JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מדגימים את השימוש בצבע ניאון אלקסה מצמידים את α-bungarotoxin למדוד GABA לוקליזציה הקולטן לפני השטח ואנדוציטוזה בנוירונים בהיפוקמפוס. באמצעות השימוש במבנים הנושאים תג תאי קצר שנקשר α-bungarotoxin, ניתוח של סחר endocytic פלזמה קרום חלבון יכול להיות מושגת.

Abstract

זה בא לידי ביטוי יותר ויותר כי קולטני הנוירוטרנסמיטר, כולל קולטנים ionotropic GABA (GABAAR), תערוכת סחר דינמי מאוד וניידות פני תא 1-7. ללמוד לוקליזציה קולטן תא שטח ואנדוציטוזה, הטכניקה המתוארת כאן משלבת את השימוש של α-bungarotoxin ניאון עם תאים המבטאים מבנים המכילים α-bungarotoxin (bgt) אתר קישור (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) מבוסס על מקטע α של הקולטן השרירים ניקוטינית אצטילכולין, אשר נקשר bgt עם זיקה גבוהה 8,9. התאגדות של אתר BBS מאפשרת לוקליזציה פני השטח ומדידות של הכנסת קולטן או ההסרה עם יישום של ניאון אקסוגניים bgt, כפי שתוארה לעיל במעקב של GABAA וGABAB metabotropic הקולטני 2,10. בנוסף לאתר BBS, הכנסנו ה-GFP pH רגיש (pHGFP 11) בין חומצות אמינו 4 ו -5 למקטע GABAAR הבוגר על ידי מ 'סטנדרטיאסטרטגיות ביולוגיה ושיבוט PCR olecular (ראו איור 1) 12. BBS הוא 3 'של כתב ה-GFP pH רגיש, מופרד על ידי מקשר אלנין החומצה / פרולין 13-אמינו. לסחר במחקרים שתוארו בפרסום זה, המבוסס על דגימות קבועות, pHGFP משמש ככתב בסך הכל מתויג רמות חלבון למקטע GABAAR, המאפשר נורמליזציה של bgt כותרת אוכלוסיית הקולטן לסך אוכלוסיית הקולטן. זה ממזער תא לתא השתנות אות מכתים bgt כתוצאה מביטוי בסיסי גבוה יותר או נמוך יותר של יחידות משנה GABAAR המתויגות. יתר על כן תג pHGFP מאפשר זיהוי קל של תאים לבנות להביע לניסויי הדמיה חיים או קבועים.

Introduction

השימוש בfluorescently יחד α-bungarotoxin ללמוד לוקליזציה קולט ודינמיקה היה חלוץ במחקרים של הקולטן ניקוטינית אצטילכולין 13-15, יעד אנדוגני של הרעלן. בהמשך לכך, שילוב של פפטיד המינימלי bgt המחייב (BBS) נעשה שימוש כדי ללמוד סחר של שני ערוצי הגירוי ואת מעכבות מגודרת יגנד יון וקולטנים בשילוב חלבון G 2,10,16-21. טכניקה מבוססת BBS זה מספקת יתרונות לגישות אחרות המשמשות ללימודי סחר כגון שיטות biotinylation פני השטח, תיוג נוגדן של תאי חיים עם נוגדנים לאפיטופים תאיים, והתאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP). במהלך פני תא biotinylation אמינים חופשיים קוולנטית עדכון אחרונים, עם הפוטנציאל להשפיע על פעילות תאית. מחקרים מבוססי נוגדנים לעתים קרובות כבר הקשו על ידי אשכולות אנטיגן פני השטח או מכסת, אשר יכול לשנות אירועי סחר בנשים. בשל צעד הלבנת עבור FRAP יםtudies, נושא חשוב הוא נזק למבנה התאי הבסיסי. יתרון נוסף הוא שBBS מתויג גם מבנים יכולים לשמש למתודולוגיות ביוכימיים בסחר קולט bungarotoxin לישבני מצמידים ביוטין. טכניקה זו היא בקלות החלים על שורות תאים ותאים ראשוניים. לשימוש בתאים המבטאים אצטילכולין ניקוטינית קולטנים (nAChR), tubocurarine אנטגוניסט nAChR חייב להיות בשימוש בכל הפרוטוקול כפי שצוין. ביצוע תיוג משטח פשוט bgt (שווה ערך לנקודת זמן T = 0 לפרוטוקול אנדוציטוזה) על תאי untransfected בהעדר tubocurarine יספק ראיות לnAChR אנדוגני.

שיקול חשוב לשימוש בטכניקה זו הוא כניסה מתאימה של BBS, כך שהוא נמצא במיקום תאי כאשר החלבון של העניין מועבר קרום הפלזמה. לדוגמא, תחומים N-המסוף של יחידות משנה GABAAR מתגוררים בלומן ועי במהלך trafficking ולהיות תאיים לאחר הכניסה הקולטן בקרום הפלזמה, המאפשרים תיוג ספציפי של קולטני תא שטח והערכה להסרתם מתא השטח על ידי אירועי endocytic. הראינו בעבר כי התוספת של ה-GFP, myc, או BBS אפיטופים לתחום הזה של יחידות משנה GABAAR הוא פונקציונלי שקט. יש לבצע בקרות סטנדרטיות כדי להבטיח כי החלבון מתויג באו לידי ביטוי ברמות דומות למבנה שאינו מתויג, שזה מקומי כראוי, ושזה לא משפיע על תפקוד הקולטן. זה אפיון של מבני transfected גם יסייע בחששות ביטוי יתר לפתרון בעיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הפרוטוקולים המפורטים להלן הנן בהתאם לIACUC ולוחות סקירה מוסדיים IRB של בית הספר של אוניברסיטת פיטסבורג ספר לרפואה.

1. הכנת התרבויות העצבית בהיפוקמפוס ברקמות התרבות הוד

הערה: טכניקת שימוש סטרילי וחומרים כימיים בכל 1 לפרוטוקול.

  1. הכן פולי-D-ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר H 2 O) coverslips זכוכית מצופה כמצע לתרבות העצבית.
    1. הנח 4-5 coverslips זכוכית עגול בתוך כל מנה בתרבית רקמה 3.5 סנטימטר.
    2. ספוט 70 μl פולי-D-ליזין על כל coverslip 12 מ"מ. שים לב: הדמיה חיה, זכוכית תחתית צלחת תרבית רקמת 3.5 סנטימטר יכולה לשמש (ספוט 200 פולי-D-ליזין μl על coverslip זכוכית 14 מ"מ המשובץ).
    3. השאר את המנות שהוכנו בO / נ מכסת מנוע בתרבית הרקמה כדי למזער את פולי-D-ליזין האידוי ולשמור על משטחים סטריליים במכסת המנוע בתרבית רקמה, סגור את חלון האבנט ולכבות את הדואר מפוח O / נ הערה: אורות UV אינם משמשים במהלך הדגירה O / N.
    4. למחרת בבוקר, לשטוף את הכלים 3x עם 2 מיליליטר של H 2 O.
    5. לאחר הסרת H 2 O האחרון לשטוף, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת לכל מנה 3.5 סנטימטר ולהשאיר את הכלים בחממה עד מוכן לצלחת הנוירונים בשלב 1.4.
  2. נוירונים בהיפוקמפוס מוכנים מן היום עוברי 18-19 חולדות (E18-19) (שונה מ22 Goslin).
  3. Transfect נוירונים שזה עתה ניתקו ביום culturing עם 1-4 מיקרוגרם של ה-DNA מבנה maxiprepped.
    הערה: בדרך כלל 3 מיקרוגרם של ה-DNA הוא transfected ל1-2 מיליון נוירונים, עם יכולת קיום של 50% ויעילות transfection של 60% (למשל מתחילה עם 2 מיליון נוירונים: ((2 x 10 6 נוירונים x 0.5) 0.6) מספק כ 1 מיליון נוירונים;. ניתן transfected 600,000 מתוכם הם transfected 1 כמויות שונות של DNA מבנה בעת פתרון בעיות פוטנציאליות של.על ביטוי, ואחריו אפיון המתאים של לוקליזציה מבנה ותפקוד.
  4. פלייט נוירונים transfected על coverslips מצופה פולי-D-ליזין בצפיפות סופית של כ 200,000 נוירונים ל3.5 צלחת סנטימטר. הערה: לזכוכית תחתית צלחת, צלחת 40,000-50,000 נוירונים באזור זכוכית 14 מ"מ.
  5. החלף את המדיה 4-24 שעות לאחר הכנת תרבויות עצביות, ולאחר מכן לאפשר הנוירונים להתפתח בחממה עד 14-17 ימים במבחנה (DIV) או שלב רצוי.

2. Assay אנדוציטוזה

זהירות: שים לב על α-bungarotoxin ופסולת tubocurarine וטיפול:

  1. טיפול בכל neurotoxins פפטיד מומלץ במסגרת ההנחיות של פרוטוקולי מחקר רמת בטיחות ביולוגית-2 (BL-2). כל ציוד מגן האישי הראוי צריך להיות משוחק. צריכה להיות מחדש אבקות רעל lyophilized על פי הוראות יצרן. shou פסולת רעלןld להיות מסולק בעמידה בהנחיות לבריאות הסביבה ובטיחות של המוסד שלטוני.
  2. כדי להסיר אגרגטים פפטיד פוטנציאליים שעלולות להיוצר במהלך האחסון, יש centrifuged aliquots α-bungarotoxin בקצרה לפני השימוש, ואת supernatant יש להשתמש לצורך הניסוי.
  3. מניות α-bungarotoxin (bgt) הן resuspended לריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר בסטרילי H 2 O ומאוחסנות ב10 aliquots μl ב -20 ° C. מניות bgt יחד fluorescently משמשות ב3 מיקרוגרם / מיליליטר. Tubocurarine משמש בריכוז סופי של 150 מיקרומטר.
  1. ספסל להגדיר בלוק עליון תנור ל16 מעלות צלזיוס בחדר קר עם אלומיניום דק או צלחת נירוסטה על גבי. לחלופין, אם הוא זמין, מכשיר קירור / חימום ספסל עליון יכול לשמש לכל צעד הדורש 16 ° C.
  2. נאגר מלוח Hepes תאי מגניב (HBS המכיל במ"מ: 135 NaCl, KCl 4.7, 10 HEPES, 11 גלוקוז, 1.2 MgCl 2, ו2.5CaCl 2, pH 7.4) ל16 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  3. העברת מנות נוירון ללוחית אלומיניום ב16 מעלות צלזיוס ומגניבה למשך 5 דקות.
  4. הסר תקשורת (לשמור על תקשורת ומילואים מותנים בחממה לצעד 2.8, נקודות זמן assay אנדוציטוזה) ולהחליף עם 1 מיליליטר של 16 ° C tubocurarine HBS + (150 מיקרומטר) למשך 2 דקות.
  5. הסר HBS + tubocurarine למכל פסולת שכותרתו ולהחליף עם ° tubocurarine 1 מיליליטר של 16 C HBS + (150 מיקרומטר) + α-bungarotoxin Alexa 594 [3 מיקרוגרם / מיליליטר], דוגרים על 16 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. הסר HBS + tubocurarine + α-bungarotoxin Alexa 594 לכותרת מיכל פסולת ולשטוף כלים 3x עם 2 מיליליטר של 16 ° C HBS (ניתן לאסוף שוטף באמצעות שאיפה בבקבוק ואקום המכיל 50 מיליליטר של אקונומיקה 50%).
  7. עבור ניסויי סדרת זמן הדמיה חיה הבאים אנדוציטוזה קולט באמצעות זכוכית תחתית 3.5 צלחת תרבות סנטימטר, לבצע צעדים 2.1-2.6, לאחר מכן להעביר את המנה לבמה מחוממת(מכשיר Peltier) במיקרוסקופ, ולהתחיל הדמיה עם confocal או התקנת מיקרוסקופ TIRF.
  8. העבר את coverslips = 0 נקודת זמן T לתוך צלחת של 4% paraformaldehyde / סוכרוז 4% RT עבור 20 דקות, ממשיך עם coverslips האחר לשלב 2.9.
  9. לנקודות זמן אחרות, להחליף HBS עם מזגן equilibrated 37 ° C תקשורת (שמורות בשלב 2.4) ולחזור לחממה לאנדוציטוזה על 37 ° C. הערה: הציעה נקודות נוספות זמן של T = 15, 30, ו60.
  10. בנקודות זמן נדרשים, לקחת מנות מחממה, לשטוף במהירות פעמיים עם 2 מיליליטר של RT DPBS (DPBS לא סידן, מגנזיום) לאחר מכן לתקן ב4% paraformaldehyde / סוכרוז 4% עבור 20 דקות.
  11. אחרי 20 קיבעון דקות, להסיר 4% paraformaldehyde / 4% סוכרוז לבזבז מיכל ולשטוף כלים פעמיים עם 2 מיליליטר RT DPBS.
  12. דגירה coverslips ב RT עבור 10 דקות בפתרון לחסום immunofluorescence (פתרון לחסום = 5% בסרום סוס, BSA 0.5% בDPBS) מכיל 0.2% טריטון X-100 permeabilize נוירונים ולאפשר immunostaining אנטי-GFP של בריכת קולטן תאית ו / או תיוג של חלבונים אחרים של עניין.
  13. הסרת גוש + 0.2% טריטון X-100 דגירה coverslips בפתרון לחסום immunofluorescence ללא טריטון X-100 של 20-30 דקות.
  14. בצע incubations נוגדן הראשוני של coverslips בבלוק במשך כמה שעות ב RT או O / N ב 4 ° C. הערה: דגירה של coverslips עם פריימריס ב 4 ° CO / N מייצרת באופן שגרתי תוצאות immunofluorescence משופרות.
  15. לשטוף coverslips 3x עם DPBS (5 דקות לכל שלב לשטוף).
  16. דגירה coverslips עם נוגדנים משני בפתרון לחסום עבור שעה 1 ב RT.
  17. לשטוף coverslips 3x עם DPBS (5 דקות לכל שלב לשטוף).
  18. coverslips ההר, טיפול בכל coverslip בנפרד: להסיר את הנוזל עודף מחלק האחורי של coverslip עם מעבדה רקמות, ולאחר מכן להפוך coverslip על גבי 4 μl של הרכבה בינונית בשקופית זכוכית.
  19. מאפשרים שקופיות לייבוש על RT מכוסה למשך 30 דקות לאחר מכן stעפרות על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לבצע מיקרוסקופיה.
  20. רכישת תמונה וניתוח של ניסוי עם מיקרוסקופיה confocal (עיוורת לתנאי ניסוי). 60x שמן NA אובייקטיבי 1.49 טבילה עם הלייזרים הבאים: גז ארגון 488 ננומטר, 561 דיודה, 640 דיודה.
    1. שימוש באותן הגדרות רכישת התמונה, לרכוש תמונות סעיף Z יחידה עם גוף התא העצבי וכמה תהליכים דנדריטים בפוקוס.
    2. לכמת α-bungarotoxin אות הקרינה Alexa וimmunostaining GFP יחד 20 מיקרומטר של 3-4 דנדריטים הפרוקסימלי לכל נוירון, תוך שימוש באותו הסף לניתוח של כל נתוני אנדוציטוזה.
    3. לנתח נתונים 10-12 נוירונים עבור כל נקודת זמן, וחזר על הניסוי עם כמה תרבויות עצביות עצמאיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אפיון מבנה BBS מתויג כולל בקרות חשובות כגון קביעה אם החלבון הביע מרכיב כראוי (במיוחד עם קולטנים מורכבים מיחידות משנה מרובות), traffics לתא השטח וlocalizes כראוי. סינפסות מעכבות מורכבים של GABA אשכולות משטח קולט שcolocalize עם gephyrin חלבון פיגום המעכב וapposed למסופים מעכבים presynaptic, שזוהו ע?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הטכניקות קבועות וחיות המבוססות BBS המתוארים כאן ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר קולט או סחר אחר פלזמה קרום חלבון בשורות תאים, תאי עצב, תאים ראשוניים אחרים. שיטה זו שמשה בהצלחה ללמוד החדרת קרום וההסרה של תעלות יונים מגודרת יגנד וGPCR ולהעריך בשל נוכחותם של אגוניסטים לקולטן ומא?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

תמיכה סופקה על ידי הפעלה-כספים מהמחלקה לביולוגיה כימית ופרמקולוגיה בבית הספר לאוניברסיטת פיטסבורג ספר לרפואה. הכרה של חברי המעבדה יעקב שתרמו להגשת וידאו: ניקולס גרף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
P3 Primary Cell 4D kit LonzaV4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugateMolecular ProbesB35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugateMolecular ProbesB13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugateMolecular ProbesB13423
(+)-Tubocurarine chlorideTocris2820
Mounting medium DAKOcS703
DPBS no calcium, magnesiumInvitrogen14190-136
Poly-D-lysine SigmaP6407
Gephyrin antibodySynaptic Systems147 0111:300
VIAAT/VGAT antibodySynaptic Systems131 0021:1,000
anti GFPLife TechnologiesA64551:2,000
Glass bottom tissue culture dishMatTek CorporationP35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mmWarner Instruments640-0702

References

  1. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
  2. Bogdanov, Y., et al. Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts. EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).
  3. Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses. Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).
  4. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  5. Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).
  6. Bannai, H., et al. Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics. Neuron. 62, 670-682 (2009).
  7. Muir, J., et al. NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).
  8. Katchalski-Katzir, E., et al. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).
  9. Scherf, T., et al. A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).
  10. Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag. J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).
  11. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  12. Jacob, T. C., et al. Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).
  13. Anderson, M. J., Cohen, M. W. Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle. J. Physiol. 237, 385-400 (1974).
  14. Axelrod, D. Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).
  15. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).
  16. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
  17. Jacob, T. C., et al. GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).
  18. Hannan, S., et al. GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit. J. Biol. Chem. , (2011).
  19. Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current. EMBO. 31, 2937-2951 (2012).
  20. Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness. Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).
  21. Terunuma, M., et al. Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).
  22. Goslin, K. G. B. Culturing Nerve Cells. , 2nd ed, MIT Press. (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience85bungarotoxinimmunostaining

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved