טפיל מושרה מונע גנטית אוטואימונית מחלות לב Chagas דגם עוף

Summary

חיסון של Trypanosoma cruzi ביצים פוריות שקדמו הדגירה הופך kDNA טפיל minicircle אינטגרציה בגנום העובר תאים. הכלאה מגלה העברה אנכית של המוטציות על הצאצאים. KDNA משתלב קידוד אזורי ב כרומוזומים מספר התרנגולות למות ממחלות לב דלקתית אוטואימונית.

Abstract

את cruzi Trypanosoma זיהומים חריפים שנרכשו בינקות ובילדות נראה ללא תסמינים, אך כשליש מן המקרים שנדבקו במחלה כרונית להראות Chagas עד שלוש שנים או במאוחר. אוטואימוניות והתמדה טפיל מתחרים תיאוריות כדי להסביר את הפתוגנזה של המחלה Chagas ^{1, 2.} לתפקידים שונים שיחק על ידי התמדה טפיל אוטואימוניות במחלה Chagas לנו לחסן ט cruzi בחדר אווירה של ביציות מופרות. המערכת החיסונית היא עוף בוגר מחסום ביולוגי חזק נגד ט ' cruzi ואת הזיהום הוא נמחק על התפתחות המערכת החיסונית שלה עד סוף השבוע הראשון של הצמיחה ^3. האפרוחים הם טפיל ללא ב הבקיעה, אבל הם שומרים משולב טפיל המיטוכונדריה kinetoplast DNA (kDNA) minicircle בתוך הגנום שלהם המועברים לצאצאים. תיעוד של אינטגרציה kDNA minicircle בגנום עוף הושג על ידי טארגeted ראש זנב PCR, הכלאות הדרום, שיבוט, וכן רצף ^{3, 4.} KDNA minicircle ואינטגרציות הקרע מסגרות קריאה פתוחות עבור שעתוק גורמים במערכת החיסון, phosphatase (GTPase), adenylate cyclase ו phosphorylases (PKC, NF-kappa B activator, PI-3K) הקשורים לפיזיולוגיה התא, צמיחה, והבחנה ^{3, 5 - 7,} ופונקציות גנים אחרים. דלקת שריר הלב חריפה עקב דחייה של סיבי הלב היעד על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים effectors היא לראות את העופות שעברו מוטציה kDNA, מראה cardiomyopathy דלקתית דומה לזה ביטוי המחלה Chagas האדם. יש לציין כי אי ספיקת לב, חולשה בשרירי השלד נמצאים עופות בוגרים עם הקרע kDNA של גן הדיסטרופין על כרומוזום 1 ^8. שינויים דומים genotipic קשורים להרס רקמות שביצע effectors CD45 +, CD8γδ +, CD8α לימפוציטים. כך זה יכול לגרום זיהום protozoan מחלה אוטואימונית מונע גנטית.

Protocol

1. צמיחה של טפילים

1. גדלים צורות trypomastigote של ט ' cruzi ברניקי ו-β-galactosidase להביע Tulahuen ט cruzi MHOM/CH/00 C4 בתא השריר Murine (L6) טיפח בינוני Dulbecco חיוני מינימלי עם FSB של 10%, 100 IU / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 250 ננומטר L-glutamin (pH 7.2), 5% CO ₂ ב 37 ° C. חופשי שחייה את trypomastigotes במדיום supernatant שימשו לחסן ביצי תרנגולת.
2. לגדול שושנת יריחו braziliensis (LB) LTB300 המניות גדל DMEM עם FBS 20%. Promastigote Lb טופס בשלב גידול אקספוננציאלי שימש מחסן ביצים ^9.

