חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Summary

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

Abstract

מבחני מבוססים על פליטת אור התהודה העברת אנרגיה (ברט) לספק אמצעי רגיש ואמין כדי לפקח על אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. ברט הוא ההעברה לא מקרינה אנרגיה מאנזים לוציפראז 'תורם' לחלבון פלואורסצנטי 'acceptor'. בתצורה הנפוצה ביותר של assay זה, התורם הוא לוציפראז reniformis Renilla וacceptor הוא חלבון צהוב פלורסנט (YFP). בגלל היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, התבוננות בתופעת ברט דורשת שהתורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין בתאי יונקים בתרבית, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם לוציפראז והשני כהתמזגות עם YFP. אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא תורם acceptor מספיק קרוב ללהתרחש העברת אנרגיה. לעומת טכניקות אחרות לחקירת חלבונים בteractions, assay ברט הוא רגיש, דורש ידיים על קצת זמן וכמה חומרים כימיים, והוא מסוגל לזהות אינטראקציות שהם חלשים, ארעיים, או תלויים בסביבה ביוכימית נמצאת בתוך תא חי. לכן גישה אידיאלית למאשרים אינטראקציות המשוערות שהוצעו על ידי שמרי שני היברידיים או ספקטרומטריית מסת מחקרי פרוטאומיקה, ובנוסף הוא מותאם היטב לאזורי מיפוי אינטראקציה, בוחן את ההשפעה של שינויים שלאחר translational על אינטראקציות בין חלבונים, ו בוחן את ההשפעה של מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל.

Introduction

גם הצמדה קלאסית והדור הבא רצף ניתוחים של הפרעות אדם מגלים את הרלוונטיות הקלינית של חלבונים מעורבים במגוון רחב של מסלולים ביולוגיים. זה קורה לעתים קרובות כי, לפני זיהוי שלהם במחקרים מסוג זה, יש כבר חקירה מועטת או ללא התפקיד הביולוגי של החלבונים האלה. השדרה פורה אחד להתחיל לחקור את התפקוד הביולוגי של חלבון של עניין היא לזהות אילו חלבונים אחרים הוא מקיים אינטראקציה עם בהקשר הפיזיולוגי שלו. אפיון רשתות מולקולריות באופן זה מספק תובנות לגבי המסלולים הביולוגיים העומדים בבסיס הפנוטיפ האנושי.

ההקרנה בקנה מידה גדולה ביותר בשימוש לעתים קרובות גישות לזיהוי שותפי אינטראקציה מועמד לחלבונים של עניין הן שמרי הקרנת שתי היברידית ¹ ופרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסת ^2. שיטות אלו יכולות להיות מוצלחות מאוד שבמרמזות חלבוני אינטראקציה פוטנציאל, אבל arדואר חשוף לתוצאות חיוביות כוזבות. לפיכך, אישור של אינטראקציה זוהתה על ידי שמרי שני היברידיים או הקרנת ספקטרומטריית מסה דורש אימות של האינטראקציה באמצעות טכניקה שנייה. בדרך כלל שיתוף immunoprecipitation או assay הנפתח משמש למטרה זו ^3. אחד חסרונות של שימוש בטכניקות כגון לאימות הוא הדרישה לתמוגה תא, שהורסת את התנאים תאיים שעשויה להיות חיוני לשמירה על אינטראקציות חלבון מסוימות. חסרון שני הוא שאינטראקציות חלבון חלשות או חולפות עשויות להיות מופרים במהלך שלבי כביסה. יתר על כן, מבחני אלה דורשים ידיים על זמן משמעותיים, מוגבלים במספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית, ולעתים קרובות דורשים אופטימיזציה זמן רב של חומרים כימיים ופרוטוקולים.

כדי להתגבר על חלק מהבעיות הקשורות לשיתוף immunoprecipitation ניסויים, כמה מבחני שפותחו על בסיס ניאון וbiolumחלבוני inescent שניתן להשתמש בתאים חיים. מבחני הראשונים מסוג זה היו מבוססים על הקרינה (או פורסטר) העברת התהודה אנרגיה (סריג), ההעברה לא מקרינה אנרגיה בין שני חלבוני ניאון עם פליטה חופפות וספקטרום עירור ^4. היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, ולכן התבוננות בתופעת סריג דורשת כי fluorophores תורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם fluorophore התורם (החלבון פלואורסצנטי נפוץ ציאן; CFP), והשני כהתמזגות עם fluorophore acceptor (החלבון פלואורסצנטי נפוץ צהוב; YFP). אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא fluorophores תורם acceptor מספיק הקרוב ללהתרחש העברת אנרגיה, מה שיגרום לעלייה במדידת הפליטה של ​​אור מביחס acceptor YFP לתורם CFP. FRET היה מוצלח באיתור אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים ^4. החסרון העיקרי של שימוש בסריג לאיתור חלבונים אינטראקציות הוא הדרישה לתאורה חיצונית לעירור של fluorophore התורם. תוצאות תאורה חיצוניות ברקע גבוה באות הפליטה, עירור לא רצוי של acceptor, וphotobleaching של שניהם תורמים וfluorophores acceptor. השפעות אלה מפחיתים את הרגישות של assay לאיתור חלבונים אינטראקציות.

שינוי של assay סריג שמתגבר על הבעיה של רקע גבוה מתאורה חיצונית הוא העברת פליטת אור התהודה האנרגיה ^5,6 assay (ברט). במערכת ברט fluorophore התורם הוא הוחלף על ידי אנזים בלוציפראז. לכן האנרגיה לעירור של fluorophore acceptor נוצרה בתוך המערכת על ידי החמצון של מצע לוציפראז, עיבוד תאורה חיצונית מיותרת. ברובתצורה נפוצה של assay זה, התורם הוא Renilla reniformis לוציפראז וacceptor הוא YFP (לדיון של תורם חלופי וחלבונים acceptor לראות Pfleger et al. ^5). בהתאם לכך, במערכת זו, חלבון של עניין הוא קבע את לוציפראז וחלבון באופן פוטנציאלי, באינטראקציה לYFP, או להיפך. Assay ברט דורש תוספת של coelenterazine כמצע ללוציפראז. בגלל coelenterazine הוא תא חדיר, ניתן לבצע מבחני ברט בתאים חיים. עם זאת, coelenterazine ילידים אינם יציב בתמיסה מימית, ואת פירוט האנזים עצמאי של coelenterazine הן מפחית את ריכוז המצע זמין עבור assay ומייצר autoluminescence, אשר מפחיתה את הרגישות של מדידות של פעילות לוציפראז. השימוש בברט בתאים חיים כבר בהנחייתם של פיתוח coelenterazines המוגן, שהם יציבים בתמיסה מימית אבל הם ביקע ידי esterase cytosolicים לאחר דיפוזיה על פני קרום התא כדי לייצר coelenterazine הפעיל בתוך התא ^7.

בעקבות תוספת של מצע לתאים לבטא לוציפראז וחלבוני YFP-Fusion, העברת אנרגיה וכתוצאה מאינטראקציות בין חלבונים היא לכמת על ידי ניטור פליטה מלוציפראז וYFP. מכיוון שניתן לנטר אינטראקציות חלבון ישירות בתאים חיים בצלחות רב גם, assay ברט מהווה שיטה פשוטה, ניתן להרחבה לאימות אינטראקציות המשוערות שהיא עלות והזמן יעיל.

בנוסף לאימות interactors המשוער שזוהה במחקרי הקרנת proteomic, מערכת ברט יכולה לשמש גם לinteractors מועמד מבחן הנובע ממחקרים ביוכימיים ומבניים מוקדמים בחלבון של עניין. ברגע שהקיום של אינטראקציה בין חלבונים כבר נקבע (בין אם באמצעות assay ברט או בטכניקות אחרות), קיימת פוטנציאל לassay ברט להיות EMPloyed נוסף כדי לאפיין את האינטראקציה. לדוגמא, ניתן למפות אזורי האינטראקציה על ידי יצירת גרסאות מקוצצות של החלבונים, ואת מעורבותם של שאריות ספציפיות באינטראקציה ניתן להדגים על ידי יצירת מוטציות נקודתיות. יתר על כן, השפעת הוויסות של שינויי posttranslational או מולקולות קטנות (כגון סמים או ligands) על אינטראקציות בין חלבונים יכולה להיחקר ^8-10.

