ניתוח שיטתי של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

Summary

מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.

Abstract

אתגר גדול לטיפול מבוסס תאים הוא חוסר היכולת למקד מערכתי כמות גדולה של תאי קיימא עם יעילות גבוהה לרקמות של העניין הבא עירוי תוך ורידי או intraarterial. כתוצאה מכך, הגדלת ביות תא כרגע למד כאסטרטגיה כדי לשפר את הטיפול בתאים. תא מתגלגל על האנדותל של כלי הדם הוא צעד חשוב בתהליך של ביות של תאים ויכול להיות נחקר במבחנה באמצעות זרימת צלחת קאמרית מקבילה (PPFC). עם זאת, זה assay תפוקה משעמם מאוד, נמוך, עם תזרים תנאים מבוקרים היטב. במקום זאת, השתמשנו במערכת microfluidic צלחת רב גם המאפשרת חקר התכונות מתגלגלים סלולארי בתפוקה גבוהה יותר תחת מבוקרת בדיוק, זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ^1,2. במאמר זה, אנו מראים כיצד המאפיינים המתגלגלים של HL-60 (לוקמיה פרומיילוציטית האנושית) תאים על משטחי E-מצופה selectin P-וכמו גם על משטחים מצופים monolayer תא יכולים להיות readily שנבדק. כדי לדמות טוב יותר במצבים דלקתיים, משטח ערוץ microfluidic היה מצופה בתאי האנדותל (ECS), אשר לאחר מכן הופעלו עם הגורם-α גידול הנמק (TNF-α), להגדיל באופן משמעותי את אינטראקציות עם HL-60 תאים בתנאים דינמיים. התפוקה המשופרת ופלטפורמה משולבת רב פרמטר ניתוח תוכנה, המאפשרת ניתוח מהיר של פרמטרים כגון מתגלגל מהירויות ומתגלגלים בדרך, הן יתרונות חשובים להערכת מאפייני תא מתגלגל חוץ גופייה. המאפשר ניתוח מהיר ומדויק של גישות הנדסיות שנועדו להשפיע מתגלגל תא וביות, פלטפורמה זו עשויה לסייע בטיפול מבוסס תאים אקסוגניים מראש.

Introduction

אחד האתגרים המרכזיים בתרגום הקליני המוצלח של טיפול מבוסס תאים הוא המסירה יעילה או מיקוד של תאים חדורים מערכתית לאתרים רצויים ^3,4. כתוצאה מכך, יש חיפוש מתמיד אחר גישות כדי לשפר את הביות של תאים, ותאים במיוחד מתגלגל, כאסטרטגיה לשיפור טיפול בתא. תא מתגלגל על כלי דם הוא צעד מפתח במפל ביות תא, באופן קלאסי המוגדר לויקוציטים שמגויסים לאתרי מחלה ^5. צעד זה נשלטת על ידי אינטראקציות ספציפיות בין selectins אנדותל, כלומר P-ו-E-selectin (P-ו-E-SEL), וligands המתפרץ שלהם על פני השטח של כדוריות דם לבנות ^5,6. הבנה טובה יותר ויעילות משופרת של ביות תא, ובאופן ספציפי את הצעד מתגלגל, הם בעלי חשיבות רבה בחיפוש אחר פלטפורמות חדשות כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים. למועד זה הושג על ידי שימוש בתאים במקביל זרימת צלחת (PPFCs), הכוללת שני פלאט השטוחes עם אטם ביניהם, עם נמל יבוא ו יצוא ממוקם על הצלחת העליונה, שדרכו השעיה תא perfused באמצעות מזרק לשאוב ^{7,8, 9.} פני השטח של הצלחת התחתונה יכולים להיות מצופה עם monolayer התא / מצעים רלוונטיים והאינטראקציה בין תאי perfused והשטח תחת זרימת גזירה היא לאחר מכן בחן ^7. עם זאת, PPFC היא תפוקה נמוכה, מגיב בעליות, ושיטה מייגעת למדי, עם היווצרות בועה, נזילה ותזרים מבוקר היטב הצגת חסרונות עיקריים.

טכניקה חלופית לPPFC המסורתי היא מערכת microfluidic צלחת רבת היטב, המאפשר ביצועים גבוהים יותר תפוקה של מבחני סלולריים (גבוהים יותר עד פי 10 מ PPFCs) תחת זרימת גזירה מדויקת, מבוקר מחשב, עם הצריכה נמוכה מגיב ^1,10. ניסויים מתגלגלים תא מבוצעים בתוך ערוצי microfluidic, שיכול להיות מצופה עם monolayers תא או מצעים מהונדסים וצלם USIng מיקרוסקופ, עם מאפיינים מתגלגלים בקלות נותח באמצעות תוכנה מתאימה. במחקר זה, אנו מדגימים את היכולות של מערכת צלחת רב גם זה microfluidic על ידי בוחן את המאפיינים המתגלגלים של לוקמיה פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים על משטחים שונים. HL-60 מתגלגל על ​​מצעים כמו P-ו-E-sel, כמו גם על משטחי תא לבטא קולטנים מתגלגלים שונים, נותחו. בנוסף, נוגדנים (Ab) חסימה שימשו להפגין מעורבות ישירה של selectins הספציפי בתיווך תנועת הגלגול של HL-60 על משטחים אלו. ניסויים מתגלגלים בוצעו עם תפוקה מוגברת, תחת זרימת גזירה יציבה, עם הצריכה מגיב / תא מינימאלי, המאפשרים ניתוח יעיל של פרמטרים מתגלגלים מפתח כגון מהירות מתגלגלת, מספר התאים מתגלגלים, ומאפייני דרך מתגלגלים.

Protocol

1. תרבית תאים

1. לוקמיה פרומיילוציטית אדם תאים (HL-60)
   1. תרבות HL-60 תאים ב75 סנטימטר ² צלוחיות עם 15 מיליליטר של המדיום (IMDM) של Iscove השתנה Dulbecco, בתוספת 20% (v / v) בסרום שור העובר (FBS), 1% (v / v) L-גלוטמין ו 1 % (V / v) פניצילין, סטרפטומיצין.
   2. שינוי בתקשורת כל 3 ימים על ידי aspirating חצי של ההשעיה נפח התא והחלפתו בתקשורת IMDM מלאה.
   3. לdiacetate carboxyfluorescein, מכתים succinimidyl אסתר (CFSE), HL-60 השעיה צנטריפוגה תאים (400 XG, 5 דקות), resuspend בפתרון CFSE 1 מיקרומטר (שהוכן PBS prewarmed) ו דגירה במשך 15 דקות ב37 ° C. לאחר מכן תאי צנטריפוגה, לשאוב supernatant ותאי resuspend במדיום prewarmed טרי למשך 30 דקות. שטוף תאים בPBS ולאחר מכן להשתמש בניסויים מתגלגלים (ראה איור 1 ב לתמונה מייצגת של HL-60 תאים צבעוניים CFSE על מצופה sel P פני השטח).

ss = "jove_content"> הערה: מכתים CFSE הוא אופציונלי, והוא מוצג כאן כדי להמחיש את התופעה מתגלגלת בערוץ microfluidic. ניתוח של פרמטרים מתגלגלים מוצגים בכתב היד הזה בוצע על תאים בלא כתם באמצעות הדמיה brightfield סטנדרטית.

2. תאי אנדותל כלי הדם ריאה (LMVECs)
   1. 100 מ"מ צלחות פטרי עם מעיל 0.1% פתרון ג'לטין (v v / PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות.
   2. LMVECs תרבות ב100 מ"מ צלחות פטרי ג'לטין מצופה במדיום גידול אנדותל השלם (בינוני 2 (EBM-2) אנדותל בסיסי), בתוספת ערכת תוסף צמיחה מסוימת, ראה ראגנטים). שינוי בתקשורת בכל יום אחר ותאים תת תרבות עם הגיע מפגש 80-90%.
   3. עבור תת תרבות, לשטוף תאים עם PBS ולאחר מכן לנתק את התאים עם 4 מיליליטר של 1x טריפסין-EDTA במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולנטרל בנפח שווה של EBM-2 מדיה מלאה. מעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר וcentrifugדואר (400 XG, 5 דקות). בעקבות צנטריפוגה, resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר של תקשורת אנדותל השלמה ולספור תאים עם hemocytometer. האם התאים לא מעל המעבר, שכן זה משפיע על המורפולוגיה שלהם ותפקוד שימוש רק תאים תחת חלוף 7 לכל הניסויים.

3. שחלות-P-selectin הסיני תאים (CHO-P)
   1. תאי CHO-P, שהם תאי CHO יציבות transfected להביע את P-sel האנושי, נמסרו על ידי משתפי פעולה (בית ישראל דיקונס מרכז רפואי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד) ^11,12.
   2. תרבות תאי CHO-P בס"מ T175 ² צלוחיות ב25 מיליליטר של ה-F-12 תקשורת.
   3. לpassaging, לשטוף תאים עם 10 מיליליטר של PBS ל4-5 שניות ולאחר מכן trypsinize ב10 מיליליטר של 1x טריפסין-EDTA במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ואחרי נטרול באמצעי תקשורת מלאה.
   4. צנטריפוגה ההשעיה תא (400 XG, 5 דקות), לשאוב בזהירות את supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של תקשורת מלאה ולספור את התאים עםhemocytometer.

2. מבצע של מערכת microfluidic הצלחת רב גם המשולבת

1. ודא שכל הציוד מחובר כראוי ולהדליק מודולים השונים: מחשב, בקר, מיקרוסקופ ההפוך, ומצלמת CCD.
2. פתח את תוכנת ההדמיה; לוודא מודול הצלחת רב גם ומודול ההדמיה מוצגים כראוי על המסך.
3. חבר את הצינורות למלכודת האדים (מחוברת לבקר) וגם לחבר אותם לממשק הלחץ.
4. מניחים את הצלחת רב גם בתנור / מתאם צלחת. להוסיף חומרים כימיים לבארות (שיפורט להלן) ולצרף את ממשק על גבי הצלחת. מניחים צלחת להדמיה בשלב אוטומטי.
5. הממשק מתחבר לחלק העליון של הצלחת וחל בלחץ פנאומטי מן הבקר לחלק העליון של הבארות, הנהיגה הנוזל דרך ערוצי microfluidic בקצב הזרימה המוגדר, לשלוט בקלות באמצעות הצלחת רב גםמסך מודול תחת מצב ידני.
6. ריאגנטים בערוץ הזרימה על פני שטח תצפית, הממוקם בין הבארות. ממדי ערוץ microfluidic הם 350 מיקרומטר x רחב 70 מיקרומטר גבוה. אורכו של הערוץ ליניארי הוא 1 מ"מ והתחתון של הערוצים כולל זכוכית coverslip 180 מיקרומטר, אשר תואם עם brightfield, שלב, הקרינה ומיקרוסקופיה confocal.
7. לרכוש קטעי וידאו באמצעות מצלמת CCD (רכישת הנחל, 11 מסגרות / sec) ולנתח באמצעות תוכנה תואמת.

