In vivo Macrophage ההדמיה באמצעות חומר ניגוד ממוקד MR להערכת אורך של דלקת מפרקים ספיגה

Summary

אנו מדגימים כיצד לבצע מקרופאג MR הדמיה באמצעות חומר ניגוד פאראמגנטי ultrasmall (USPIO) בדלקת מפרקים ספיגה, המאפשרת ראשוני ואורכים In vivo הערכה בלתי פולשנית של חדירת מקרופאגים והערכת יעילות טיפול.

Abstract

המקרופאגים הם מפתח תאים בייזום, הפיתוח והרגולציה של התגובה הדלקתית לזיהום חיידקים. המקרופאגים מגויסים באופן אינטנסיבי ויותר ויותר במפרקים ספיגה מהשלבים המוקדמים של זיהום והחדירה אמורה לסגת ברגע ההסרה יעילה של פתוגנים מתקבלת. היכולת לזהות בפעילות מקרופאג vivo במפרק נגוע יכולה לכן לספק שני יישומים עיקריים: זיהוי המוקדם של קרום מוח חריף וניטור של טיפול.

In vivo גילוי לא פולשנית של מקרופאגים ניתן לבצע עם תהודה מגנטית באמצעות חלקיקי ברזל כגון תחמוצת ברזל פאראמגנטי ultrasmall (USPIO). לאחר מתן intravascular או intraarticular, USPIO הם phagocytized במיוחד על ידי מקרופאגים הופעל, ו, בשל התכונות המגנטיות שלהם, לגרום לשינויים באותות ברקמות המציגות חדירת מקרופאג. Quantitativההערכה של דואר לחדור אינה ריאלי, כפי שהאזור עם אובדן אות (מספר פיקסלים כהים) שנצפה בתמונות שיפוע הד MR לאחר הזרקת חלקיקים מתואמת עם כמות הברזל בתוך הרקמה, ולכן משקפת את מספר התאים USPIO טעונים.

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבצע הדמיה באמצעות מקרופאג USPIO המשופרת MR הדמיה במודל חיה של דלקת מפרקים ספיגה, המאפשר ראשוני ואורך בהערכה לא פולשנית vivo של חדירת מקרופאגים והערכה של פעולת טיפול.

Introduction

דימות תהודה מגנטית (MRI) נחשבת לשיטת ההדמיה של בחירה עבור ההפגנה של קרום מוח מדבק עקב הרזולוציה מרחבית הגבוהה שלה ולעומת זאת רקמות רכות. שינויים באותות שנצפו ב-MRI בדלקת המפרקים T1 הנמוך ואות T2 גבוהה המשקפת את הנוכחות המוגברת של תכולת מים תאית, ושיפור ניכר לאחר מתן סוכן מבוסס ניגוד גדוליניום, התואמים את הממצאים בהיסטולוגיה בשל כלי דם מוגבר להרחבת כלי דם ואנגיוגנזה ^1. עם זאת, ה-MRI הוא לעתים קרובות מסוגל להפגין רזולוציה של זיהום במהלך טיפול אנטיביוטי כפי שניתן לראות שיפור מתמשך במפרקים של חולים עם נרפאה קליני וביולוגי ספיגה דלקת בשל התמדה של מרחב תאי מוגדל (רקמת גרעון, צלקת fibrotic) ^2. חוץ משינויים תאיים, תאים דלקתיים, כולל גיוס אינטנסיבי של מקרופאגים לחדור בצורה מאסיבית בfected משח. המקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי גם בשלב האקוטי וכרוני של זיהום חיידקי ^3. הם לגרום תגובה הדלקתית הנדרשת למיגור מיקרואורגניזמים פתוגניים, ולתאם רזולוציה דלקת, כמו דלקת הנגרמת מקרופאג נמשכת כל עוד רקמות נימקים לא יוסרו, ומונע תיקון להתחיל ^4. לפיכך, ההפחתה של חדירת מקרופאג במשח הנגוע לאחר טיפול יעיל יכולה להיות אינדיקטור אמין של הרזולוציה של הזיהום. נייד הדמיה היא הצליחה להוכיח ספציפית סלולרית חדירה בתוך רקמה פתולוגית. ספציפית מקרופאג MR הדמיה באמצעות ממוקדת חומר ניגוד נחקר באופן נרחב והוכיחה את יכולתה להפגין דלקת מפרקים או זיהום ^5-7. לאחר הזרקה לוריד, כגון סוכנים ממוקדים בניגוד כגון USPIO (תחמוצות ברזל פאראמגנטי ultrasmall) חלקיקים נתפסים על ידי תאי phagocytic כגון מקרופאגים ו,בשל התכונות המגנטיות שלהם, לגרום לשינויים באותות ברקמות המציגות מקרופאג הסתננות ^8. אורך מעקב של טיפול באלה MR אות שינויים מאפשר בהערכה לא פולשנית vivo של חדירת מקרופאג, והפחתה של טעון-מקרופגים שינויים באותות הקשורים USPIO תפגין הצלחה טיפול. מטרת דו"ח זה היא להציג כיצד לבצע מקרופאג MR הדמיה כדי לפקח על דלקת מפרקים ספיגה noninvasively על ידי הוכחת ההפחתה של חדירת מקרופאג במשח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים כרוכים בנושאי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית בית החולים האוניברסיטאי.

1. הרכבת חיסון חיידקי Intraarticular

1. לפני הזריקה, להרדים ארנבים באמצעות הזרקה לשריר של קטמין (30 מ"ג / ק"ג משקל גוף) מעורבבת עם xylazine (4 מ"ג / ק"ג) בתוך שריר שרירי הארקטור ספינאה. ודא חיות מורדמים באופן מלא על ידי בדיקה כי הם אינם מגיבים לקמצוץ כפה. פרוטוקול זה מספק הרדמה מספיקה להזרקת intraarticular של מפרק הברך. הנח את החיות מתחת למסיכת חמצן במהלך הרדמה.
2. לגלח את הברך של בעלי החיים. הכן את הברך להזרקה מזוהם על ידי 3 מגבונים מתחלפים של לשפשף povidone-יוד ואלכוהול ואחרי יישום של פתרון povidone-יוד.
3. באופן ידני לזהות את גיד הפיקה כמבנה אלסטי בהיבט הקדמי של הברך באמצעות כובע מחט סטרילית כפי שמוצג או בדיקה סטרילית.
עם שליטה חזותית ועל ידי שימוש בגישה קדמית, למקם את מחט 25 G percutaneously בברכו של כל אחד מ -12 הארנבות ישר דרך גיד הפיקה.
4. הזרק כל ברך עם 1 מ"ל של השעיה חיידקים של סטפילוקוקוס (זן נוימן) בריכוז של 10 UFC ⁶ / מ"ל. הזרקה ללא התנגדות מאשרת את מיקום intraarticular של קצה המחט.
5. לאחר הליכי הזרקה, לשמור על בעלי החיים במקור הסעה, כדי למנוע איבוד חום ולפקח על קצב נשימה על ידי התבוננות תנועה של החזה. ברגע ער, לשמור על בעלי חיים בכלובים עם גישה החופשית למזון ומים.
6. לנהל את הכאב על ידי מתן זריקה תוך שרירית של 0.1 עצירות מ"ג / ק"ג כל 8 שעות.
7. מבחינה קלינית להתבונן ארנבים בכל יום, ניטור כמויות נצרכות של מזון ומים, ירידה במשקל, טמפרטורה, והתנהגות כללית.
8. לתמונה בשלב החריף של זיהום לבצע פגישת ההדמיה MR הראשונה בהקדםכחיה מציגה ירידה במשקל משמעותית (10%); בדרך כלל זה קורה לאחר כ 2 ימים.
9. אם תרופות תוך ורידי נדרש לפני בדיקת MRI, ניתן הייתה להתקין גישה ורידי אוזניים (ראה להלן).

2. בדיקת MRI

כאשר הדמיה לחיות בעלי חיים, התקנת חיה זהירה היא תכונת מפתח כדי להבטיח נוחות והרדמת בעלי חיים אופטימלית. זה יאפשר לתוצאות ההדמיה הטובות ביותר ולהבטיח רכישת תמונת רבייה למחקרים ארוכי טווח. בשל גודלו של בעל החיים, השימוש ביחידת MR קליני בגודל (1.5 T או T 3) הוא מתאים ביותר. סליל הברך קליני 8 ערוצים משמש כפי שהוא מספק רזולוציה מתאימה ויחס ניגודיות לרעש לחקר הברך ארנב.

1. לפני התקנה על מערכת ההדמיה, להתקין גישה ורידים היקפי דרך וריד אוזן. גישה זו תשמש כדי להזריק חומר הניגוד.
   1. לגלח ולחטא את האוזן.
   ביצוע הרדמה מקומית על ידי הזרקה תת עורית של לידוקאין.
   2. הכנס G 25 בתוך וריד אוזן רוחב קטטר.
   3. להעריך את החדירות על ידי הזרקה של סרום פיסיולוגי סטרילי 1 מ"ל.
   4. לשמור את הקטטר עם הקשה הדבקה.
2. להרדים בעלי חיים בדרך של זריקה תוך שרירית של קטמין (30 מ"ג / ק"ג משקל גוף) מעורבבת עם xylazine (4 מ"ג / ק"ג). חיות מורדמים באופן מלא ברגע שהם אינם מגיבים לקמצוץ כפה. מניחים מסיכת פנים על הארנב, זה נותן חמצן עם קצב זרימה של 200 מ"ל / דקה.
3. פעם אחת בהרדמה מלאה, לקחת את בעלי החיים ליחידת ההדמיה MR. בעלי חיים מקום כל כך שהברכיים נמצאות במרכז סליל MR. הנח את רגליהם של בעלי החיים ברחבה מלאה, כך שציר האורך של עצם השוק הוא במקביל לשולחן יחידת ההדמיה MR. השתמש במחברי סקוטש או שקי חול כדי לשמור על מיקום רגל אופטימלי.
4. ניטור לב ונשימה של בעלי החיים אינו נדרש כפרוטוקול מאפשר הרדמה הרדמה עמוקה בנשימה ספונטנית, אבל חיות חייבת להיות מכוסות, כדי למנוע אובדן חום-Induced הרדמה.
5. MR פרוטוקול מפורט בטבלה 1. הזמן הממוצע לרכישה כוללת כולל התקנה אופטימלית הוא כ -20 דקות.
6. לבצע MR הדמיה במישורים שונים. עם זאת, במישור הרוחבי של הברכיים (מאונך לעצם השוק) הוא תכנית העזר כפי שהיא מבטיחה שחזור האנטומי של מיקום תמונה לבחינות אורך רציפים ומאפשרת התאמה אופטימלית עם פרוסות היסטולוגית.
7. בסיום של רצפי unenhanced, להזריק חומר ניגוד UPSIO דרך הגישה ורידי אוזן. לאט לנהל את חלקיקי תחמוצת הברזל במנה בודד של 150 פה μmol / ק"ג. יש לשטוף את הצנתר בזריקה של 1 מ"ל של סרום פיסיולוגי סטרילית.
8. חזור על משאבי האנוש המשופר GRE המשוקלל רצף 24 לאחר ההזרקה. עיכוב זה מאפשר לחלקיקים שphagocytized ידיאת מקרופאגים.
9. עבור מחקרים ארוכי טווח להערכת השפעת תרופות (אנטיביוטיקה, סטרואידים, נוגדנים נגד macrophage, וכו '.), חזור על בדיקות רציפות MR באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל.

3. ניתוח תמונה

1. להערכת אורך לבצע מדידות באותה הרמה האנטומית, ולהגדיר נקודת ציון לזיהוי בקלות. לדוגמה, רכישה דרך המישור הצירי בו הקוטר הגדול ביותר של הפיקה הוא ציין היא דרך אמינה כדי להשיג מדידה לשעתק (איור 1).
2. ביצוע ניתוח תמונה באמצעות תוכנה לעיבוד תמונה (ImageJ) מבוססת תוכנת DICOM (כגון Osirix) או.
3. באמצעות תוכנת ImageJ, לבצע פילוח של האזור הסינוביאלי המדגים אובדן אות בתמונת T2 משוקללת GRE USPIO המשופרת שימוש באפשרות "לא סדירה האזור" הציור. ברגע שהסינוביום עם אות אפלה מתואר, לחץ על "נתח" כדי להשיג את האזור /מספר הפיקסלים (איור 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

על תמונות unenhanced, הסינוביום של ברכיים נגועות מציג נפיחות מפוזרת של אות ביניים שהיא לא להבדיל בין רקמות רכות, ואילו עצם ירך והפיקה יופיעו כאות מבנים נמוכים (איור 1).

על תמונות USPIO המשופרות, 24 שעות לאחר שממשל חומר הניגוד, המכי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעוד סוכנים בניגוד גדוליניום מבוסס ספציפיים לספק מידע על ההיקף והטפטוף של המרחב תאי, הדמיה על ידי מקרופאג USPIO משופר MR מאפשרת לוקליזציה האנטומי מדויקת והערכה איכותית של חדירת מקרופאג בתוך הסינוביום הנגוע ללא צורך בדגימה של רקמת ^9. בשל הרגישות הגבוהה שלהם, USPIO יכו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
P904	Guerbet		Dose: 150 μmol Fe/kg
Ketamine (500 mg/ml ketamine)	Virbac		Dose: 30 mg/kg
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Axience		Dose: 4 mg/kg
Buprenorphine	Vetoquinol		Dose: 0.1 mg/kg/8 hr
BD 22 G, 1 inch	BD Biosciences	381423
BD 25 G, 5/8 inch	BD Biosciences	305122