Assay ברט יש גם פוטנציאל גדול לחקר מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל. במקרים בהם תפקיד סיבתי מוטציה כבר נקבע, שחקר את ההשפעה של המוטציה על אינטראקציות בין חלבונים באמצעות ברט עשוי לחשוף עוד על אטיולוגיה המולקולרית של פנוטיפ ^11. מאז כניסתו של מתודולוגיות הדור הבא של רצף, זה נפוץ יותר ויותר במשך כמה מוטציות שעלולים להיות מזיקות להיות מזוהות בתוך פרט, ובמקרה זה ברור שהם releVant לפנוטיפ ^12. במצב זה assay ברט עשוי להיות בעל ערך בהערכת ההשפעה של מוטציות על תפקוד חלבון ומכאן את הרלוונטיות שלהם להפרעה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. יצירת פלסמידים

1. Subclone cDNAs עבור כל חלבון של עניין לשני וקטורי pLuc וpYFP, ​​תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות (איור 1). לפרוטוקולים מפורטים רואה הירוק ואח' ^13.
2. רצף כל הבונה כדי לוודא שהחלבונים של עניין נמצאים במסגרת עם רצף לוק / YFP ללא קודונים להפסיק להתערב.
3. לבצע מבחני פונקציונליים כמו רצוי כדי לאשר שחלבוני ההיתוך לשמור על פעילות ביולוגית. במקרה שהוצג כאן לוקליזציה subcellular של חלבוני היתוך YFP הובררה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. הפוך פלסמידים ביטוי לחלבוני בקרה מתאימים לוק וYFP על ידי הנדסת אותות מיקוד הרלוונטיים לוקטורי ביטוי pLuc וpYFP. במקרה שהוצג כאן, ליצור מבני לוק וYFP ממוקדים גרעיניים על ידי הוספת אות לוקליזציה גרעינית לוקטורי pLuc וpYFP.
5. לעשותמבנה שליטה חיובי שבו לוק וYFP הם התמזגו לתוך פוליפפטיד אחד. במקרה שהוצג כאן, לייצר שליטה חיובית שבו רצף קידוד YFP מוכנס לתוך וקטור pLuc.
6. בחר פלסמיד מילוי ניטראלי לשמש כדי להשוות את המסה של ה-DNA בתערובות transfection. השתמש פלסמיד שאין לו אמרגן אוקריוטים ועל כן יהיה תעתיק לא פעיל בתאי יונקים, כגון וקטור שיבוט חיידקים.

2. הכנה של ה-DNA תערובות

1. להעריך את הריכוז של כל פלסמידים שתוארו בסעיף 1 המבוסס על הספיגה ב 260 ננומטר (יחידת ספיגת 1 היא שווה ערך ל50 מיקרוגרם / מיליליטר של ה-DNA). לקבוע את המסה המולקולרית של כל פלסמיד על ידי הכפלת מספר זוגות בסיסים ידי 650 דא. השתמש בריכוז ומסה מולקולרית כדי לחשב את הריכוז טוחנת של כל הכנת פלסמיד. לדלל את הכנות פלסמיד דנ"א לריכוז של 36 ננומטר. אלה יהיו המניות עובדותשישמש להכנת תערובות DNA עבור transfection.
2. להכין תערובת המכילה DNA שליטת 1,800 ננוגרם של פלסמיד מילוי בנפח סופי של μl 20 של מים.
3. להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה pLuc השליטה. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
4. להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה pLuc שליטה ו5 μl של מבנה pYFP שליטה. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
5. להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה שליטה חיובי. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
6. הכן את ה-DNA הבא מתערבבת לבדיקת homodimerization של חלבון של העניין, X. לכל ערבוב של ה-DNA לשלב 5 μl של pLuc הרלוונטי לבנות ו5 μl של pyFP לבנות. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
   א) pLuc שליטה וpYFP-X
   B) pLuc-X וpYFP בקרה
   ג) pLuc-X ו-X pYFP
7. הכינו את ה-DNA הבא מתערבבת לבדיקת אינטראקציה בין זוג החלבונים של עניין, X וי 'לכל תערובת DNA לשלב 5 μl של pLuc הרלוונטי לבנות ו5 μl של pYFP לבנות. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl.
   א) pLuc שליטה וpYFP-X
   B) pLuc-X וpYFP בקרה
   ג) pLuc שליטה וpYFP-Y
   D) pLuc-Y וpYFP בקרה
   E) pLuc-X ו-Y pYFP
   F) pLuc-Y ו-X pYFP

3. Transfection

1. קציר subconfluent HEK293 תאים מבקבוק 75 ² סנטימטר. לדלל 10% מהתאים בסך הכל ל13 מיליליטר של מדיום התרבות. לוותר 130 μl של השעיה תא לתוך באר כל לבןברור תחתית צלחת תרבית רקמת 96 היטב. תרבות תאים ל24 שעות.
2. לחשב את מספר הבארות להיות transfected על ידי הכפלת מספר תערובות-DNA על ידי 3. תביא מדיום סרום ללא תרבות לטמפרטורת חדר. הכן תערובת אב המכילה 6.3 μl של מדיום סרום ללא ו0.18 מגיב transfection μl לכל טוב. מערבבים על ידי vortexing ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
3. הכן תערובת transfection על ידי הוספת 2 μl תמהיל ה-DNA כדי 20 μl של תמהיל אב סרום ללא בינוני / transfection מגיב. לא מערבולת. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
4. Transfect שלוש בארות עם כל תערובת transfection מחלק 6.5 μl של תערובת transfection לכל טוב. תרבות התאים לשעה 36-48 נוספת.

4. מדידה של ברט איתותים

1. לפזר מצע לוציפראז לחיות תאים ב34 מ"ג / מיליליטר בDMSO ידי vortexing.
2. לדלל מצע לוציפראז לחיות תאים מחדש ב1:1,000 בעמ הבינוני דילול המצעמחדש לחמם 37 ° C. לאפשר 50 μl של מדיום דילול מצע לכל טוב. מערבולת לערבב. משקע עלול להיווצר, אבל לא יפריע לassay.
3. לשאוב את מדיום התרבות מצלחת 96 היטב. לוותר 50 μl של מצע לוציפראז לחיות תאים מדולל היטב כל אחד. תרבות תאים לפחות 2 שעה (עד 24hr).
4. הסר את המכסה מצלחת 96 היטב דגירה את הצלחת ל10 דקות בטמפרטורת חדר בתוך luminometer.
5. למדוד פליטה מלוק וYFP אחד טובה בכל פעם. למדוד פליטה מלוק באמצעות מסנן חוסם אורכי גל ארוכים יותר מאשר 470 ננומטר. למדוד פליטה מYFP באמצעות מסנן להקה עובר 500-600 ננומטר. שלב את אותות פליטה מעל 10 שניות.

5. ניתוח נתונים

1. ממוצע קריאות פליטת לוק מ3 הבארות שקיבלו רק את הפלסמיד המילוי. לחסר ערך זה מכל קריאות פליטת לוק האחרות כדי לייצר ערכי פליטה מופחת רקע לוק.
2. ממוצע קריאות פליטת YFP מ3 הבארות שקיבלו רק את הפלסמיד המילוי. לחסר ערך זה מכל קריאות פליטת YFP האחרות כדי לייצר ערכי פליטה מופחת רקע YFP.
3. עבור כל טוב, יש לחלק את ערך הפליטה מופחת רקע YFP ידי ערך הפליטה מופחת רקע לוק לתת יחס ברט שלא תוקן.
4. ממוצע יחסי ברט שלא תוקנו משלוש הבארות שהיו transfected עם רק פלסמיד pLuc השליטה. לחסר ערך זה מכל יחסי ברט לא מתוקנים האחרים כדי לתת את יחס ברט המתוקן.
5. לכל אחת מהקבוצות שנותרו ביחסי ברט מתוקנים, ממוצע הערכים משלוש בארות transfected לקבל יחס ברט סופי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

העיקרון של assay ברט המתואר באיור 2. התקנת assay בשימוש בכל הניסויים שהוצגו כאן מתוארת באיור 3. זיהוי של אות ברט חזקה מתאי transfected עם חלבון היתוך לוציפראז-YFP אישר כי העברת אנרגיה הייתה ניתן לצפייה בהתקנה ניסיונית זה (איור 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

העיצוב של מבני ביטוי חלבון ההיתוך הוא שלב קריטי בהקמת assay ברט. בניסויים שהוצגו כאן, החלבונים של העניין היו התמזגו C-הסופית של בלוציפראז או YFP. זה גם אפשרי, וייתכן שיהיה צורך, הפתיל חלבונים N-הסופית של בלוציפראז / YFP. עבור חלק מחלבונים, התכה עשויה להתקבל רק בבית או N-או C-הסופ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.