בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

Summary

רקמת שומן (AT) היא אתר של הפעלת תא חיסונית חזקה ואינטראקציה. כמעט בכל התאים של המערכת החיסונית נמצאים בAT ויחסים שלהם שונו על ידי השמנת יתר. בידוד נכון, כימות, ואפיון של אוכלוסיות בתא חיסון הם קריטיים להבנת תפקידם במחלה immunometabolic.

Abstract

הגילוי של חדירת מקרופאג גדל ברקמת השומן (AT) של מכרסמים ובני אדם סובלים מהשמנת יתר הוביל להתגברות העניין בתרומה של תאים חיסונית לעמידות לאינסולין מקומית ומערכתית. בידוד וכימות של אוכלוסיות תאי חיסון שונות ברזה והשמנת יתר בחברה הוא טכניקה מנוצל בדרך כלל במעבדות immunometabolism; טיפול עדיין קיצוני יש לנקוט הן בבידוד בתא בכלי דם סטרומה וניתוח תזרים cytometry כך שהנתונים המתקבלים הוא אמין ולפרש . בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך בשר טחון, לעכל, ולבודד את החלק היחסי של כלי הדם המועשר בתאי סטרומה החיסונית. כתוצאה מכך, אנו מראים כיצד מקרופאגים נוגדני התווית ולימפוציטים מסוג T וכיצד כראוי שער עליהם בניסויי cytometry זרימה. חלקות זרימת cytometry נציג מעכברים שמנים שאוכלים שומן רזים וגבוהים בשומן האכילו נמוכים מסופקות. אלמנט קריטי של ניתוח זה הוא השימוש בנוגדנים שעושיםלא לזרוח בערוצים שבו במקרופאגים הם autofluorescent אופן טבעי, כמו גם שימוש בפקדי פיצוי הולם.

Introduction

מבחינה היסטורית, רקמת השומן (AT) כבר נתפסה כאיבר אדיש של אחסון שומנים בדם, שמתרחב ומתכווץ בתגובה למאזן אנרגיה. כעת אנו מבינים כי AT מייצג איבר האנדוקרינית דינמי שמפריש באופן פעיל מספר ההורמונים, אשר משפיעים באופן ישיר התנהגות אכילה והומאוסטזיס הגלוקוז מערכתי. בנוסף, בעשור האחרון חלה עלייה הולכת וגובר לאוכלוסיות הרבות של תאים חיסוניים המתגוררות בכל חלק סטרומה וסקולרית (SVF), כמו גם את תרומתם ל-AT הומאוסטזיס.

היכולת להפריד בין AT adipocyte וSVF באמצעות לעכל collagenase אחריו צנטריפוגה ההפרש תואר לראשונה בשנת 1964 על ידי Rodbell ^1. Collagenase השני משמש לרוב להפרדת adipocyte וSVF בשל תחזוקה של הקולטנים לאינסולין adipocyte ^1. חלוקה במוקדם, האנזימטית של AT הייתה בעיקר מועסק ללמוד adipocyte חילוף חומרים וכדי לבודד preadipocytes. לאחרונה, בטכניקה זו, בשילוב עם הזמינות הנרחבת של cytometers הזרימה ומספר הגדל וההולך של נוגדני fluorophore-מצומדות זמינים מסחרי, יש להקל אפיון של AT תאים חיסוניים.

למרות נוכחותם של תאי מערכת חיסונית בדלקת שתוארה בעבר ^2, את המסמכים על ידי הזרע וייסברג ואח'. ושו et al. פורסם בשנת 2003 היו הראשון לתעד את ההצטברות של AT מקרופאגים (כספומטים) בהשמנה יתר, אשר מפרישה ציטוקינים דלקתיים ולתאם עם תנגודת לאינסולין AT ספציפית ומערכתית ^3,4. תצפיות אלה שימש כבסיס לשדה חדש של חקירה לאחרונה שטבע, "immunometabolism," ⁵ וכבר במעקב על ידי מחקרים לכך לאוכלוסיות תאי חיסון שונות, כוללים תאים דנדריטיים, תאי פיטום ^{6 7, 8} תאי T ^-10, ^11, תאי B NKT תאים ^{12, 13,} אאוזינופילים ונויטרופילים ^14,15 בהתפתחות של תנגודת לאינסולין השמנת יתר קשור.

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הטכניקה לעכל collagenase משמשת לבודד תאים של AT SVF ולאפיין כספומטים ו-AT תאי T באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה כבר מותאם לעכבר ב, עם זאת, צופים יכולים ליהנות מקריאת מאמר מצוין המספק פירוט נרחב על אופטימיזציה של טכניקה זו לאדם ^{בגיל 16.} קהל היעד של מאמר זה כולל חוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעבודה עם עכבר ובביצוע cytometry זרימה. כמה שיקולים מעשיים לאיזון תשואה סלולרית וכדאיות עם זמן ומשאבים מוצגים כמו גם בקרות cytometry זרימה אופטימליות לאפיון AT אוכלוסיות תאים חיסוניים. בנוסף לפרוטוקול שלנו, קוראים referrאד למאמר יופיטר לאחרונה על ידי Basu et al. לדיון מצוין של חלק מההיבטים הטכניים של cytometry זרימה לכוללים בקרות ופיצויים נאותות ^17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. חומרים כימיים ומתכלה

לפני שתתחיל בפרוטוקול הניסוי הזה, להכין את ריאגנטים הבאים:

1. 70% אתנול
2. 1X PBS
3. 1X DPBS (ללא Ca וMg) בתוספת 0.5% BSA
4. FACS חיץ: 1X DPBS (ללא Ca ומ"ג), 2 mM EDTA, ו -1% FCS
5. חיץ ACK: Cl 150 מ"מ NH _4, 10 מ"מ ₃ KHCO, ומ"מ Na ₂ EDTA 0.1 במים

2. קצירת והכנה של רקמת שומן

1. להרדים עכברים על פי נהלים שאושרו IACUC ספציפיים לכל מוסד.
2. יסודיות להרטיב את הפרווה עם 70% אתנול.
3. עושה חתך ברמה של תהליך xiphoid (חלק תחתון של עצם החזה) ולפתוח את חלל בית החזה כדי לחשוף את הלב, נזהר שלא לנתק את כל כלי דם גדולים.

הערה: בשלב זה, היא גם מועילה להשאיר את הדיאפרגמה שלמה ככל אפשר ולחתוך חריץ מהצד של כלוב הצלעות הימני כדי לאפשר לדם לזרום וperfusate מתוך חלל בית החזה.

4. קליפ העלייה הימנית כדי לאפשר לדם וperfusate להימלט מערכת הדם.

שים לב: כאשר מתמודדים עם עכברים שמנים, קרום לב עודף בייתכן שיהיה הצורך להסיר על מנת לאפשר גישה אל הלב.

5. לתפוס את הלב עם מלקחיים ובעדינות להכניס מחט לתוך החדר השמאלי דרך הקודקוד. לאט perfuse העכבר עם 15 מ"ל סטרילי PBS.

שימו לב: להפחית את שיעור זלוף אם הריאות מתחילות למלא ולהרחיב.

6. פתח את חלל הצפק ולהסיר את רפידות שומן perigonadal באמצעות טיפול, כדי למנוע כל רקמות האשכים.
7. הנח כריות שומן במשקל סירה על קרח המכיל 2 DPBS מ"ל 1X (ללא מ"ג או Ca) בתוספת 0.5% BSA, ובשר טחון AT לחתיכות דקות.

התחת = "jove_content"> הערה: הגבל את כמות AT לשוקלת סירה עד 1.2 גרם. אם הכמות של AT עולה על 1.2 גרם, לחלק אותו שווה בשווה בין שתי סירות שוקלות.

8. לשמור על דגימות על קרח ולהכין לעכל פתרון מיליליטר collagenase 3 לכל מדגם AT בהיקף של 1X DPBS בתוספת 0.5% BSA, 10 מ"מ CaCl _2, ו -4 מ"ג / מיליליטר collagenase, מהסוג II.

3. עיכול collagenase

1. העברה לצינורות חרוטי 50 מ"ל על ידי שפיכת homogenate ושטיפת סירה לשקול עם 1 DPBS מ"ל (0.5% BSA) ופתרון לעכל מיליליטר collagenase השני 3.
2. לדגור על homogenate בייקר סיבובי (200 סל"ד) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
3. הוסף 10 מ"ל DPBS (0.5% BSA) לצינורות החרוטים ומניחים על קרח.
4. Triturate homogenate פעמים רבות באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל, ולהעביר השעיות תא דרך 100 מיקרומטר במסנן לצינור חדש 50 מיליליטר חרוטי.
5. צנטריפוגה השעיה תא בXG 500 עבור 10 דקות ב 4 & Dלמשל, ג
6. למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה SVF במאגר ACK 3 מ"ל לlyse מזהמים אריתרוציטים.
7. הוסף חיץ FACS מ"ל 12 והשעית תא צנטריפוגות ב XG 500 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
8. למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה ב SVF חיץ FACS.

הערה: השתמש בגודל של התא גלולה כמדריך לכמה חיץ FACS לresuspend פנימה אם התא גלולה מכסה את החלק התחתון של צינור חרוטי 50 מ"ל, השתמש 0.5-1 חיץ FACS מ"ל, אחרת resuspend ב0.25-0.5 מ"ל.

9. דגימות מניחים על קרח ולהכין aliquots דילול 1:10 של כל דגימה לספירת תאים על ידי ערבוב 40 μl חיץ FACS, פתרון כחול 50 μl trypan (0.2%), ו10 השעיה תא μl.
10. ספירת תאי קיימא המבוסס על הרחקת trypan הכחולה ולדלל השעיות תא לריכוז סופי של x 05-10 אוקטובר ⁶ תאים / מ"ל.

4. צביעה של אנטיגנים תא שטח

1. הוסף אנטי עכבר CD16/CD32 נוגדן (FC בלוק) לריכוז סופי של 0.5-1 μg/10 ⁶ תאים, ולדגור על קרח למשך 10 דקות.
2. דגימות העברה (≥ 10 ⁶ תאים) עד 12 x 75 צינורות תחתית עגולות קלקר מ"מ. הכן צינורות נפרדים אם ניתוח כספומטים ותאי T, ולשלב את תאים נוספים כדי להכין מספר מספיק של צינורות כדי להתאים את הפיצוי הנדרש וקרינה שונה מינוס אחד (FMO) פקדים.

הערה: כדוגמה, כאשר כימות שיעור הכספומטים המבוסס על פקדי FMO F4/80 וCD11b, הפיצוי הבא ויצטרך להיות מוכנים:

- מחולל (תאים)

- DAPI או יודיד propidium (PI) כתם בודד (תאים, לא להוסיף צבע כדאיות עד שלב 5.1)

- F4/80 APC (תאים או חרוזים פיצויים) כתם בודדים

- CD11b FITC תאים בודדים או כתם (חרוזים פיצויים)

- FMO 1 (תאים): + + CD11b FITC צבע כדאיות עכברוש IgG2a κ אלוטיפ השליטה APC (הוסיף בשלב 5.1)

- FMO 2 (תאים): F4/80 APC + עכברוש IgG2b κ אלוטיפ השליטה FITC + צבע כדאיות (הוסיף בשלב 5.1)

3. הוסף נוגדנים fluorophore-מצומדות עיקריים ו / או פקדי אלוטיפ בריכוז המתאים (ראה טבלה של חומרים כימיים וחומרים).
4. הגן על דגימות מאור ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
5. הוסף חיץ FACS מ"ל 2 והשעית תא צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
6. למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה ב SVF 2 חיץ FACS מ"ל.
7. צנטריפוגה XG תא ההשעיה 500 דקות 5 ב 4 ° C, ו resuspend תא גלולה ב SVF ≥ 400 חיץ FACS μl.
8. העבר את הדגימות ל12 x 75 צינורות תחתית עגולות קלקר מ"מ מאובזר עם 35 סטרפלס מסננת תא מיקרומטר.
9. להגן מפני אור, ודגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח FACS.

הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות יש לנתח תאי immeadiately, עם זאת, ניתוח FACS עם פרוטוקול זה נערך בהצלחה על תאים שכותרתו מאוחסנים במאגר FACS ל1-2 שעות ב 4 ° C. אם תאים צריכים להיות קבועים כדי להגדיל את זמן אחסון, ניתן לתקן תאים שכותרתו עם paraformaldehyde 2% על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני ניתוח FACS. חברות נוגדנים מצביעות על כך שניתן לאחסן את תאי שכותרתו לתקופה של עד שבוע אחד, עם זאת, זה לא נבדק במסגרת הליך זה.

5. ניתוח FACS

1. לפני ניתוח FACS, להוסיף צבע כדאיות לדגימות ובקרות מתאימות כדי לאפשר לאפליה תא חי / מת.

הערה: צבעי כדאיות רבים זמינים באופן מסחרי, אבל DAPI וPI מומלצים בהתאם לפרופ 'עירור / פליטהIles של נוגדני fluorophore-מצומדות בשימוש. DAPI ויודיד Propidium מתווספים לכל דגימה בריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל.

2. השתמש במדגם בלא כתם שלילי שליטה, רצוי תאים מבודדים מאותה הרקמה כמו דגימות ניסוי, כדי להתאים את פיזור צד (SSC) ופיזור קדימה (FSC), כך שאוכלוסיית התא (ים) של עניין הן בקנה מידה.

הערה: לניתוח של AT תאי SVF, מומלץ שSSC יוצג בקנה מידה לעומת יומן FSC בקנה מידה ליניארי. השימוש בקנה מידת יומן לSSC חשוב במיוחד בעת ניתוח כספומטים, שהן לעתים קרובות גדולות מאוד ופרטניות.

3. צייר שער פיזור אור ראשוני המבוסס על הסוג של התא (ים) להיות מנותחים, ולהתאים את הצינור המכפיל (PMT), כך שעלייה בתאים בלא הכתם הם בקצה שמאלי של ההיסטוגרמה פרמטר יחיד (מרוכז כ ב -10 ^ב2) עבור הערוצים המתאימים.

הערה: מומלץ שלימפוציטים ומקרופגים (או תאי מיאלואידית אחרים) להיות מנותחים בנפרד בשל הבדלים בautofluorescence.

4. שימוש בפקדים מוכתמים בודדים או חרוזים פיצויים ללכוד נוגדנים לבצע פיצוי צבע רב.

הערה: השימוש בחרוזי פיצויים מומלץ, עם זאת, התאימות של כל נוגדן חייבת להיות מובטחת. לדוגמה, חרוזים פיצוי עשויים שלא לחצות-מגיבים עם נוגדני ארנבות, במקרה שבו תאים מבודדים נדרשים להשיג שליטת כתם יחידה מתאימה.

5. קבע שערים ניסיוניים המבוססים על פקדי FMO שונים.
6. הגדר את cytometer הזרימה לאסוף את המספר המתאים של אירועים המבוססים על השכיחות של האוכלוסייה של עניין ולהקליט את נתוני ניסוי.
7. קבצי נתונים FCS יצוא לניתוח מצב לא מקוון. ישנם מספר רב של תוכניות זמינות לcytometr הזרימהניתוח נתונים y. אנו ממליצים Cytobank, פלטפורמה מבוססת אינטרנט המאפשרת investigatores לאחסן ולנתח נתונים וליצור דמויות מכל מחשב עם גישה לאינטרנט ^18. בנוסף, Cytobank מציע את היכולת לבצע ציבור נתונים נגיש או להגביל את הגישה למשתפי פעולה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

עיכול collagenase של AT אחריו צנטריפוגה ההפרש שימש לבודד את SVF מרפידות שומן epididymal של עכברים ממין זכר C57BL/6J האכיל שומן נמוך (10% מקלוריות שומן) או שומן גבוה (60% קלוריות משומנים) דיאטה (LFD וHFD , בהתאמה) במשך 16 שבועות. תאים של SVF אז תויגו עם נוגדנים ראשוניים fluorophore-מצומדות לכמת את שיעור...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

עניין גובר בתפקידה של המערכת החיסונית בהשלכות מטבוליות של השמנה הוביל לשימוש הנרחב בזרימת cytometry לאפיין תאים חיסוניים של AT. אף על פי הפרוטוקול המדויק ישתנה בין מעבדות המבוססות על הניסיון שלהם וציוד זמין, כוללים את השלבים הקריטיים עיכול collagenase, צנטריפוגה ההפרש, וסימון ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml	Life Technologies	14190-250
DAPI	Life Technologies	D3571
BSA	Sigma	A2153-100G
collagenase	Sigma	C6885-5G
propidium iodide solution	Sigma	P4864-10 ml
stable stack 20 microliter	Rainin	SS-L10
20 microliter filter tips	Rainin	SRL10F
stable stack 250 microliter tips	Rainin	SS-L250
1000 microliter tips	Rainin	GPS-L1000
1000 microliter filter tips	Rainin	GP-L1000F
250 microliter Filter Tips	Rainin	SR-L200F
FC Block	BD Biosciences	553142
fisher 100mn strainers	Fisherbrand	22-363-549
medium weigh dish	Fisherbrand	02-202B
aluminum foil	Fisherbrand	1213100
mincing scissors	Fisherbrand	089531B
Vortex	Fisherbrand	2215365
50 ml conical tubes	BD Falcon	14-959-49A
filter top FACS tubes	BD Falcon	352235
10 ml pipette case 200	BD Falcon	1367520
round bottom tubes	BD Falcon	352058
5 ml syringe	BD Falcon	309646
V Bottom Plates	Costar	07-200-107
transfer bulb pipette	Thermo Scientific	13-711-22
Shaker	Thermo Scientific	11 676 071
Adhesive mat	Thermo Scientific	1368750
Cell Culture Centrifuge	Sorvall	75253839
Adapters	Sorvall	75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80	eBioscience	17-4801	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b	eBioscience	11-0112	Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c	eBioscience	12-0114	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2	R&D Systems	FAB4297P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206	R&D Systems	FAB2535P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2	R&D Systems	FAB5538P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ	BD Biosciences	553174	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a	BD Biosciences	552877	Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4	BD Biosciences	557956	Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963
Table 1. List of Materials and Reagents.