים של הפסקות DNA בסעיפים רקמה על ידי מצרפת שניים fluorophores שונים למטרותיהם.

Abstract

באופן טבעי ביו מולקולרית מכונות לעבוד בכל תא חי להציג מגוון של עיצובים 1-6. עם זאת, פיתוח של מכונות מולקולריות מרכזי מלאכותי על מכשירים המסוגלים תנועה כיוונית, כלומר מנועים מולקולריים, ועל חלקים מוקטנת שלהם מכני (גלגלים, axels, תליונים וכו ') 7-9. זה מחקה את המאקרו מכונות, למרות התכונות הפיסיקליות חיוני עבור התקנים אלה, כגון אינרציה ושימור תנע, לא שמיש בסביבות nanoworld 10. עיצובים חלופיים, אשר לא פעל תוכניות מכני macromachines ולהשתמש במנגנוני התפתח באבולוציה של מולקולות ביולוגיות, יכולים לנצל את התנאים הספציפיים של nanoworld. חוץ מזה, התאמת מולקולות ביולוגיות בפועל למטרות ננו עיצוב מפחית הסכנות הטמונות במוצרים ננוטכנולוגיה עשויה להוות. כאן אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של לבנות חיים ביו אפשרה כאלה, כמואמי-מלאכותי התקן מולקולרי המשלבת מכונה מולקולרית טבעיים המתחוללים עם מרכיבים מלאכותיים. מנקודת מבט enzymology, לבנות שלנו הוא מעצב פלורסנט אנזימים המצע מורכב להרכיב לבצע פונקציה שימושית ספציפית. הרכבה זו מעצם הגדרתה מכונה מולקולרית, כפי שהוא מכיל 12. עם זאת, השילוב שלו עם החלק מהונדסים - סיכת ראש כפול פלורסנט - מחדש מכוון שזה משימה חדשה של תיוג נזק לדנ"א 12.

לבנות שלנו מרכיב מתוך ה-DNA 32-mer ו אנזים vaccinia topoisomerase אני (VACC Topo). המכונה ואז משתמש בתוכן משלה לפברק שתי יחידות גלאי שכותרתו fluorescently (איור 1). אחת היחידות (פלואורסצנטי ירוק) נושא VACC Topo מחוברת קוולנטית אל 3'end שלה ליחידה אחרת (אדום פלואורסצנטי) היא סיכת חינם עם 3'OH סופנית. היחידות קצרת ובמהירות מחדש בחזרה לבנות המקורי, אשר לאחר מכן recleaves.בהעדר DNA הפסקות אלו שתי יחידות נפרדות ברציפות religate בצורה מחזורית. בקטעים רקמה עם נזק לדנ"א, יחידת topoisomerase נושאי גלאי סלקטיבי מייחסת בוטה, שהסתיימה עם הפסקות DNA 5'OH (DNase II מסוג הפסקות) 11,12, fluorescently תיוג אותם. השני, אנזים ללא מכבנה נוצר לאחר מחשוף oligonucleotide, יהיה ולקשור את הפסקה 5'PO בוטה, הסתיים 4 (DNase אני מסוג הפסקות) 11,12, אם האנזים T4 DNA נמצא הפתרון 13,14. כאשר האנזים T4 DNA הוא הוסיף קטע רקמה או פתרון המכילים DNA עם 5'PO 4 קהה הסתיים הפסקות, האנזים מגיב עם 5'PO 4 קצוות DNA, ויצרו חצי יציב אנזים-DNA קומפלקסים. סיכות הסתיים בוטה יקיימו אינטראקציה עם אלה מתחמי שחרור האנזים סיכות ו קוולנטית קישור ל-DNA, ובכך תיוג 5'PO 4 בוטה-DNA הסתיימו הפסקות.

פיתוח זה מדגים גישה מעשית חדשה העיצוב דואר של מכונות מולקולריות ומספק חיישן שימושי עבור זיהוי של אפופטוזיס ו-DNA נזק בתאים וברקמות קבוע.

Protocol

סעיפים לאיתור מכונת מבוססי מולקולרית צריכים להיות מוכנים הראשון, כי ההכנה שלהם לוקח זמן רב יותר מאשר ההרכבה של המכשיר מולקולרית. לבנות עובד גם עם 5-6μm בעובי לחתוך קטעים מתוך paraformaldehyde-קבוע, פרפין, משובצים אבני רקמות. השתמש המותגים שקופיות אשר שומרים על החלקים היטב, כגון ProbeOn פלוס שקופיות טעונה precleaned (פישר סיינטיפיק) או דומה. אנו ממליצים תחילה באמצעות רקמות עם דפוס מוכר של נזק לדנ"א אשר מכיל גם I-II ו DNase DNase מסוג הפסקות, כמו עכברוש dexamethasone שטופלו אפופטוטיים התימוס 13,14.

1. הכנת חלקים

  1. מניחים את הסעיפים במעמד שקופיות dewax ב קסילן במשך 15 דקות, להעביר אמבטיה קסילן טרי 5 דקות נוספות.
  2. רעננותם על ידי עובר דרך ריכוזי אתנול ציון: 96% אתנול, 2x5min; אתנול 80% - 5min: מים - 2x5 דקות.
  3. תקציר קטע עם Proteinasה ק השתמש 100μL פתרון 50μg/mL לכל סעיף. דגירה 15 "בטמפרטורת החדר (23 ° C) בתא humidified. השעה ייתכן שיהיה צורך הסתגלות בהתאם לסוג רקמה. רקמות קשיח עשוי לדרוש יותר לעיכול. טיימס של 15-25 דקות משמשים בדרך כלל. מערכת העיכול לא מספקת עלולה לגרום האות החלש. Overdigestion על תוצאות יד אחרים היעלמות אותות שיבוש סעיף.
  4. שטפו במים מזוקקים דקות 2x10.
  5. החלת סעיף 100 μL לכל BSA של 2% עבור preblocking. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (23 ° C). במהלך תקופה זו להרכיב את המכונה המולקולרית.

2. הרכבה מכונות מולקולריות

ריאגנטים כל מדורגים עבור נפח 25 סך μL, אשר מספקת לגילוי יחיד קטע רקמה בגודל ממוצע (10x10mm). הכרך וניתן לשנותם עד לפי הצורך.

  1. מערבבים בתוך שפופרת פלסטיק קטנה לפי הסדר הבא:
  1. Bidistilled מים;
  2. פוליאתילן גליקול 8000, 15%;
  3. הפתרון של 66 מ"מ טריס HCl, pH 7.5, 5 מ"מ MgCl 2, 0.1 מ"מ dithioerythritol, 1 mM ATP, (כלומר האנזים T4 קבוע למאגר ה-DNA);
  4. 70 pmoles של oligonucleotide 1,
  5. 215 pmoles (1.76-7.1 מיקרוגרם) VACC Topo
  6. 10 יחידות האנזים T4 DNA (500 U / mL)
  1. מערבבים בעדינות על ידי pipetting. מולקולרית לבנות כמעט מיד עצמית מרכיב בפתרון זה והוא יכול לשמש מיד בטמפרטורת החדר (23 ° C). הגדלת הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס חוסם את האנזים T4 DNA מבוסס רכיב של תיוג.

3. באמצעות מכונות מולקולריות בסעיפים רקמות 5'OH תווית כפולה 5'PO4 הפסקות DNA

  1. לשאוב את הפתרון preblocking וליישם 25μL של תערובת התגובה מלא המכיל 70 pmoles של oligonucleotide 1, 53-215 pmoles (1.76-7.1 מיקרוגרם) VACCTopo ו -10 יחידות האנזים T4 DNA (500 U / ml) בתמיסה של HCl 66 מ"מ טריס, pH 7.5, MgCl 5mm 2, 0.1 מ"מ dithioerythritol, 1 mM ATP, ו 15% פוליאתילן גליקול-8000. Oligonucleotide אותו רצף נושאת תווית FITC יחיד, oligonucleotide 2, יכול לשמש במקום לצורך זיהוי של סוג אחד של הפסקות DNA. במקרה כזה האנזים להשמיט מן התגובה תיוג. גם במצב זה פתרון של 50mm טריס-HCL, pH 7.4, 15% PEG-8000 יכול לשמש במקום למאגר ה-DNA האנזים T4.
  2. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר (23 ° C) בתא humidified עם coverslip פלסטיק. הגנה מן האור. הפחתת הטמפרטורה עד 16 מעלות מפחיתה את האות האנזים מבוסס; העלייה בטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס לחלוטין מבטל את האות האנזים מבוסס. עיכוב חלקי של האנזים לפעמים מתרחשת לערבב את התגובה, אולי בשל מזהמים הציג בהכנות topoisomerase. לכן, דגירה ארוך (2-4 שעות), ייתכן שיהיה צורך במיוחד כאשר sמספרים ignificant של האנזים שכותרתו שוברת נוכחים. למרות ששני האנזים אותות topo ניתן לצפות בשלב זה, במקרים רבים האות האנזים ניתן לשפר עוד יותר על ידי יישום מחדש של תמהיל תגובה ללא VACC Topo ו oligonucleotide כפול שכותרתו, אך המכיל oligonucleotide מכבנה בצורת (oligonucleotide 3) (35 מ"ג / מ"ל) ו-DNA האנזים T4 (250 U / mL). כדי לשפר את האות לשלב 3, כדי לראות את התגובה ללא שיפור עבור לשלב 5.
  3. הסר coverslips ידי בעדינות לטבול את השקופיות אנכית בצנצנת Coplin המכיל מים בטמפרטורת החדר. לשאוב מים עודף.
  4. שפר את האות האנזים על ידי יישום של 25 μL לערבב תגובה ללא VACC Topo ו oligonucleotide 1, אך המכיל oligonucleotide 3: 66 מ"מ טריס HCl, pH 7.5, 5 מ"מ MgCl 2, 0.1 מ"מ dithioerythritol, 1 mM ATP, ו 15% פוליאתילן גליקול- 8000, 5 יחידות האנזים T4 DNA, 35 מ"ג / מ"ל ​​oligonucleotide 3 (מכבנה בוטה הסתיים). ההיקף הכולל של הפתרון ca תיוגn להיות scaled עד כדי להכיל את החלקים גדול יותר. דגירה של שעה 18 (לילה) בטמפרטורת החדר (23 ° C) בתא humidified עם coverslip פלסטיק.
  5. הסר coverslips ידי בעדינות לטבול את השקופיות אנכית בצנצנת Coplin המכיל מים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף דקות סעיף 3x10 במים מזוקקים.
  6. לשטוף עם חיץ סודיום ביקרבונט. פתרון בסיסי לשטוף משפר FITC פלואורסצנטי, שהוא רגיש pH ו מצטמצם משמעותית מתחת pH 7.
  7. כיסוי בסעיף פתרון antifading (Vectashield עם DAPI), coverslip ולנתח את האות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פעמיים גדיל DNA עם הפסקות 5'OH לזרוח יהיה ירוק, 5'PO 4 שובר - יהיה לזרוח אדום (איור 2).

4. נציג תוצאות

figure-protocol-6201
באיור 1. חצי מלאכותי מכונה מולקולרית מזהה שני סוגים שלה-DNA נזק באתרם. מכונת פלורסנט עצמית מרכיב כאשר VACC Topo נקשר מכבנה פעמיים 32-mer. המכשיר מתחיל הניתוח עצמו על ידי פיצול לשתי יחידות הגלאי דרך topoisomerase מתוצרת לחתוך בסוף '3 של רצף ההכרה. התוצאה היא תהליך מחזורי שבו יחידת FITC שכותרתו ברציפות מפריד religates בחזרה ליחידה, שכותרתו rhodamine. זה נמשך עד להפסקה DNA לזיהוי הוא נתקל. כאשר acceptor כזה אלטרנטיבה (DNA 5'OH בוטה לשבור סוף) נמצא קטע הרקמה, החלק FITC יהיה ולקשור אליו. החלק הנותר rhodamine יצרף ת.ד. "5 4 בוטה DNA שובר סוף בעזרת האנזים דנ"א T4. כתוצאה מכך, שני סוגי הפסקות DNA מזוהים בו זמנית.

figure-protocol-6998

באיור 2. מכונת תוויות מולקולרית כפול שני סוגים של הפסקות DNAבקטע הרקמה של dexamethasone שטופלו התימוס. בלאנט, הסתיימו הפסקות DNA של DNase I-II ו DNase מסוג מזוהים באזורים קורטיקליים הרתי העוברים אפופטוזיס. הקרינה cytoplasmic הירוק (5'OH הפסקות DNA) סימני מקרופאגים קליפת המוח לעכל חומר גרעיני של thymocytes אפופטוטיים. אות זה מופק על ידי VACC Topo, ו localizes כדי phagolysosomes עם DNA המכיל 5'OH פעמיים גדיל הפסקות 11,12. אדום פלואורסצנטי (5'PO 4 הפסקות) תוויות גרעינים של thymocytes אפופטוטיים לא נבלע על ידי מקרופאגים. מספרים עצומים של thymocytes בו זמנית לעבור אפופטוזיס מלווה דור 5'PO 4 פעמיים גדיל הפסקות, דמיינו ידי תיוג האנזים מבוסס. הפסקות אלה ממוקמים בפריפריה גרעיני, ויצרו טבעת בצורת דפוסי. כל הגרעינים הסלולר הם דמיינו ידי counterstaining עם DAPI (כחול פלואורסצנטי).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בסרטון הזה, אנו מראים כיצד להרכיב ולהשתמש כפול תיוג DNA חיישן נזק. החיישן הוא מכונה מולקולרית מונע על ידי מנוע ביו מולקולרית, וירוס המקודד חלבון VACC Topo מקושר עם מרכיבים מלאכותיים. הפיתוח המוצג מדגים גישה ביו מופעלת הדוגלת בהתאמת מבנים ביולוגיים, ארכיטקטורות בפועל חלקים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענק R01NS062842 מן המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים הלאומיים לבריאות (VVD) וכן על ידי מענקים R21 NS064403 מן המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות ערה (VVD) ו R21 EB006301 המכון הלאומי ביו הדמיה Bioengineering, המכונים הלאומיים לבריאות (VVD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

  1. קסילן
  2. 80 ו - 96% אתנול.
  3. פתרון 2% אלבומין בסרום שור (BSA) במים מזוקקים.
  4. Oligonucleotide 1: סיכת ראש כפולה, כפולה עם שכותרתו והעמסת ו tetramethylrhodamine:

5'-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC tta ACG CAT R AT מהפקולטה לרוקחות אוכלים TT-3 "; F - FITC-DT; R - Tetramethylrhodamine-DT. אחרים אדום העביר fluorophores כגון BODIPY TR, rhodamine או טמרה יכול לשמש במקום tetramethylrhodamine כמו R.

לחילופין אתה יכול להשתמש 2 oligonucleotide -. בודדת מכבנה פעמיים שכותרתו עם והעמסת (לצורך זיהוי של סוג אחד של הפסקות DNA (DNase מסוג II בלבד) בדיקה חד fluorophore נושאי משמעותית פחות יקר נוח בכל אחת סוג לשבור DNA היא להיות מתויג: 5'-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC tta ACG CAT ATG CGT T-3 "; F - FITC-DT

  1. Oligonucleotide 3. בלאנט, הסתיים rhodamine שכותרתו מכבנה להגברת האות של קשירת באתרו עם האנזים T4 DNA: 5'-CTA מהפקולטה לרוקחות אוכלים GAC C R G GTC TAG CGC-3 "; R - Tetramethylrhodamine-DT
  2. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC Topo) - 3000 U / μL (טכנולוגיות Vivid). בניסויים הראשונים השתמשנו pmoles 215 (7.1 מיקרוגרם) של Topo VACC לכל μL 25 כל תמהיל התגובה. עם זאת, ריכוז topoisomerase ניתן לצמצם באופן משמעותי ללא איבוד של רגישות. אנחנו אחר כך השתמשו בכמות פחותה של ארבע פעמים VACC Topo לכל סעיף (1.76 מיקרוגרם ב μL 25 של תערובת התגובה לכל סעיף) עם תוצאות דומות. צמצום כמות האנזים עד 880 ננוגרם (ב μL 25 של תערובת התגובה) הביא אות חלש של 8.8 ננוגרם VACC Topo הפיק שום אות לזיהוי.
  3. T4 DNA האנזים 5 U / μL (Roche). זו הכנה האנזים מרוכז מאוד ונותן את האות הטוב ביותר בתנאי הניסוי שלנו.
  4. 10 x חיץ תגובה עבור האנזים T4 DNA: 660 mM טריס-HCl, 50 מ"מ MgCl 2, dithioerythritol 10 מ"מ, 10 mM ATP, ה-pH 7.5 (20 ° C) (Roche). ATP במאגר התגובה הוא נהרס בקלות במחזורים חוזרים של הפשרה, הקפאה. Aliquot חיץ מנות קטנות μL 15-20 ולאחסן ב - 20 ° C. השתמש פעם אחת.
  5. 30% (w / v) פתרון של PEG-8000 (Sigma) במים bidistilled. 15% PEG-8000 בתמהיל תגובה מאוד מגרה את זיהוי, להגדיל את ריכוזי יעיל של המרכיבים שלה על ידי הרחקה נפח.
  6. Proteinase K (Roche) 20 מ"ג / מ"ל ​​מניות פתרון במים מזוקקים. חנות ב - 20 ° C. בשנת פתרון התגובה 50mg/mL להשתמש ב-PBS, מוכנים מהמלאי. אל חוזר.
  7. Vectashield עם DAPI (וקטור מעבדות).
  8. ביקרבונט חיץ נתרן: 50 מ 'NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8.2.
  9. זכוכית 22x22mm או 22x40mm או coverslips פלסטיק. Coverslips פלסטיק עדיפים במהלך התגובה, כפי שהםמחדש קל להסיר הסעיף.

References

  1. Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).
  2. Schuldt, A. Dynamic Pol expeditions. Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).
  3. Urry, D. W. Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).
  4. Schneider, T. D. Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines. J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).
  5. McClare, C. W. Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms. J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).
  6. Spirin, A. S. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).
  7. Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex. Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).
  8. Drexler, K. E. Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , Wiley. New York. (1992).
  9. Freitas, R. A. Nanomedicine: basic capabilities. , Landes Bioscience. Austin. (1999).
  10. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).
  11. Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16, 4599-4614 (2011).
  12. Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection. Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).
  13. Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis. J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).
  14. Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells. Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).
  15. Jones, R. A. L. Soft Machines: Nanotechnology and life. , Oxford University Press. USA. (2007).
  16. Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering 59DNA 5 OH5 PO4 DNAtopoisomerase vacciniaDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved