JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אם מונעת הזדקנות או מקדמת tumorigenesis נותר שנוי במחלוקת. מאז תרופות chemotherapeutical יכולות לגרום לתאים סרטניים להזדקן, לומד הזדקנות הוא חיוני למציעים טיפולים חדשים. עם זאת, assay β-גלקטוזידאז הסטנדרטי ומשמש באופן נרחב מציג חסרונות עיקריים. אנו מציעים כאן assay מבוסס זרימת cytometry מהירה ורגיש לכמת הזדקנות.

Abstract

תאים אנושיים לא ללא הגבלת זמן להתרבות. על הרמזים חיצוניים ו / או פנימיים, תאים עלולים למות או להיכנס לעצירת מחזור תא יציב הנקראת הזדקנות. כמה מנגנונים תאיים, כמו התקצרות הטלומרים וביטוי לא תקין של אונקוגנים mitogenic, הוכחו לגרום להזדקנות. הזדקנות אינה מוגבלת לתאים נורמלים; כבר דיווחו תאים סרטניים גם להזדקן.

תרופות Chemotherapeutical הוכחו לגרום להזדקנות בתאים סרטניים. עם זאת, נותר שנוי במחלוקת בין ההזדקנות מונעת או מקדמת tumorigenesis. כפי שסופו של דבר עשוי להיות מטופל ספציפי, שיטה מהירה ורגישה להערכת הזדקנות בתא סרטני בקרוב תידרש.

לשם כך, assay הסטנדרטי β-גלקטוזידאז, שיטה המשמשת כיום, מציגה חסרונות עיקריים: זה זמן רב ולא רגיש. אנו מציעים כאן assay מבוסס cytometry זרימה ללמוד הזדקנות על live תאים. assay זה מציע את היתרון של להיות מהיר, רגיש, ויכול להיות בשילוב לimmunolabeling של סמנים תאיים שונים.

Introduction

מאז ראשית שנות השישים וגילויו על ידי Hayflick ומורהד, הזדקנות עדיין נשארה סקרנות סלולרית 1. תאים אנושיים לא לזמן בלתי מוגבל ולהתרבות, על ידי הזדקנות, Hayflick ומורהד טבעו את התהליך הסלולרי של הזדקנות. הזדקנות היא עצירת מחזור תא יציב שבו תאים נשארים פעילים מטבולית בניגוד למוות תאי. נכון להיום, ארבעה מנגנונים תאיים הוכחו לגרום להזדקנות: התקצרות הטלומרים, נזק לדנ"א, הפרעות הכרומטין, וביטוי לא תקין של אונקוגנים mitogenic 2. זה מצביע על כך לא רק תאים נורמלים, אלא גם תאים סרטניים מסוגלים לעבור הזדקנות 3. כעניין של עובדה, תאים סרטניים שעברו הזדקנות הוצגו מהווים מכשול להתקדמות נוספת 4-5 גידול. עם זאת, מספר דוחות החברה ציינו כי, בנסיבות מסוימות, הזדקנות תאית יכולה גם לקדם ממאירות 6-7. לומד הזדקנות של הסרטן celLS עומד להיות דחף בחקר הסרטן המשמש כיום כתרופות כימותרפיות יכולות להוביל להזדקנות של תאים סרטניים במבחנה לא רק, אלא גם in vivo 8.

Assay האדון לחקור את הימצאותם של תאים מזדקנים הוא assay β-גלקטוזידאז ב-pH חומצי. assay histochemical זה משקף את העלייה בbiogenesis lysosomal מתרחש ברוב התאים מזדקנים. בקצרה, אקסוגני X-gal, הוחל לתאים, הוא ביקע ידי β-גלקטוזידאז המועשר בlysosomes של תאים מזדקנים, והוליד צבע כחול 9. לאחר מכן ניתן לכמת את התאים המזדקנים הכחולים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. אמנם פופולרי מאוד, assay β-גלקטוזידאז מציג חסרונות עיקריים. ראשית, assay זה מתבצע בתאים קבועים. שנית, זה זמן רב, משום שמשתמע לכמת את מידת ההזדקנות על ידי ספירת מספר גבוה באופן משמעותי של תאים מזדקנים תחת מיקרוסקופ. שלישית, assay זהאינו רגיש לאפליה בין תאים מזדקנים ואינם senescent לחלוטין מסתמכת על המתבונן.

אנו דנים כאן assay בלתי מנוצל, מהיר, ורגיש המבוסס על cytometry להעריך את הימצאותם של תאים מזדקנים חיים. assay זה מבוסס על הידרוליזה של מולקולה חדירה קרום, 5 dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C 12 FDG), על ידי β-גלקטוזידאז מועשר בתאים מזדקנים. לאחר הידרוליזה ועירור לייזר, FDG C 12 פולט הקרינה ירוקה ולכן יכול להיות מזוהה על ידי זרימת cytometry 10, 11. זיהוי של תאים מזדקנים באמצעות cytometry הזרימה מציע את היתרון של להיות מהיר ורגיש מאוד. בנוסף לכך, זיהוי של תאים מזדקנים ידי cytometry הזרימה יכול להיות בשילוב עם זיהוי של סמנים תאיים אחרים. assay זה יכול לשמש כדי לזהות תאים מזדקנים בתוך אוכלוסייה של תאים סרטניים שטופלו בכימותרפיה וניתן להגדיר באופן שגרתיעל סעיפי רקמות, לאחר הניתוק סלולרי, במרפאה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת C12FDG, bafilomycin A1 ותא התרבות

  1. ממיסים את אבקת 12 C FDG בsulfoxide דימתיל (DMSO) לריכוז סופי של 20 מ"מ. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. DMSO יש להשתמש בתנאי בטיחות מתאימים.
  2. ממיסים את אבקת bafilomycin A1 ב DMSO לריכוז סופי של 0.1 מ"מ. Aliquot וחנות ב - 20 ° C. Bafilomycin יש להשתמש בתנאי בטיחות מתאימים.
  3. טפח את קו RPMI 8226 תא, או שורות תאים אחרות חסיד או לא, באמצעי תקשורת המכיל 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה 1%, על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאמוד את מספר התאים הדרושים לצורך הניסוי. כדי להקליט מספר מספיק של אירועים במהלך ניתוח תזרים cytometry, 5 x 10 5 תאים נדרשים. כדי לקבוע את אחוז התאים המזדקנים, שלוש דגימות תאים נדרשות: מדגם ללא תווית, תאים שלא טופלו מוכתמים ב12 C FDG, תאים שטופלו מוכתמיםC 12 FDG.
  4. זרעי 24 שעות לפני ביצוע תאי הניסוי, כך שתאים נמצאים בשלב של יומן עקומת התרבות התאים.

2. אינדוקציה של הזדקנות

  1. לגרום להזדקנות של תאים סרטניים על ידי הוספת תרופת chemotherapeutical. ריכוז תרופה ומשך הטיפול צריך להיות מותאם לסוג התא הנבדק. התחל עם טיפול שעה 48 בריכוז הסופי של דוקסורוביצין ננומטר 50 לריכוז של תאים בכ 10 6 תאים / מ"ל. אל תשכח לכלול מדגם מטופל (ביקורת שלילית).

3. טיפול bafilomycin A1

  1. בדקו כדאיות תא על ידי תאי ערבוב עם trypan הכחול (V / V), כתרופת chemotherapeutical משמשת בשלב הקודם עלולה להוביל לאפופטוזיס התא. מלא לתוך תא Malassez ולספור את מספר התאים הכחולים (תאים מתים) ושל תאים לבנים (תאי חיים). אם אחוז הכדאיות הוא פחות מ -70%, תאים מתים יכולים להיות REMoved באמצעות ערכה מתאימה כדי להבטיח שלא יהיו תאים מתים הטיה הניתוח שלאחר מכן.
  2. הסר את תקשורת התרבות ולהחליף על ידי תקשורת והתרבות טרי prewarmed. פנק את התאים עם ריכוז סופי של של bafilomycin A1 100 ננומטר. Bafilomycin A1 משמש כדי לנטרל את ה-pH חומצי של lysosomes. דגירה שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.

4. מכתים C 12 FDG

  1. ממיסים C 12 FDG בתקשורת והתרבות טרי prewarmed לריכוז סופי של 2 מ"מ.
  2. הוסף את המתחם לתאים בריכוז סופי של 33 מיקרומטר ודגירת שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. אם אתם משתמשים בתאים שאינם חסיד, צנטריפוגה תאי XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C (המהירות אולי צריכה להיות מותאמת לסוג התא בשימוש), לשטוף 2x עם PBS. Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS הקר. אם אתם משתמשים בתאים חסיד, להסיר את המדיה ולשטוף 2x עם PBS. לקצור את התאים חסיד באמצעות פתרון טריפסין ו צנטריפוגותתאי XG 300 דקות 5 ב 4 ° C (המהירות אולי צריכה להיות מותאמת לסוג התא בשימוש). Resuspend התא גלולה ב 500 μl של PBS הקר. בשני המקרים, ריכוז התא צריך להיות כ 10 6 תאים / מ"ל.
  3. לבצע שיתוף immunolabeling לאפיין את האוכלוסייה של תאים מזדקנים נוסף.

5. ניתוח cytometry זרימה

  1. כייל את cytometer הזרימה באמצעות חרוזים הבקרה מומלצים על ידי היצרן של cytometer הזרימה. לכל הצעדים, 10 4 לפחות אירועים צריכים להיות מוקלטים.
  2. הפעל את המדגם הראשון המכיל תאים ללא תווית. הכן את ערוץ שני פרמטר גרפי המציג פיזור קדימה (FSC) לעומת צד ערוץ פיזור (SSC). הגדר את הצינורות מכפיל (PMTs) ולהגדיר את אזור של עניין לא כולל תאים מתים ופסולת תאיים שאולי הופיעו במהלך הכנת המדגם. אזור זה של שער ריבית ביסטוגרמה חד פרמטר הצגת FL1 בסולם היומןשל ציר ה-x ואת מספר האירועים בציר ה-Y. המספר הכולל של אירועים מייצג את מספר התאים נותחו. הגדר את PMT כך שתאים ללא תווית מופיעים בעשור הראשון בסולם היומן של ציר x. לקבוע autofluorescence של התאים במידת צורך.
  3. הפעל את המדגם השני המכיל תאים שלא טופלו. על ההיסטוגרמה חד פרמטר הצגת FL1 (הקרינה של 12 C FDG), הצב את הסמן אחרי האוכלוסייה שכותרתו במעומעם. סף זה יאפשר אפליה בין תאים שאינם מזדקנים (תאים שכותרת עמומה) ותאים מזדקנים (תאים שכותרתו במאור פנים).
  4. הפעל את המדגם השלישי המכיל תאים שטופלו. מאור שכותרתו תאים, תאים מזדקנים כלומר מופיעים מעל הסף שנקבע בשלב הקודם. להעריך את אחוז התאים המזדקנים ידי חלוקת מספר האירועים בהירים במספר הכולל של אירועים. במידת צורך, ניתן גם העריך את הפעילות של β-גלקטוזידאז באמצעות הקרינה הממוצעתאינטנסיביות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מיאלומה נפוצה, גידול ממאיר המטולוגיות, שימש כדי להעריך את ההזדקנות נגרמת על ידי הליך chemotherapeutical. כדי לעשות זאת שורת תאי MM זמינה מסחרי (RPMI 8226) טופלה במשך 2 ימים עם דוקסורוביצין, תרופת chemotherapeutical. התאים אז היו נתונים לטיפול A1 bafilomycin וטופחו עוד יותר עם ​​C 12 FDG. תאים נות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הצגנו כאן שיטה המבוססת על זרימת cytometry לכמת הזדקנות תאית בתאי סרטן חיים. שיטה זו מבוססת על השימוש במתחם החדיר הקרום, FDG C 12, ולכן יכולה לשמש בכל סוגי תאים, ולאחר טיפולים שונים, כל עוד המתחם הוא נלקח על ידי התאים. על ספיגת הסלולר, FDG C 12 הוא הידרוליזה על ידי β-גלקט?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

אנו מודים SF 4206 ICORE (אוניברסיטת דה קאן) עבור השימוש במתקן cytometry. JC קיבל מלגות לפוסט דוקטורט מConseil d'דה Radioprotection EDF וConseil האזורי של נורמנדי התחתי. נתונים אלה היו חלק מפרויקטים שמומנו על ידי Ligue Nationale contre le הסרטן - Comités de l'אורן et du קלבדוס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside InvitrogenD-2893
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
Bafilomycin A1SigmaB1793
DoxorubicinSandoz
Trypan blueSigmaT8154
RPMI 1640 cell culture mediumLonzaBE12-702
Fetal calf serumPAA Laboratories GmBHA15 101
AntibioticsGibco5290-018
Gallios flow cytometerBeckman CoulterA94291

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
  3. Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
  4. Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
  5. Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
  6. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
  7. Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
  8. Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  9. Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
  10. Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
  11. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  12. Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446(2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

78cytometryC 12 FDG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved