דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

Abstract

דור של אוכלוסייה הומוגנית ושפע של תאי שריר שלד מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הוא דרישה לטיפולים מבוססי תאים ול" מחלה בצלחת "מודל של מחלות neuromuscular אדם. מכשולים עיקריים, כגון שפע וההטרוגניות של האוכלוסייה של עניין, כמו גם חוסר פרוטוקולים להיווצרות של מבני התכווצות תלת ממדים נמוכים, הגבילו את היישומים של תאי גזע לטיפול בהפרעות התוקפת. יש לנו תוכנן פרוטוקול המתגבר על מגבלות אלה על ידי הכנסה מחוץ לרחם של גורמים שהוגדרו בhESCs - MyoD גורם נחישות השריר והכרומטין SWI / SNF שיפוץ BAF60C רכיב מורכב - כי הם מסוגלים לתכנת מחדש hESCs לתאי שרירי שלד. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול מבוסס כדי ליצור myoblasts נגזר hESC ולקדם את האשכולות שלהם לתוך מבני tridimensional מיניאטורי (myospheres) שרירי שלד מיניאטורי פונקציונלי לחקות ⁷

Introduction

בגלל היכולת הייחודית שלהם לעצמית לחדש תוך שמירת pluripotency, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נחשבים משאב יקר ערך ברפואת רגנרטיבית. דור גזע אכלוס תא בתיווך של שרירים פגועים ותאי hESC או גזע pluripotent מושרה (iPSC) נגזר של שרירי שלד לדוגמנות מחלה במבחנה הם מטרות עיקריות של מחקרים שמטרתם איתור וטיפולי הבהרה בפתוגנזה של מחלות רבות התוקפת. עם זאת, מחקרים אלה כבר לערער על ידי ההתנגדות של hESCs להמיר לתאי שרירי שלד ועל ידי מיעוט מידע לגבי הרגולציה המולקולרית של hESC-מחויבות כלפי myogenesis שלד. ואכן, ניסיונות קודמים ליצור אבות שרירי שלד מhESCs גילו כי רק גוף embryoid progenies (EB) נגזרת או תאי mesenchymal מוסמך להפעיל myogenesis השלד הבא ביטוי מחוץ לרחם של מפעילי תעתיק (לדוגמא:PAX3 או Myf5) ^1-3 או על ידי חשיפה לתנאי תרבות הספציפיות ^4-5.

הראינו בעבר כי רכיב SWI / SNF, BAF60C (המקודד על ידי SMARCD3), הוא מרכיב חיוני של מכונות תעתיק המאפשרת הפעלה בתיווך MyoD של לוקוסי שרירים ספציפיים ^6. יש לנו גילינו לאחרונה כי ההיעדר סלקטיבית של BAF60C מקנה על hESCs ההתנגדות להפעלה בתיווך MyoD של myogenesis שלד ⁷ כי הוא ציין אחרת בBAF60C לבטא בתאים סומטיים ^8-10, תהליך המכונות המרת myogenic כ. ביטוי מאולץ של BAF60C מאפשר MyoD להפעיל ישירות myogenesis השלד בhESCs, בתנאי תרבות ספציפיים, עם BAF60C וMyoD הטלת חתימה אפיגנטיים המתחייבת hESCs כלפי שושלת myogenic ^7. ראוי לציין, ניתוח proteomic הקודם חשף את ההיעדר סלקטיבית של BAF60C, בין רכיבי SWI / SNF, ^ב11 ESCs. השתמשו בידע זה כדי להטיל מחויבות אפיגנטיים של hESCs על שושלת myogenic, מוביל את הדור של אוכלוסייה הומוגנית של myoblasts שלד שיכול להצטבר ליצירת התכווצות תלת ממדים מבנים (myospheres) כי שרירים פונקציונלי לחקות מיניאטורי שלד ^7. אכן, השיטה של יצירת תאי אב שרירי שלד מhESCs מסתמכת על המחויבות אפיגנטיים של hESCs לשושלת myogenic, שהוא phenotypically סמויה עד תאים נחשפים לאותות בידול, כגון תא צבירה ותרבות במדיום התמיינות (ראה פרוטוקול ספציפי). אסטרטגיה זו מאפשרת הרחבה של אוכלוסייה הומוגנית של hESCs שepigenetically מחויבים לשושלת שרירי שלד ומתאימה להיווצרות myospheres התכווצות תלת ממדים כי לשחזר היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים של שלדשרירים. Myospheres מספק את ההוכחה הראשונה של שרירים מוקטנים לניצול ל" מחלה בצלחת "מודל של מחלות שרירים. כאשר נוצר מiPSCs המטופל נגזר, יש לי myospheres אלה הפוטנציאל לברר שאלות התפתחותיות ארוכי שנים ופתוגנזה של מחלות נדירות, בנוסף למציע פוטנציאל האדיר ככלי להקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות טיפוליות. אנחנו גם לציין כי קריאת נתונים מיידיות אחד של ניתוח myosphere יכולים להיות מסופקים על ידי אימונוהיסטוכימיה על סעיפים, כפי שתוארו בפרוטוקול יופיטר על ידי גומז et al. ¹²

Protocol

1. זיהום של hESCs

פרוטוקול זה דורש BAF60C גבוה lentiviruses כייל הקידוד וMyoD ^13. מבנים אלה זמינים על פי דרישה.

1. המלצות לפני שמתחיל
   1. על מנת להבטיח את היעילות גבוהה של הזיהום, hESCs צלחת לזיהום בתנאים ללא מזין (איור 2 א) כדי לחסל את המתחרים סלולריים בעת הספיגה נגיפית. ואכן, MEFs קל יותר לשמצה להדביק לעומת hESCs ומוכשרים לגיור בתיווך MyoD. לפיכך, ביטול MEFs מתרבויות hESC מגדיל את שיעור הזיהום.
   2. מומלץ לי lentiviruses כייל גבוה כדי להבטיח יעילות גבוהה של זיהום. אפשרויות כדי לשפר את היעילות של זיהום נדונות בסעיף "בדיקת זיהום".
   3. הכן את הצלחות מצופים matrigel על ידי הוספת 1 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר Matrigel בכל טוב ולהשאיר שעה לפחות 1 ב RT (או O / N אטום על 4 מעלות צלזיוסאם הכין היום קודם).
2. הליך זיהום
   1. יום לפני הזיהום
      1. הוספת תא שיבוט הס & מוסף שחזור במדיום בדילול 1,000 X (2 ריכוז סופי מ"מ).
   2. יום 0 - זיהום עם BAF60C
      הערה: בצע את הזיהום של hESCs עם BAF60C הראשון ואחריו זיהום עם MyoD.
      1. לנתק גם צלחת 6 היטב של hESCs גדלה כמושבות ¹⁴ בהשעית תא בודד על ידי דגירה עם 1 מיליליטר של TrypLE 5 דקות ב37 ° C.
      2. העברת השעיה לצינור 15 מ"ל, להוסיף 9 מיליליטר של מדיום hESC ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל"ד.
      3. במהלך צנטריפוגה, להכין את תערובת הזיהום בצינור נקי על ידי הוספת 1 מיליליטר של mTeSR1, polybrene (6 מ"ג / מיליליטר) ותוספת תא הס שיבוט ושחזור (2 מ"מ).
      4. Re-להשעות את התא גלולה (x ⁵ -1 10 ⁶ תאים כ 5 x 10 מג אחדonfluent גם של hESCs) עם 1 מיליליטר של תערובת זיהום וצלחת על צלחת קובץ מצורף 6 גם נמוכה, מה שמונע מתאי שמירה על הפלסטיק.
      5. הוספת BAF60C-IRES-GFP וירוס ב10 ⁸ משרד הפנים ודגירה 3 שעות בחממה
      6. אסוף את ההשעיה התא המכילה וירוסים ולחלק באופן שווה בשתי בארות מצופים matrigel. לאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של תא מוסף שיבוט ושחזור mTeSR1 + הס היטב כל אחד ולעזוב O / N בחממה.
   3. יום 1
      1. מוציא בזהירות את המצע המכיל את הווירוס ולהחליף עם 2 מיליליטר של תא שיבוט mTeSR1and הס & מוסף שחזור. תאים יתחילו להתנהל בכבדות, כפי שמוצג באיור 2.
   4. Day2 - זיהום עם MyoD
      1. לפני שימשיך לבדוק את מצב הקרינה של התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שיש יעילות גבוהה של זיהום. אם לא, עיין בסעיף "בדיקה להדביקיון ".
      2. אם התאים הגיעו לפחות 80% ממפגש, פעל באופן הבא; אחרת לחכות ליום נוסף לפני שתמשיך.
      3. הסר את המדיום ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב TrypLE לנתק את התאים. דגירה 5 דקות ב37 ° C.
      4. חזור על פעולה כfrom1.2.2.2 תאר - 1.2.2.6 הוספת וירוס MyoD ב10 ⁸ משרד הפנים.
   5. יום 3
      1. מוציא בזהירות את המצע המכיל את הווירוס ולהחליף עם 2 מיליליטר של תא שיבוט mTeSR1and הס & מוסף שחזור.
      2. MEFs צלחת על matrigel מצופה צלחות ב2.5 x 10 ^5/2 סנטימטר ליום המחרת כדי לאפשר התפשטות של התאים הנגועים.
   6. יום 4
      1. הסר את המדיום ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב TrypLE לנתק את התאים. דגירה 5 דקות ב37 ° C.
      2. להעביר את התאים בצינור בז 15 מ"ל, להוסיף 9 מיליליטר של מדיום hESC ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל"ד.
      3. Rסר supernatant מחדש להשעות ב6 מיליליטר של מדיום hESC.
      4. הוצא את המדיה מצלחת MEFs המכיל 6 היטב וhESCs צלחת ב1:02 יחס מפוצל, מחלק 3 מיליליטר לכל MEFs המכיל היטב.
         עצה! כאשר המושבות להגיע למפגש, חלק מהבארות של תאי MyoD/BAF60C-infected אפשר להקפיא בחנקן נוזלי כמניית מילואים. מדיום הקפאה כולל 90% מKOSR וDMSO 10% בתוספת 2 תאי שיבוט מ"מ הס & מוסף שחזור. הבארות הנותרות ניתן לאחר מכן נחשפו לפרוטוקול הבידול - ראו בהמשך לתיאור. אם יש צורך יותר תאים לייצר יותר myospheres, יכול להיות מופץ hESCs הנגוע נוסף באופן הבא:
      5. הסר את מדיום דגירה עם 1 מיליליטר של 1 מ"ג / IV collagenase מיליליטר במשך 5 דקות ב37 ° C.
      6. הסר IV collagenase ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום hESC.
      7. תחת מיקרוסקופ לנתיחה לגרד את המושבות עם טיפ 10 מיליליטר.
      8. לאסוף את גושי colonies בצינור 15 מ"ל ולאפשר למשקעים במשך 3 דקות. ואז להסיר את supernatant, resuspend במדיום hESC וצלחת על צלחות MEFs באמצעות 01:04 יחס.
3. בבדיקה זיהום
   1. בעוד מתפשט התאים, מומלץ לצלחת התאים הנגועים בקנה מידה קטנה יותר למסוק לניתוח RNA ולבצע ניתוח ביטוי חלבון על ידי immunofluorescence כדי לבדוק סמנים ביולוגיים המשקפים את המצב ביולוגי הנכון בכל שלב (ראה תוצאות נציג). לlentiviruses גבוה כייל את אחוז הצפוי התאים נגועים צריך להיות לפחות 80%.
   2. כדי להבטיח יעילות גבוהה, יכולים להיות שונה הווקטורים lentiviral, מציגים סמן בחירת ניאון ו / או עמידות לאנטיביוטיקה. פלסמיד lentiviral להביע BAF60C גם נושא הקרינה ה-GFP.
   3. מיון hESCs עבור סמן פלואורסצנטי. במקרה של יעילות הנמוכה של זיהום מומלץ להשתמש בקרינהתאי ctivated מיון (FACS-מיון) להעשרה לתאים לבטא וירוס BAF60C ולאחר מכן להדביק את התאים בוירוס MyoD גבוה כייל.
      1. הוספת תא שיבוט הס & מוסף שחזור במדיום היום לפני המיון.
      2. יום המיון, לנתק את התאים על ידי TrypLE (כפי שמתואר ביום 0) ו resuspend התאים בסרום KO החלפה בתוספת תא הס מוסף שיבוט ושחזור בFACS-צינורות.
      3. בסופו של המיון, לאסוף את התאים בסרום החלפת KO וצלחת על צלחות MEFs הוספת תא שיבוט הס & מוסף שחזור.

2. אינדוקציה והתמיינות כמו EB

1. הליך אינדוקציה והתמיינות
   1. יום 0 - אינדוקציה EB
      1. ודא, לפני שמתחיל בידול מBAF60C/Myod-infected hESCs, יש מספר גבוה של מושבות בבאר (איור 2 ג).
      2. עבור כל r כןסר בינוני, לשטוף עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של 1 מ"ג / IV collagenase מיליליטר. דגירה במשך 5 דקות ב37 ° C.
      3. הסר collagenase ולהוסיף 1 מיליליטר של EB בינונית.
      4. תחת מיקרוסקופ לנתיחה במהירות מכאנית לנתק את המושבות ל400-800 אגרגטים תא על ידי גירוד עם טיפ 10 מ"ל.
      5. לאסוף את הגושים של מושבות בצינור 15 מ"ל ולאפשר למשקעים במשך 3 דקות. הסר את supernatant, מחדש להשעות ב 3 מיליליטר של EB בינונית ולהעביר את ההשעיה התא היטב אחד 6 גם נמוך צלחת קובץ מצורף.
   2. יום 1
      1. בדוק את גודל המושבות והמוות של התאים לפני שתמשיך. אם גושים גדולים נמצאים, לשבור אותם בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טפטפת 5 מ"ל, 3-4 פעמים. אם המוות של התאים הוא גבוה מאוד (תאים רבים צפים ופסולת) להחליף את המדיום על ידי איסוף אגרגטים בצינור 15 מ"ל על ידי כוח הכבידה וצלחת אותם עם 3 מיליליטר של מדיום EB הטרי, אחרת ימשיכו כדלקמן.
      2. הוסף 1.5מיליליטר של מדיום EB הטרי בבארות
   3. יום 2
      1. לשנות את המדיום על ידי איסוף אגרגטים מהבארות בצינור 15 מ"ל. תן להם להתיישב למשך 2 דקות.
      2. הסר את supernatant, להחליף עם 3 מיליליטר של מדיום EB הטרי ולהפיץ מחדש באותו בארות.
   4. יום 3
      1. הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום EB הטרי בבארות.
   5. יום 4
      1. המשך כמתואר ב" יום 2 ".
   6. יום 5 - בידול myogenic של אשכולות כמו EB (איור 2 ד).
      1. לאסוף המצרפים כפי שמתואר ב2.1.3.1 ולשטוף פעם עם 2 מיליליטר של PBS; לאפשר מצטבר למשקעים.
      2. הסר PBS ולהוסיף 3 מיליליטר של מדיום DM; צלחת באותו בארות.
   7. יום 6 - יום 20
      1. מD6 לD20 להחליף בינוני עם בינוני טרי כל 3 ימים. myospheres נציג מוצג בFigure 2E.
2. בידול myosphere בדיקה
   1. לפני שתמשיך הלאה, מומלץ לבדוק את היעילות של בידול myogenic בתוך myospheres על ידי ביצוע חתכים של myospheres המשובץ במתחם אוקטובר, כפי שתואר בפרוטוקול יופיטר קודם ^12. לבצע מכתים immunofluorescence עבור סמני myogenic כגון myognenin (F5D שיבוט, DSHB) ושרשרת שרירן כבדה (MF20 שיבוט, DSHB) (ראה תוצאות נציג).
      עצה! כדי להצליח עם הצביעה לmyogenin על סעיפי EB זה קריטי לבצע אחזור אנטיגן על ידי טיפול עם נתרן גופרתי dodecyl (SDS) 0.5% למשך 5 דקות. בנוסף, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לצביעה הכפולה באמצעות נוגדני F5D וMF20.

3. מתכוני מדיה

1. בינוני ESC
   DMEM-F12
   1 מ"מ L-גלוטמין
   20% סר נוקאממ בינוני החלפה (KOSR)
   0.1 חומצות אמינו חיוניות מ"מ (NEAA)
   50 פניצילין U / ml / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס)
   0.1 מ"מ בטא mercaptoethanol
   8 ng / גורם גדילת מיליליטר בסיסי פיברובלסטים (bFGF)
2. EB בינונית
   DMEM F12
   1 מ"מ L-גלוטמין
   15% FBS
   5% סרום סוסים
3. בינוני DM
   DMEF F12
   מוסף שלה 1X הנוזלי מדיה
   מוסף 1X N-2

תוצאות

איור 1 א מציג סכמטי של הפרוטוקול מוצע כדי ליצור myospheres מhESCs. שלבים הקריטיים כדי לשלוט (מסומן על ידי החיצים) הם את היעילות של הזיהום בhESCs והמרת myogenic בתוך myospheres.

בניסויים שלנו אנו מנצלים BAF60C קידוד וקטור lentiviral שנושא הקרינה ה-GFP. אנחנו בדרך כלל להדביק את התאים עם BAF60C וFACS-סוג 72 שעות לאחר הזיהום להעשיר לאוכלוסייה להביע BAF60C. כאשר התאים מגיעים סביב 70-80% מנקודת המפגש, אנחנו להדביק עם lentivirus MyoD. לאחר ההדבקה הראשונה זה בדרך כלל לוקח יומיים או שלושה לתאים כדי להגיע למפגש הזה.

איור 1 מציג את רמות ביטוי של גנים אקסוגניים כמו קיפול אינדוקציה ביחס לhESCs לא נגוע. תרשים 1C מציג את הביטוי והפצה ברמת החלבון של הגורמים הציגו. BAF60C ביטוי מוצג כקרינת ה-GFP, ואילו ביטוי MyoD הוא זוהה על ידי immunofluorescence עם נוגדן MyoD. אנו רואים ביום 0 היום אנחנו מתחילים את הבידול של hESCs הנגוע לתוך אגרגטים כמו EB. לאחר 15 ימים במדיום DM, חלק מmyospheres (בדרך כלל גם כל אחד) מוטבע במתחם אוקטובר ¹² ומחולק לבצע immunofluorescence עבור סמני myogenic כדי לבדוק את יעילות המרת myogenic. 1D איור תערוכות מכתים נציג לmyogenin ושרשרת כבדה שרירן ב בידול myogenic אופטימלי. Myospheres יכול לקבל צורות שונות או יוצאות דופן, אולי כתוצאה מהתמזגות עם myospheres קטן יותר. החל מיום 10, אפשר להתבונן התכווצות סדירה בmyospheres (ראה סרט 1 ו -2).

"/> 43/51243fig1.jpg
איור 1.) סכמטי של הפרוטוקול המשמש לייצור myospheres מhESCs. B) רמות ה-mRNA של גנים אקסוגניים בhESCs נגוע בBAF60C וMyoD (H9-BM) פיקוח על ידי qRT-PCR והביע כאינדוקציה לקפל, כמו לעומת ללעוג hESCs הנגוע תמונות Immunofluorescence (H9-CTR). C) מראים כתמי MyoD (אדום) וקרינת BAF60C (ירוק) בשל אלמנט IRES-GFP בוקטור Immunofluorescence. ד ') שבוצע בסעיפי myosphere המוכתמים עבור Myogenin (MYOG ), שרשרת השרירן כבד (MyHC) וcounterstained לDAPI (ראה פירוט Immunofluorescence). בר סולם הוא 100 מיקרומטר.

איור 2. תמונות מייצגות של מראה תא בשלבים שונים שלפרוטוקול מהזיהום (חלק I) לבידול (חלק ב '). בר סולם הוא 100 מיקרומטר. ואילו מבנים דמויי-EB מD1 ל D5 הם בעיקר בצורה עגולה (ד '), myospheres גדל מעל 15 ימים על פי התכנית באיור 1 א מציגה צורה בלתי צפויה והן הטרוגנית בתרבות; לראות שתי דוגמאות בE ו-F.

Discussion

הפרוטוקול המוצע כאן מתאר כיצד ליצור אשכולות תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres) ישירות מhESCs. יש האסטרטגיה המוצעת פוטנציאל חסר תקדים ויוצא דופן כדי לייצר את שרירי מיני בהשעיה שיכולה להיות מתאים כמו "מחלה בצלחת" מודל עבור שני מבחני מיון ומחקרים התפתחותיים. יתר על כן, השיטה לייצר myospheres מhESCs היא פשוטה ואינה דורשת כל צעד מיון FACS במהלך ההתמיינות, אשר בדרך כלל יש לו השפעה שלילית על התשואה של תאים התאוששו. חוץ מזה, הליך מיון במהלך ההתמיינות יפריע לצבירה מכיוון שהיא מרמזת ניתוק של EB לתוך תאים בודדים.

השיטה המוצעת מבוססת על reprograming אפיגנטיים של hESCs עם גורמים ספציפיים, MyoD וBaAF60C, שאינם באים לידי ביטוי בתאי גזע עובריים pluripotent. MyoD וBAF60C לספק את ה החלבון המורכבת "הליבה"בסימני הלוקוסים הגנומי שממנו השעתוק ממשיך להפעיל את תכנית myogenic השלד. שני הגורמים מועברים לתאים בדרך של זיהומי lentiviral ולכן זה קריטי כדי להשיג את יעילות גבוהה של זיהום של שני הגורמים בכל התאים. זו יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בוירוסי כייל גבוהים או וירוסי ניחן סמני בחירה. תנאי תרבות גם לשחק תפקיד חשוב באופטימיזציה של מידת בידול myogenic. אנו מציעים מבוססי פרוטוקול סרום בידול לבידול של MyoD/BAF60C להביע hESCs לתוך אשכולות של מבשרי myogenic, ואחריו דגירה במדיום מוגדר סרום ללא (המכיל אינסולין transferrin - ITS) כדי להשיג המרה של מבשרי myogenic לmyotubes שלד. עם זאת, זה אפשרי, כי תקשורת מוגדרת אחרת יכולה להשיג בידול myogenic שווה או טוב יותר. מגבלה הנוכחית של הפרוטוקול היא שהוא מסתמך על השימוש בסרום שור עוברי, אשר, מלבד להכילing חלבונים מן החי וחומרים רבים, מציג וריאציות הרבה להרבה. זה עלול לגרום ליעילות נמוכה יותר או ההטרוגניות של המרה myogenic בתוך myospheres. ראוי לציין, שלא כל המבנים דמויי-EB נגזרים מBAF60/MyoD-expressing hESCs הם myospheres; כלומר, חלקם מצרפים כמו EB לחלוטין המורכב של myofibers. מספר myospheres בדרך כלל נגזר מhESCs להביע BAF60C וMyoD יכול להשתנות 30-60% כפי שהוערך על ידי immunostaining על סעיפי EB שבוצעו בסוף הפרוטוקול (ראה תוצאות). גישת פוטנציאל להעשיר את המנה תרבות לmyospheres רק תהיה להשתמש כתב myogenic. זה יקל על השלכת האשכולות כמו EB באופן חלקי או לא מובחנים ובחירה רק myospheres.

לבסוף, הבנה טובה יותר של המנגנונים שבבסיס הדרישות זמניות של הגורמים הציגו תהיה שימושית כדי לשפר את השיטה של ​​מסירה. לדוגמא, אם BAF60C וMyoD נדרשים רק עבור shזמן אורט "בעיטה" התאים בכיוון הנכון, שיטות המבוססות על משלוח mRNA שונה יכול להיות מיושמת. לעומת זאת, אם הגורמים נדרשים לזמן ארוך יותר לפני שהתאים לנצל החלבונים אנדוגניים שלהם, גישת episomal תהיה מומלצת לחסל את השונות והשפעות בלתי מבוקרות בשל האינטגרציה בגנום. לבסוף, נציין שזה חובה להביע BAF60C לפני או במקביל לMyoD (לא לאחר) על מנת להשיג גיור hESC לשרירי שלד. הדרישה לביטוי מוקדם של BAF60C ככל הנראה מסתמכת על תפקידה בהגדרה מראש הנוף אפיגנטיים להפצת הכרומטין MyoD נכונה דרך הגנום ^6,15. ככזה, פרוטוקולי עתיד עשויים להיות משופרים על ידי תרכובות או מניפולציות אחרות שמקדמות ביטוי BAF60C בhESCs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3506
6-well low attachment plate	Corning	3471
GFR Matrigel	BD Biosciencies	356231
MEFs (growth arrested)14
Collagenase IV	Invitrogen	17104-019
DMEM-F12	Invitrogen	15-090-CV
KOSR	Invitrogen	10828-028
1 mM L-glutamine (100X)	Invitrogen	35050-61
Pen/Strep (100X)	Invitrogen	15070-063
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
NEAA (100X)	Invitrogen	11140-050
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
ITS Liquid Media Supplement	Sigma	I3146
N2-supplement	Invitrogen	17502-048
TrypLE express	Invitrogen	12605-010
FBS	HyClone	SH30396.03
HS	Invitrogen	16050114
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-100
bfgf	Sigma	4114-TC
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850
Anti-MyoD	BD Biosciences	554130
Anti-MyHC	DSHB	MF20
Anti-myogenin	DSHB	F5D