3. ציפוי של ערוצי microfluidic עם מצע חלבון או חד שכבתי נייד

1. ציפוי ערוץ microfluidic עם פיברונקטין או P-/E-selectin
   1. הכן 1 מיליליטר של 20 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין פתרון ב-PBS. אלתר נפח המבוסס על מספר הערוצים להיות מצופים (להשתמש 25-50 μl של פיברונקטין לכל ערוץ).
   2. הוספת 25-50 μl של פתרון פיברונקטין לכל כניסה כן. להפעיל כוח גזירה של 2 dyn / ² סנטימטרבמשך 5 דקות כדי תנקבנה את הערוץ. לתשומת לבך חרוז של נוזל המופיע גם בשקע. דגירה של 30-45 דקות ב RT
   3. לשאוב את הפתרון מבארות (לא לשאוב ישירות ממעגל ביניים המזין את הערוץ) ^1,13. להוסיף 200-500 μl של PBS לשקע היטב ולשטוף ערוץ עם PBS על ידי יישום זרימת גזירה של 2 dyn / ² סנטימטר על 5 דקות. הערוץ כעת מצופה כראוי עם פיברונקטין ומוכן לשימוש.
   4. למעייל עם P-או E-sel, להכין פתרון 5 מיקרוגרם / מיליליטר של חלבון רקומביננטי אדם הרצוי ב-PBS, ומעיל הערוצים כפי שתואר לעיל, עם דגירה השעה 1 ב37 ° C כדי לאפשר ציפוי פני השטח.
2. יצירה של CHO-P או LMVEC monolayer בתוך הערוץ microfluidic
   1. בעדינות trypsinize תאים ממנות התרבות במשך 3 דקות, להרוות באמצעות נפח פי 2 מתקשורת ו צנטריפוגות מלאה (5 דקות ב400 XG). תאי resuspend עם 10 מיליליטר של תקשורת ו צנטריפוגות מלאה (5 דקות ב400 XG) again.
   2. ספירת התאים כדי לקבוע ריכוז תא בהשעיה. כדי להבטיח את היווצרות monolayer LMVEC מחוברות בתוך הערוץ, להביא את ריכוז תא ל15-20 מיליון תאים / מיליליטר. לmonolayer תא מחוברות CHO-P, השתמש 50-60 מיליון תאים / מיליליטר. מספר תא ראשוני לקבוע משמש לניסוי בהתאם - השתמש 25-50 μl של תא השעיה לכל ערוץ.
   3. הוספת 25-50 μl של השעיה תא בריכוז המתאים לכניסה טובה. מניחים את הצלחת על הבמה מיקרוסקופ ולהציג את התאים לתוך הערוץ (2 dyn / ² סנטימטר) ועד לתאים הם נצפו על המסך ממלא את כל הערוצים, ולאחר מכן לעצור את הזרימה.
   4. מלא את שני לשקע ויניקה עם 200 μl של או LMVEC מלא או מדיה CHO. בואו התאים להתיישב ולדבוק עבור 3 שעות בחממה (37 מעלות צלזיוס, CO ₂ של 5%).
   5. לאחר הדגירה 3 שעות, לשטוף את הערוץ עם תקשורת מלאה (2 dyn / ² סנטימטר, 10-15 דקות) כדי להסיר פנויתאים. תאים אמורים להופיע מחוברות לחלוטין והערוץ עכשיו הוא מוכן לשימוש. בהתאם לצפיפות זריעת תאים ראשונית, ייתכן שיידרשו 2-3 שעות נוספות ליישוב זמן כדי להבטיח כיסוי של המשטח שלם עם התאים.

4. הפעלת Pro דלקתית LMVEC וחסימה של נוגדן P-/E-selectin

1. הכן פתרון TNF-α (10 ng / ml) בתקשורת הבסיסית LMVEC.
2. כדי לגרום להפעלה דלקתית של LMVEC בערוצים, להוסיף מפתרון TNF-α 100 μl למפרצון היטב ולהציג את הפתרון לערוץ על ידי יישום זרימת גזירה של 2 dyn / ² סנטימטר על 5 דקות. עבור ערוצי שליטה (ECs nonactivated), להוסיף מתקשורת הבסיסית LMVEC 100 μl למפרצון היטב ולהכניס לערוץ (2 dyn / ² סנטימטר על 5 דקות). הערוץ מוכן לassay מתגלגל עכשיו.
3. כדי לחסום P-sel ו-E-sel על LMVECs ותאי CHO-P, להציג נטרול P-sel (AK4 שיבוט, 5 מיקרוגרם / מיליליטר בbaתקשורת סאל) או E-sel (P2H3 שיבוט, 5 מיקרוגרם / מיליליטר בתקשורת הבסיסית) נוגדנים לתוך הערוץ ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C. בשלב בא, לשטוף את הערוצים עם תקשורת הבסיסית (2 dyn / ² סנטימטר על 5 דקות). ערוצים מוכנים לassay מתגלגל עכשיו.

5. HL-60 רולינג Assay בערוצי microfluidic מצופה חד שכבתי תשתית / הסלולרי

1. לבחון בזהירות את הערוצים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר שערוצים הם מצופים כראוי (במקרה של ציפוי עם תאים, monolayer תא מחוברות באופן מלא יש לשים לב).
2. כדי להכין HL-60 השעיה תא לניסויים מתגלגלים, HL-60 צנטריפוגה ההשעיה תא (5 דקות ב400 XG) ולשטוף פעם עם תקשורת הבסיסית. ספירת התאים ו resuspend ב IMDM (התקשורת הבסיסית, המכילים Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +)} כדי ליצור השעיה תא HL-60 עם 5 מיליון תאים / מיליליטר. השתמש 25-50 μl של השעיה תא לכל ערוץ כדי לבצע את assay מתגלגל.
3. הוספת 25-50 μl של suspe התאnsion לשקע היטב, צלחת מקום בתוך בעל הטמפרטורה מבוקרת צלחת (37 מעלות צלזיוס) ומניחים על הבמה מיקרוסקופ. בשלב בא, להציג את התאים לתוך התעלה על ידי הפעלת כוח גזירה של 2 dyn / ² סנטימטר (יש לשים לב תאים בתוך 10-15 שניות זורמים משקע למפרצון).
4. כדי לבחון את התגובה מתגלגלת כפונקציה של מאמץ גזירה, להפחית את הגזירה ל0.25 dyn / ² סנטימטר ולרכוש 20-30 קטעי וידאו שניות (באמצעות פונקציה "רכישת זרם") בכל גזירה רצויה (להגביר את הגזירה בהדרגה מ0.25 עד 5 dyn / ² סנטימטר. אפשר גם להשתמש במספריים גבוהים יותר).
5. לרכוש קטעי וידאו באמצעות מצלמת CCD (רכישת הנחל, 11 מסגרות / sec) ולנתח מהירויות גלגול שבילים ומתגלגלים באמצעות תוכנה תואמת.

6. Cytometry זרימה לזיהוי ביטוי של מולקולות פני שטח

1. בעקבות trypsinization, להכין השעיה תא (באמצעות 1-2 x 10 ⁵ תאים / לדוגמא) מסוג תאים רצוי (HL-60, CHO-(P או LMVECs) ב-PBS - / -), בתוספת 2% FBS. שטוף תאים פעמיים ולהביא את נפח דגימה 50 μl (תוך שימוש באותו המאגר).
2. דגירה כל דגימה עם Ab הרצוי fluorophore מצומדות (ראה טבלה המצורפת לקבלת מידע מפורט) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (מכסה בנייר אלומיניום).
3. לשטוף את התאים פעמיים (אותו חיץ) ולהביא את הנפח סופי של השעיה תא מוכתמת 200 μl. ניתוח דגימות באמצעות cytometer זרימה לזהות ביטוי של מולקולות פני השטח.

תוצאות

HL-60 תאים גלגל על ​​משטחי P-ו-E-selectin, אבל לא על פיברונקטין

HL-60 תאים נחשבים "רולים" תקן זהב כפי שהם מבטאים מגוון של ligands מתביית, כולל ligands מתגלגל P-גליקופרוטאין sel יגנד-1 (PSGL-1) וSialyl לואיס X (SLeX) ^5,14 (איור 1 א ). חלבון משטח PSGL-1 ...

Discussion

אחד האתגרים המרכזיים בתרגום מוצלח של טיפול מבוסס תאי אקסוגני הוא חוסר היכולת לספק תאים ביעילות לאתרים של פגיעה ודלקת הגבוה engraftment יעילות ^3. מתגלגל תא מייצג שלב קריטי בתהליך של ביות של תאים, להקל על ההאטה של תאים בדפנות כלי דם, סופו של דבר מוביל להידבקות המשרד וגל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)	Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells	ATCC	CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156
EBM-2 Media	Lonza	CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements	Lonza	CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots	Lonza	CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x	Gibco	12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)	Gibco	11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)	Gibco	15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM	Gibco	25030
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	Sa550
Petri Dishes	BD Falcon	BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)	MedSupply Partners	TC1500
T75 Flasks	BD Falcon	353136
Gelatin Solution (2%)	Sigma	G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)	Sigma	D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E	R&D Systems	BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA21
Anti-hP-Selectin	R&D Systems	BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control	BD Bioscience	555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18	Santa Cruz	SC70545
FITC Conjugated	Santa Cruz	SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control	Santa Cruz	SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1	BD Pharmingen	556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control	BD Pharmingen	550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)	Santa Cruz	SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3	Millipore	MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control	Santa Cruz	SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha	PeproTech	300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry	Invitrogen	C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma	Invitrogen	33016-015
Equipment
Bioflux 1000	Fluxion Biosciences	Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates	Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD Bioscience	CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S	Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera	Photometrics