2. טפיל הרכבת חיסון של ביצי תרנגולות מופרות

1. לחסן השעיית 100 ט cruzi trypomastigotes ב μl 10 של המדיום תרבות דרך החור 2 מ"מ קוטר פגז לתוך הביצה על גבי תא האוויר הבמהצילומי ביצים פוריות. הפלישה ושכפול של טפילים אלימים לתוך תאים עובריים מוצגים S1 וידאו. בקבוצת הביקורת הם כדלקמן: א) תרנגולות שליטה, ב) ביצים שליטה מדומים מקבלת 10 μl של המדיום תרבות, ג) שלב צילומי ביצים פוריות מחוסן עם ההשעיה של 100 promastigotes ליברות ב 10 μl של המדיום תרבות ט '. cruzi ו Lb שייכים למשפחת kinetoplastid. בהתאמה, פרוטוזואה אלה גדלים חופשי בציטופלסמה או vacuole parasitophorous של תאים המארח ^10.
2. לאטום חורים עם דבק.
3. דגירה ט cruzi נגועים ביצים דגימות שליטה מדומה נגוע ב 37.5 מעלות והלחות 65% במשך 21 ימים.
4. לשמור על הגוזלים הבוקעים בחממה במשך 24 שעות ולאחר מכן ב 32 ° C במשך שלושה שבועות.

3. דוגמאות קבלת להפקת DNA

1. כדוריות דם היקפיים mononuclear התקבלו תרנגולות:)בקעו ט ביצים cruzi מחוסן, ב) שולטת ג) ולועג לו בעת ובעונה שקיבלו 10 μl של המדיום תרבות, ד) בקעו מן הביצים ליברות מחוסן, תאים דם לבנים עופות מעובדים להפקת DNA על פי פרוטוקול סטנדרטי עם ^11.
2. תמצית ה-DNA גם זרע שנאספו תרנגולים, ומן ביציות unfertile (<5 מ"מ) שנאספו התרנגולות בקעו מן הביצים מחוסן עם ט ' cruzi, ומן התרנגולות בקעו מן הביצים בקרה ^{3, 4.}
3. חלץ kDNA מ ט cruzi epimastigote טפסים, כמו כן, מן promastigotes LB, כמתואר במקומות אחרים ^9.

4. Primers ו בדיקות משומשים

פריימרים המשמשים את ה-PCR amplifications ותנאי תרמית מוצגים בטבלה 1.

בדיקות המשמשים הכלאות למחוק הדרום היו:

1. Wild-type minicircle (~ 1.4 KB) רצפים פוריfied מ ט cruzi epimastigote צורות;
2. Minicircle שברים (362 נ"ב) מתקבל על ידי NSI אני מעכל של kDNA wild-type;
3. הגרעין DNA (nDNA) רצף שחוזר על עצמו (188 נ"ב) מתקבל על ידי הגברה של DNA הטפיל עם Tcz1 / 2 פריימרים. הבדיקות היו מטוהרים מ 1% agarose ג'ל ^3.
4. Wild-type minicircle (~ 0.820 קילו) רצפים של promastigotes פאונד.

5. ניתוח ה-PCR

1. הפעלה רגילה הליך PCR עם DNAs הגנומי של אפרוחים נגועים בקרות נגוע ו ללעוג באמצעות ט cruzi nDNA Tcz1 / 2 ¹² ו kDNA s35/s36 ¹³ פריימרים. כמו כן, להפעיל PCR עם DNAs הגנומי של התרנגולות שבקעו מן ליברות נגוע ביצי באמצעות protozoan ספציפיים Lb3 ו Lb5 primers (טבלה 1).
2. הפוך את תערובת התגובה עם דנ"א 100 תבנית נג, 0.4 מיקרומטר של כל זוג פריימרים, 2 U Taq פולימראז ה-DNA, 0.2 מ"מ dNTP, ו 1.5 מ"מ MgCl _{2 בנפח 25 μL הסופי.}
3. הגדרת תוכנית thermocycler עבור 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורים של 30 שניות על 95 ° C/30 שניות על 68 ° C / 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס עם סיומת 5 דק 'לפני הגמר קירור.
4. לנתח את מוצרי הגברה ב 1.3% agarose ג'ל, אשר מועבר קרום ניילון חיובי טעון (GE מדעי החיים) בשיטת בסיסי על הכלאה עם בדיקות ספציפיות שכותרתו עם _[α-32-P] dATP אקראי באמצעות סימון פריימר Kit (Invitrogen , Carlsbad, CA).

6. כתמים הדרום גנומית

1. השתמש MBO אני ו / או עם RI אקו (Invitrogen) אנזימים לבצע חתכים בודדים minicircles משולבים דגימות DNA של רקמות הגוף.
2. ה-DNA תקציר מתרנגולות בקרה נגוע ומ התרנגולות בקעו מן הביצים מחוסן עם ט ארסית cruzi יוצר.
3. נושא מעכל מה-DNA של ט ' cruzi ודגימות הבדיקה עוף על אלקטרופורזה ב 0.8% agarose ג'ל ב 50 V לילה ב 4 ° C.
4. העברת להקות ה-DNA מופרדים ל קרום ניילון במטען חיובי.
5. להכליא את להקות ה-DNA עם התווית רדיו kDNA בדיקה.
6. לשטוף את הממברנה פעמיים במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס עם 2X SSC ו -0.1% SDS, פעמיים במשך 15 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כל אחד עם 0.2X SSC ו -0.1% SDS, ו autoradiograph לתקופות משתנות של זמן.

7. ממוקד ראש זנב PCR

1. להשיג הגברה של kDNA minicircle משולב לתוך הגנום עוף בטכניקה זנב PCR שונה, המשלבת primers kDNA עם פריימר ספציפי קובע ² ב 3 הליכה, במחזורים מקוננים PCR, כפי שמוצג באיור 1.
2. ראשי מחזור: התגובה כוללת 200-DNA תבנית נג, 2.5 מ"מ MgCl _2, ו -0.4 מיקרומטר של kDNA primers (S34 או S67), 0.2 מ"מ, 2.5 dNTPs U פלטינום Taq (Invitrogen, קרלובי וארי, Cא). השתמש primers kDNA בשילוב עם 0.04 מיקרומטר של GG primers (Gg1 כדי Gg6, טבלה 1), בנפרד. הגדר בטמפרטורות 57.9-60.1 מעלות צלזיוס למשך kDNA primers ו 59.9-65.6 מעלות צלזיוס למשך פריימר CR-1. שים לב כי טמפרטורות אלו גבוהות יותר מאשר אלו (~ 45 ° C) דרוש primers התדרדרה שרירותיים המשמשים ¹⁰ זנב PCR. השתמש טמפרטורה מחזורים (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA) המתואר במאמר הקודם ^3.
3. מחזור משני: מדולל מוצרי ה-PCR ממעגל 1:40 הראשי (V / V) במים. kDNA primers S35 ו S35 antisense החליף הקודמים, יחד עם primers הגנרלגוברנמן אותם.
4. מחזור שלישוני: מדולל מוצרי ה-PCR ממעגל 1:10 משני (V / V) במים ולשלב primers הגנרלגוברנמן עם antisense S67 או S36, בנפרד.
5. לשכפל את מוצרי ה-PCR מחזור שלישוני: המשובטים ישירות וקטור T pGEM קל (Promega, מדיסון, WI)תוצרי ההגברה האחרון להכליא עם kDNA בדיקה.
6. בחר שיבוטים על ידי הכלאה עם החללית kDNA ורצף.
7. אמת tpTAIL-PCR בתערובת של PG 300 של kDNA מ ט cruzi עם נ"ג 200 של ה-DNA של ציפורים שליטה אף פעם לא נחשף kDNA. מחזורי טמפרטורה הגברה זהים המשמש DNA הציפורים של הבדיקה.

8. מרפאת Chagas מחלות ביטוי

1. מעקב אחר הגדילה וההתפתחות של התרנגולות בקעו ט cruzi נגוע ביצים של פקדים בריא בקעו מן הביצים הלא נגועים היומי תמותה שבועי גילויי המחלה.
2. זיהוי ליקויים קליניים עופות אלה (איור 2) ולעשות electrocardiograph (ECG) הקלטות על מנת להעריך את הצירים חשמל, קצב הלב ואת בקצב הלב ^3.
3. נושא kDNA-מוטציה ושולטת תרנגולות חודשיים להקלטות של א.ק.ג. מוגבר חדרית האו"םipolar מוביל AVF (רגל שמאל), AVL (יד שמאל), ו - AVR (יד ימין), וכדי להעריך את הסטייה של ציר חשמלי ממוצע שמאלה, וזה מרמז על הגדלה לב ^3.

9. הפתולוגיה ואת Immunochemical ניתוח

1. שיא לב ומשקל האינדקסים הגוף לאחר מותם הטבעי של תרנגולות kDNA מוטציה (איור 3). להשיג אינדקסים גם תרנגולות שליטה של ​​גיל ומין זהים.
2. לקחת קטעים מתוך הלב, הוושט, המעי, שרירי השלד, הריאות, הכבד, הכליות.
3. תיקון רקמות שנאגרו 10% פורמלין (pH 7.4), להטביע ב פרפין וחותכים ל -4 חלקים עבים מיקרומטר עבור Hematoxylin-Eosin (he) מכתים וניתוח היסטולוגית (איור 3).
4. קציר ולחצות רקמות מעוברים בקעו מן הביצים מחוסן עם טפילים המבטאים β-galactosidase, ובכפוף X-גלאון הכתם. ⁹
5. לתקן את החצי השני של רקמות העובר ב 10% פורמלין, pH 7.4 ולהמשיך כמו בשלב 9.3.
6. גזור 4μm פרפין דק מוטבע בחלק רקמות לעלות בשקופית זכוכית לבדיקה מיקרוסקופית.
7. סעיפים דגירה מראה X-גלאון מוכתמים תאים כחולים עם אדם chagasic antiserum (1:1024 דילול) נגד נגד ט ' cruzi אנטיגן.
8. לשטוף חלקים הרף עין עם PBS, pH 7.4, 5 דקות כל אחד.
9. כתם כחול תאים ברקמות העובר על ידי הדגירה 2 עם ארנב fluorescein-מצומדות נגד לנוגדנים אנושיים.
10. לשטוף חלקים עם PBS (שלב 8), הר עם coverslip ולבחון את התאים בצבע תכלת, ירוק עד בבדיקה תחת אור UV באורך גל 502 ננומטר, 200x הגדלה, עבור colocalizing ט cruzi בתאים עובריים.

10. החיסון פנוטיפ מערכת תאים הפצעים לב

1. החיסון פנוטיפ effectors תאים בסעיפים רקמות של הלב של kDNA חיובי ומתוך שליטה kDNA שלילי תרנגולות.
2. מניחים את השקופיות עםרקמות בחלק מוטבע פרפין ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להמיס שעווה הקודם להגשת בארבעה שוטף ב קסילן 100% עד 70% ואז באתנול PBS מוחלטת 5 דקות כל אחד.
3. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים, אוויר יבש, לטיפול עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים (fluorescein או R-phycoerythrin-מצומדות נוגדנים חד שבטיים) המתקבלים SouthernBiotech, בירמינגהם, אל.
   1. השתמש בעכבר נגד עוף Bu-1 (Bu-1 _A ו-bu-1 אללים _B, מר 70-75 KDA) מאב AV20 להכיר הקובע חד צורתי על אנטיגנים תא B של עופות טהורים.
   2. השתמש בעכבר נגד עוף CD45, איג isotype IgM1 κ ספציפי התימוס עוף תאים השושלת (190 מר החלופה 215-KDA).
   3. השתמש בעכבר נגד עוף TCRγδ + (מר 90-kDa heterodimer) מאב ספציפי התימוס תאים התלויים + CD8α טי.
   4. השתמש בעכבר נגד עוף מב CD-8 ספציפית לשרשרת עוף α (מר 34 KDA) מזהה הדואר CD8 התאים thymocytes, הטחול, הלב ורקמות אחרות.
   5. השתמש נגד עוף KuL01 העכבר כדי לזהות באופן בלעדי מונוציטים / מאקרופאגים של מערכת תא בלען.
4. לשטוף את השקופית שלוש פעמים עם 0.1 מ 'PBS, pH 7.4, 5 דקות אחרי כל דגירה עם נוגדנים נגד פנוטיפ ספציפי 90 דקות בתא לחות.
5. להרכיב את השקופית עם גליצרין שנאגרו לבחינה תחת מיקרוסקופ אור ניאון עם מסנן פליטה באורך גל 567 ו 502 ננומטר, בהתאמה, על מנת לזהות תאים הקרינה, שכותרתו אדום וירוק (איור 4).

11. ניתוח נתונים

1. השתמש הגנום עוף מסד נתונים ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) עבור ניתוחים BLASTn ברצף.
2. השתמש מערכים CLUSTALW לקבוע דואר ערך ציוני.
3. מעסיקים GIחזור על RI אלגוריתם מיסוך צנזור ( http://girinst.org/censor/index.php ) עבור לוקליזציה של סוגים שונים של חזרות של רצפים chimeric.
4. מעסיקים הכניסה Kinetoplastid ורצף מחיקת חיפוש כלי (KISS) לזהות gRNAs פוטנציאליים רצפי kDNA, בעזרת WU-Blastn-Modified-מטריקס ^3.
5. השתמש ט cruzi רצפים http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-~~HEAD=NNS 2164-8-133 s1.fas לחפש ב-gRNAs ב kDNA מארח מפלצות ה-DNA. 11.6 t) סטודנט השימוש שעשה ואת Kolmorov-סמירנוב בדיקות, בהתאמה, כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין הסטיות של צירים חשמליים בין הלב / הגוף אינדקסים משקל שהושגו בין קבוצות הניסוי והבקרה, וכן לזהות יחס התמותה הבדלים משמעותיים בין קבוצות של תרנגולות בקעו מ ט אני cruzinoculated ביצים מן הביקורת.

12. נציג תוצאות

חיסון של 100 ט ארסית trypomastigotes cruzi לתוך תא האוויר של ביצי תרנגולת הפוריים אינו מפחית באופן משמעותי את היחס בין הגוזלים שבקעו חיים. כ 60% בוקעים הגוזלים בריאים 40% עשוי לעבור עיבוי העובר או מוות העובר על הבקיעה. הגוזלים ששרדו לשמור על רצף minicircle kDNA משולב בגנום. עם זאת, צפוי כי מספר הגוזלים ימותו עם cardiomegaly וכישלון בשבועות לאחר הבקיעה. הגוזלים הנותרים יגדל מבוגרים בריאים כלפי חוץ. בכל שלבי החיים שחולצו מן ה-DNA בתאי הדם שלהם mononuclear תניב הגברה PCR של kDNA, אבל לא nDNA. ממוקד ראש הממשלה זנב PCR ^{3, 4} המוצרים משובטים ואת רצף יראה kDNA minicircles משולבים בעיקר קידוד אזורי macrochromosomes 1 עד 5. את התרנגולות מראה kDNA מרובים אניntegrations לתוך גנים קידוד עבור צמיחת תאים והתמיינות, ויסות מערכת החיסון גורמים במערכת, ותיקון ה-DNA הם מועמדים לעבור דחיית רקמות היעד עצמי (איור 3). כך, למשל, עוף מראה מוטציה kDNA עם קרע של גן הדיסטרופין (איור 5), קידוד חלבון זה נקשר cytoskeleton אל קרום התא, הוא מועמד לפתח cardiomyopathy דלקתית כישלון אוטואימוניות.

שינויים אלה הגנומי לא נראים הגוזלים שבקעו מן הביצים ליברות נגועים. ישנם הבדלים בין ט ' cruzi ו Lb kDNA minicircles, ט ' cruzi K-DNA minicircle בממוצע 1.4 קילו עם מבנה באזור 4 משתנה (VR) וביניהם לפי אזורים המשתמרים (CR) כל המציגים CSB1, CSB2 ו CSB3 אזורים, שבהם CA-DNA עשיר כפוף נחשבים לאתרים ספציפיים חניכה של שכפול, שעתוק, רקומבינציה, וכן להעברת דנ"א לרוחב , 4. וחשוף, Lb kDNA minicircle (גודל ממוצע 820 נ"ב) מכיל CR אחד ואחריו VR. CR יש שימור CSB1 (GGGCGT) ו CSB2 (CCCCGTTC) בלוקים, שהם שונים מאלה של ט ' cruzi minicircles ^{15, 16, ו 17.} בהתחשב בכך Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) מראה 12 הומולוגיה NTS ל ט cruzi מתקבל על הדעת כי גם Lb kDNA minicircle המשלבת בתדירות נמוכה יותר, אשר לא יכול להיות גלוי על ידי טכניקות בשימוש, או שהוא יכול, אולי, לא להשתלב בגנום עוף בכלל.

צבע יסוד	יעד ה-DNA	רצף	אני *
S 34	ט cruzi kDNA	5 "ACA ACC המרכז לאמנות עכשווית CCA ATC GAA CC 3"	57.9
S 67	טcruzi kDNA	5 "GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3"	60.1
S 35	ט cruzi kDNA	5 עטא ATG TAC GGG (T / G) GA גת GC 3 "	59.4
S 36	ט cruzi kDNA	5 "GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3"	57,9
Lb3	Lb kDNA	5 "GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3"	55.9
Lb5	Lb kDNA	5 "CTA ATT GTG CAC GAG GGG G 3"	61.4
GG 1	גאלוס גאלוס	5 'AGC TGA TCC ט.א.א. AGG החטיבה AGC 3 "	60.1
Gg2	גאלוס ג	5 "CTG AGC CTC TGCTTT GAA 3 "	56.8
Gg3	גאלוס ג	5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3 "	60.1
Gg4	גאלוס ג	3 "GCT CTG CCT tta GGA TCA GCT 5"	64.2
Gg5	גאלוס ג	3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5 "	62.3
Gg6	גאלוס ג	3 "CTG tta GCA TGA GGC TTC ACA 5"	60.4

מספרים ראשוניים לוח 1. משמש את Amplifications ה-PCR. * אני = חישול בטמפרטורה הממוצעת ° C.

באיור 1. אסטרטגיה זנב PCR TP המשמשים לאיתור Trypanosoma שילוב cruzi kDNA לתוך הגנום גאלוס גאלוס. א) רצף chimeric עם שבר של kDNA minicircle המשתמרים (כחול כהה) לבין משתנה (תכלת) באזורים המשולבים לוקוס NW_001471687.1 על כרומוזום 4 (AY237306) של הגנום עוף ¹⁰ (ירוק) היה רגיל לקבל את המארח פריימר קבוצות ספציפיות (Gg1 כדי Gg6). ב) זנב-PCR את amplifications TP יזמו (מחזור ראשוני) על ידי חישול של minicircle ספציפיים S34 או S67 primers בשילוב עם עוף ספציפיים Gg1 כדי Gg6 primers. מוצרים מדולל בתנאי תבנית מחזור המשני S35 (במובן / antisense) primers ואת שילובים של primers הגנרלגוברנמן. במחזור שלישוני דילול של מוצרים משניים היה נתון הגברה עם kDNA S36 או S67 primers antisense בשילוב עם צבע יסוד GGs. ג) מוצרים אלה הגברה הופרדו 1% agarose ג'ל והועברו קרום ניילון, הכלאה עם החללית kDNA ספציפי. דוגמאות המציגות איתות חיובי שימשו שיבוט כדי לקבוע את נקודת האינטגרציה. השילובים של kDNA ממוקד Gg1 כדי Gg6 מוצגים על גבי ג'ל. התגובות ברצף ה-PCR מוגבר kDNA-מארח היעד רצפי DNA עם kDNA minicircles (כחול) את רצף העופות (ירוק). (התפרסם מ PLoS מוזנחת מחלות טרופיות ^3).

איור 2. הביטויים הקליניים של תפקוד הלב לקוי של עוף 9 חודשים בת מהונדסים גנטית על ידי שילוב של kDNA המיטוכונדריה minicircle מ ט cruzi. חמצון דם לקויה של עוף kDNA המיטוכונדריה מוטציה מראה כמה ניגודים מסרק במסרק סגול אדום בהיר שליטה 9 חודשים בת chicken ללא נזק ללב. (שונה מ PLoS מוזנחת מחלות טרופיות ^3).

איור 3. גרוס מיקרוסקופית פתולוגיה גאלוס גאלוס עם מוטציות kDNA. א) ב cardiomegaly חן 9 בן חודש שמת מדום לב. ב) בקרת הלב של חן 9 חודשים בת noninfected. ג) דחיית לתאי לב היעד על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים: יחידת דחייה מינימלית עם lyses של התאים היעד על ידי לימפוציטים החיסונית מתואר (מעגל). ד) בקרת לב היסטולוגיה (השתנה מ PLoS מוזנחת מחלות טרופיות ^3).

איור 4. ניתוחים Immunocytochemical של תאים של המערכת החיסונית שחדר הלב של עוף kDNA-מוטציה שמוצג באיור 3. א) CD45 + הלימפוציטים זיהו (חיצים) בלב להליה על ידי נוגדנים phycoerythrin שכותרתו חד שבטי ספציפי. ב) CD8 + γδ לימפוציטים החיסונית (חיצים) המעורבים הרס חמור של הלב. ג) שפע CD8α + בתאי T הנמצאים נגעים קשים עם lyses סלולריים לב. מוסיף מראים חוסר תאים של המערכת החיסונית של הלב השליטה נגוע עוף (השתנה מ PLoS מוזנחת מחלות טרופיות ^3).

איור 5. Chagas כמו קרדיומיופתיה דלקתית מורחבים ב צאצאים F2 עם שילוב kDNA בגן הדיסטרופין. א) לב מורחבים ב עוף 10 חודשים בן תופס את רוב חלל בית החזה (הלב משקל = 16 גרם). ב) כהים תאים עגולים mononuclear מחלחל והורס שריר הלב של חן kDNA-מוטציה. ג) לב בגודל רגיל (7 משקל גרם) של עוף 10 חודשים בת שליטה. D) היסטולוגיה רגילה של הלב עוף שליטה. (שונה מ PLoS חוג מוזנחתאל מחלות ^3).

איור 6. השוואתי פתולוגיה עוף kDNA מוטציה ועל המחלה Chagas האדם. א) קשה לב דלקת שריר הלב היעד lyses סלולריים עוף kDNA-מוטציה. ב) דלקת שריר הלב חמורה סלולריים lyses היעד על ידי לימפוציטים חיסון במקרה של מחלת לב Chagas. ג) דחיית לתאי לב על ידי לימפוציטים חיסוניים עוף kDNA-מוטציה. ד) דחיית לתאי לב על ידי לימפוציטים חיסוניים למחלות Chagas האדם. מוכתמת על ידי Hematoxilin ו Eosin. (שונה מ Memórias לעשות Instituto אוסבלדו קרוז, ריו דה ז'נרו ^14).

Discussion

בניגוד ליונקים רגישים כל החיים ט ' זיהומים cruzi, תרנגולות הם מגיבים ט cruzi זיהום. היתרון העיקרי של מערכת מודל עוף היא חיסול הזיהום מוקדם בפיתוח של מערכת החיסון העוברי. לכן, ה-DNA הטפיל היחיד שנותר בתוך הגוף עוף משולב ב לוקוסים מספר.

השימוש כמות אופטימלית של ט ארסית cruzi trypomastigotes לחסן ביצה פורייה היא צעד קריטי לקראת קבלת שילוב של minicircles kDNA לתוך הגנום עובר עוף. שיעור הבקיעה הגוזלים חי ביצים מחוסן עם 100 trypomastigotes הוא פי ארבעה גבוה יותר מזה שהושג עם 500 טפילים. יש להקפיד לחסן את ההשעיה טפילים μL 10 בינוני התרבות לתוך תא האוויר ביצה. לא אמורה להיות דליפה של חלבון ביצה. בתנאים אופטימליים, זיהום טפילי תאיים מתרחש Wiדקה כמה שעות לאחר כפל הדגירה ואת הטפיל בתוך התמורה תאים המארח למשך שבוע, לאחר מכן את הזיהום מסולק על ידי חסינות מולדת. שילוב kDNA דורש זיהום חיים, ואת הרכבה של minicircles עירומים לתוך ביצי תרנגולת הראשונים העובר אינו תוצאה של שילוב. KDNA חיובי העוברים והבקרות יש שוכנו בתנאים מבוקרים על 37.5 מעלות צלזיוס והלחות 65%. הגוזלים מוחזקים בכלובים במשך שבועיים ב 33 ° C טמפרטורת החדר. לאחר מכן את התרנגולות מוחזקות בכלובים תלויים על מתלים נפרדים ב -1.5 מטר רוחב המעברים בחדר על 22 מעלות צלזיוס עם אוויר מסונן לחץ חיובי תחת עייפות מתמדת כדי להבטיח את תנאי הרווחה של בעלי חיים. המבוגרים נמאס עוף האוכל ושותה מים זורמים ראויים לשתייה להשיג צמיחה בגרות מלאה, להטיל ביצים על חמישה חודשים של גיל. ותחזוקה של נהלים היגיינה חיוניים שחזור של תוצאות בעבודה עם ט ' cruzi מחוסןבתוך ביצי תרנגולת פוריים.

במערכת עוף מודל T. זיהומים cruzi הושרשו לאחר פיתוח של מערכת החיסון בתקופה המוקדמת של צמיחה לעובר. בנוסף להיותו זיהום חינם, הגוזלים הבוקעים מן ט cruzi מחוסן ביצים, בחוסר של נוגדנים ספציפיים, סובלניים כדי אנטיגנים הטפיל. דחייה של לב תאים היעד ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים (יחידת דחייה מינימלית, איור 3) היא לראות את התרנגולות kDNA-מוטציה המראים שינויים גנוטיפ פירוט של מעקב החיסונית ^3. את שונה genotypically מתאי T להציג דחייה מואצת של רקמות עצמי בגוף. האתר הנגע העיקרי הוא הלב, שהוא סימן ההיכר של המחלה Chagas. המעבר מ פיזיולוגי (מעקב) למצב physiopathologic נתפסת עוף kDNA-מוטציה מראה clonally ריבוי לימפוציטים ציטוטוקסיים ^3.

Tהמודל שלו transkingdom המערכת מציגה טפיל-Induced, גנטית מונע מחלה אוטואימונית (איור 6), הנובע שינויים הגנום של ט ' cruzi kDNA minicircle ואינטגרציות. שינויים אלה לא נראים הגוזלים שבקעו מן הביצים LB-מחוסן.

תופעה זו עולה כי הטיפול הניסיוני של קרדיומיופתיה אוטואימונית דלקתית kDNA למוצרי מוטציה תרנגולות עשויים לדרוש תרופות דיכוי של מח העצם של אבי פנוטיפ T-cell ספציפיים חדירה שריר הלב, וכן השתלת מח עצם בריא histocompatible כדי למנוע את דחיית רקמות עצמית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Taq פולימראז ה-DNA רקומביננטי	Invitrogen	11615-010
פלטינום Taq DNA פולימראז	Invitrogen	10966-030
Random סימון primers DNA מערכת	Invitrogen	18187-013
Eco RI	Invitrogen	15202-021
MBO אני	Invitrogen	15248-016
סט dNTP, פתרונות 100mm	28-4065-51
Amersham Hybond - N + - חתול n.	GE Healthcare	RPN303B
PlasmidPrep מיני ספין ערכת	GE Healthcare	28-9042-70
NSI אני	Sigma-Aldrich	R5884 1KU
, ה-DNA מלח נתרן דגים זרע	AMRESCO	0644-10G
נגד עוף עכבר bu-1B	SouthernBiotech	8370-02
עכבר נגד עוף CD45	SouthernBiotech	8270-08
עכבר נגד עוף TCRγδ	SouthernBiotech	8230-08
עכבר נגד עוף CD8α	SouthernBiotech	9220-02
עכבר נגד עוף מונוציטים / מקרופגים	SouthernBiotech	8420-02
MyCycle Termocycler	Bio-Rad Laboratories	580BR 5501