שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

Summary

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Abstract

בקליפת המוח של היונקים, תאי עצב יוצרים רשתות מאוד מסובכות ולהחליף מידע בסינפסות. שינויים בחוזק סינפטי, כמו גם תוספת / הסרה של סינפסות, מתרחשים באופן חוויה תלויה, המספקים את היסוד המבני של פלסטיות עצבית. כרכיבי postsynaptic של סינפסות המעוררות ביותר בקליפת המוח, קוצים הדנדריטים נחשבים פרוקסי טוב של סינפסות. יתרונות לוקחים גנטיקה עכבר וטכניקות תיוג פלורסנט, נוירונים בודדים והמבנים הסינפטי שלהם יכולים להיות מתויגים במוח שלם. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה transcranial באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים לעקוב קוצים שכותרתו fluorescently postsynaptic הדנדריטים לאורך זמן in vivo. פרוטוקול זה משתמש בהכנה דלילה, גולגולת, אשר משומרת על הגולגולת שלמה ותמנע תופעות דלקתיות הנגרמות על ידי חשיפה של קרומי המוח וקליפת המוח. לכן, ניתן לרכוש תמונות מייד לאחר surgery מתבצע. הליך הניסוי ניתן לבצע שוב ושוב על פני מרווחי זמן שונים, החל משעות לשנים. היישום של הכנה זו גם ניתן להרחיב כדי לחקור אזורים שונים בקליפת המוח ושכבות, כמו גם סוגי תאים אחרים, בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים.

Introduction

היונקים הקליפה משתתפת בתפקודי מוח רבים, משליטת תפיסה והתנועה חושית לעיבוד מידע מופשט וקוגניציה. פונקציות שונות בקליפת המוח לבנות על מעגלים עצביים שונים, אשר מורכבים סוגים שונים של נוירונים תקשורת והחלפת מידע בסינפסות בודדות של. המבנה והתפקוד של סינפסות באופן עקבי להיות שונה בתגובה לחוויות ופתולוגיות. במוח הבוגר, פלסטיות הסינפטית לובשת צורה של שני שינויי כוח ובנוסף / הסרה של סינפסות, ממלאת תפקידים חשובים ביצירת ותחזוקה של מעגלים עצביים פונקציונליים. קוצים הדנדריטים הם רכיבי postsynaptic של רוב סינפסות מעוררות במוח של היונקים. התחלופה המתמדת ושינויים מורפולוגיים של קוצים הם האמינו לשמש אינדיקטור טוב של שינויים בקשרים סינפטיים ^1-7.

מיקרו לייזר סריקת שני פוטוניםscopy מציע חדירה עמוקה דרך, הכנות אטומות עבות וphototoxicity הנמוך, מה שהופך אותו מתאים להדמיה לחיות במוח שלם ^8. בשילוב עם תיוג פלורסנט, שני פוטונים הדמיה מספקת כלי רב עוצמה כדי להציץ לתוך המוח החי ופעל לארגון מחדש מבני בסינפסות בודדות עם גבוה במרחב וברזולוציה של זמן. שיטות שונות שימשו להכנת עכברי הדמיה לחיות ^9-13. כאן, אנו מתארים הכנה דלילה, גולגולת של in vivo שני פוטונים הדמיה כדי לחקור את הפלסטיות המבנית של קוצים הדנדריטים postsynaptic בקליפת מוח העכבר. שימוש בגישה זו, המחקרים האחרונים שלנו תיארו תמונה דינמית של שינויים בעמוד השדרה הדנדריטים בתגובה למיומנות מוטורית לומדת עם זמינות גוברת של בעלי חיים מהונדסים עם תת נוירונים שכותרתו fluorescently והתפתחות מהירה של in vivo טכניקות תיוג, יכולים להיות מיושמים גם נהלים דומים שתוארו כאן לחקירהסוגי te תאים אחרים ואזורים בקליפת המוח, בשילוב עם מניפולציות אחרות, כמו גם בשימוש במודלים של מחלת ^16-23.

Protocol

אישור צריך להיות ממוסדים הביתה לפני תחילתו של הניתוח ומחקר הדמיה. ניסויים שתוארו בכתב היד הזה בוצעו בהתאם להנחיות ותקנות מאוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז מוסדי הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. ניתוח

1. החיטוי כל מכשירי הניתוח ולעקר את סביבת העבודה עם אלכוהול 70% ביסודיות לפני הניתוח.
2. להרדים את העכבר על ידי intraperitoneal הזרקה (IP) של פתרון KX הרדמה (200 מ"ג / קטמין קילוגרם ו20 מ"ג / קילוגרם xylazine) בהתאם למשקל גופו של עכבר הערה:. מינון KX יכול להיות מותאם על פי הזן, הגיל ומצב בריאות של העכברים. התייעצות וטרינרית כדי לקבוע את המינון האופטימלי מומלצת גם.
3. לבצע בדיקת הבוהן קמצוץ מעת לעת על ידי לחיצה על בוהן של העכבר ובדיקת תגובה רפלקסיבית לנטר את מצב ההרדמה.ודא שהעכבר הוא בהרדמה מלאה לפני תחילת ניתוח הערה:. במהלך פגישות הדמיה ממושכות, לבדוק את מצב ההרדמה של העכבר מעת לעת, לנהל KX נוסף במידת צורך.
4. מניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח.
5. לגלח את הראש של העכבר באמצעות סכין גילוח כדי לחשוף את הקרקפת.
6. לחטא את האזור המגולח ידי מנגב את העור עם לסירוגין רפידות אלכוהול ובטאדין. הסר את כל גזירות שיער שיורית.
7. בעדינות להחיל משחה העין כדי לשמן את שני העיניים, ולכן מניעת ניזק בלתי הפיך הנגרם על ידי התייבשות במהלך הניסוי.
8. לעשות חתך ישר לאורך קו האמצע של הקרקפת, ולהעביר את העור רוחבי לכיוון הקצוות של הגולגולת.
9. הסר את רקמת החיבור הצמודה לגולגולת.

2. דליל, גולגולת הכנה

1. זהה את אזור ההדמיה המבוסס על ster. קואורדינטות eotaxic הערה: נסה להימנע מכלי דם גדולים, שחדירה לחסום אור ולטשטש את מבני הדמיה. בכלי דם הוא ציין הטוב ביותר כאשר הגולגולת לחה עם תמיסת מלח סטרילית.
2. השתמש בתרגיל מיקרו במהירות גבוהה כדי לדלל אזור מעגלי של גולגולת (0.5-1.0 מ"מ קוטר). העבר את התרגיל המקביל למשטח הגולגולת, ולא מחזיק את זה נגד הגולגולת ולחיצה. מקדחה עד ששתי השכבה החיצונית הקומפקטית עצם ושכבת עצם הספוגית האמצע יוסרו הערה:. כדי למנוע נזק שנגרם על ידי התחממות יתר, להימנע ממגע ממושך בין המקדח והגולגולת.
3. המשך דילול שכבת העצם הקומפקטי הפנימית עם להב microsurgical במרכז האזור-דליל התרגיל. החזק את להב microsurgical בזווית של כ 45 ° כדי לגרד את הגולגולת בלי לחיצה על הגולגולת באופן שווה עד דליל אזור קטן (200-300 בקוטר מיקרומטר) בעובי של משוערמיקרומטר ly 20-30 מתקבל. בשל אוטומטי הקרינה של הגולגולת, העובי ניתן למדוד על ידי סריקה את המרחק בין משטח העליון ותחתון של הגולגולת מתחת לשני פוטונים מיקרוסקופ הערה:. למרות עובי גולגולת של פחות מ 20 מיקרומטר מספק איכות הדמיה טובה, זה לא מומלץ, כי זה הופך את תהליך ההרזיה בהפעלות מחדש הדמיה הבאות קשה. כדי להימנע מעל דליל, העובי של הגולגולת צריך להיבדק מעת לעת במהלך הניתוח (ראה דיון).

3. קיבוע

1. מוציא בזהירות את עצם פסולת.
2. מקום טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate בכל קצה של פתיחת מרכז צלחת ראש סטרילית, אשר כבר autoclaved (ראה איור 1). החזק את הצלחת בראש בחוזקה נגד הגולגולת עם האזור דליל הממוקם במרכזה של פתיחת הערה:. אם הדבק מזהם את r דלילegion במקרה, הסר אותה בזהירות עם להב microsurgical.
3. משוך בעדינות את העור מן הצדדים של הגולגולת לקצוות של פתיחת מרכז צלחת הראש.
4. המתן כ10 דקות עד שצלחת הראש מצורפת גם לגולגולת.
5. מניחים את הצלחת על ראש שני בלוקים לרוחב של הצלחת החזקה ולאחר מכן הדקתי את הברגים על הקצוות של צלחת הראש כדי לשתק את העכבר על צלחת ההחזקה (ראה איור 1) הערה:. ודא שאין עור או שפם בין צלחת הראש והלוקים לפני הידוק הברגים. הכנה משותקת טובה צריכה להראות שום תנועה הנצפית של הגולגולת מתחת למיקרוסקופ לנתח כאשר החלק האחורי של בעל החיים הוא טפח בעדינות.
6. . יש לשטוף את הגולגולת חשופה עם מי מלח כדי להסיר את דבק unpolymerized הערה: חשוב כדי להסיר כל דבק שנותר, כדבק unpolymerized מטשטש תמונות ונזקים מיקרוסקופ מטרות <./ Li>

4. הדמיה

1. קח את תמונה של כלי הדם של הגולגולת חשופה עם האזור דליל כמו מפה 1, המשמש למיקום מחדש של האזור צילם בפגישות הדמיה הבאות (ראה איור 2).
2. מניחים את העכבר מתחת למיקרוסקופ ההדמיה. אתר את האזור דליל תחת מטרת מיזוג 10X באמצעות epifluorescence ולהזיז את האזור הדק ביותר למרכז התצוגה.
3. הוסף טיפה של תמיסת מלח בחלק העליון של הגולגולת ולעבור למטרת 60x, אשר כבר שטפה עם מים סטריליים. בחר אזור בו קוצים הדנדריטים בודדים בבירור הם דמיינו לאורך הדנדריטים. לזהות ולתייג את האזור המקביל ב -1 במפה על ידי השוואת כלי דם בין תצוגת epifluorescent והתמונה בכלי הדם.
4. מנגינת הלייזר באורך גל שני פוטונים פי fluorophores. לדוגמא, 920 ננומטר לYFP; 890 ננומטר של ה-GFP; 1,000 ננומטר לDsRed ^ו24 tdTomato.
5. לרכוש ערימות תמונה עם 2צעדי מיקרומטר לאורך ציר z באמצעות אובייקטיבי 60x. ערימת תמונה זו משתרעת על שטח של כ 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים), והוא משמש כמפה 2 להעתקה במהלך פגישות הדמיה שלאחר מכן (ראה איור 2).
6. לרכוש תשע ערימות תמונה בתוך מפה 2 שימוש בזום דיגיטלי 3X. כל ערימת תמונה משתרעת על שטח משוער של 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים), עם 0.7 מיקרומטר צעדים לאורך ציר Z-הערה:. עוצמת הלייזר צריכה להיות מתחת 40 mW כאשר נמדדו בדגימות כדי למזער phototoxicity.

5. שחזור

1. בעקבות הדמיה, בעדינות לנתק את הצלחת בראש מהגולגולת.
2. לנקות ביסודיות את הגולגולת ואת העור כדי להסיר את כל הדבק שנותר הערה:. כל דבק שנותר על העור יגרום לגירויים ולהאט את החלמת עור בזמן שכל דבק שנותר בגולגולת יגרום לשחיקה של הגולגולת וngiogenesis בשכבת העצם גדלה לאחרונה, מה שהופך את ההעתקה הבאה ומחדש הדמיה קשה.
3. יש לשטוף את הגולגולת ואת העור עם מספר פעמים מלוחה.
4. תפר את הקרקפת עם תפר כירורגי סטרילי.
5. שמור את החיה על כרית חימום בכלוב נפרד. לנהל משכך כאבים עצירות (0.1 מ"ג / קילוגרם) תת עורי כדי להקל על כאב שלאחר ניתוח. להחזיר את בעל החיים לכלוב בבית לאחר החלמה מלאה. לפקח על בעלי החיים בשיתוף פעולה הדוק (לבדוק לפחות פעם ביום) עד שהחתך נרפא ותפרים יוסרו. להזריק הבא של משכך כאבים עצירות במידת הצורך.

6. Reimaging

1. חזור על שלבי 1.1-1.8.
2. חזור על שלבי 3.1-3.6
3. אתר אזור צילם בעבר על ידי השוואת הדפוס בכלי הדם למפת 1 ודפוס סניף הדנדריטים למפת 2.
4. אם reimaging מתבצע בתוך 1 שבוע, חזור על שלב 2.3 כדי להסיר את השכבה דקה של עצם גדל עתה על גבי מחדש דלילגיון באמצעות להב microsurgical. אם reimaging מבוצע לאחר שבוע יותר מ 1, חזור על שלבי שני 2.2 ו2.3 הערה:. שכבת העצם גדלה חדש מורכבת ממבנה מרוכז פחות בהשוואה לשכבה המקורית הקומפקטית העצם, מה שמוביל לאיכות תמונה מופחתת. לכן, כדי לרכוש את אותה האיכות, יש צורך לדלל את הגולגולת מעט יותר מפגישת ההדמיה הקודמת.
5. להתאים את המיקום ואת הכיוון כדי להשיג ערימות תמונה התואמות נלקחו בעבר ערימות תמונה מתחת למיקרוסקופ שני הפוטונים.
6. לרכוש תמונות כמו בשלב 4.6.
7. חזור על שלבי 5.1-5.5 לאחר הדמיה.

תוצאות

בעכברי שורת YFP-H ^25, חלבון פלואורסצנטי צהוב מבטא בקבוצת משנה של נוירונים פירמידליים בשכבת V, אשר פרויקט דנדריטים קודקודם לשכבות השטחיות בקליפת המוח. דרך ההכנה דלילה, הגולגולת, מגזרים הדנדריטים שכותרתו fluorescently יכולים להיות צילמו שוב ושוב מתחת למיקרוסקופ שני פוטונ?...

Discussion

כדי להשיג הכנה דלילה, גולגולת מוצלחת, כמה צעדים בפרוטוקול זה הם קריטיים. 1) העובי של הגולגולת. יש עצם גולגולת מבנה כריך, עם שתי שכבות של עצם קומפקטי בצפיפות גבוהה ושכבה אמצעית של עצם ספוגי בצפיפות נמוכה. בעוד תרגיל מיקרו במהירות גבוהה הוא מתאים להסרת השכבות החיצוניות ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Bioniche Pharma	67457-034-10	Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine	Lloyd laboratories	139-236	Mixed with ketamine for anesthesia
Saline	Hospira	0409-7983-09	0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades	Electron microscopy sciences	72000	Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads	Fisher Scientific	06-669-62	Sterile alcohol prep pads
Eye ointment	Henry Schein	102-9470	Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs	Fine Science Tools	19007-14	1.4 mm diameter
Microsurgical blade	Surgistar	6961	The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue	Fisher Scientific	NC9062131	Fix the head plate onto the skull
Suture	Havard Apparatus	510461	Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope	Olympus		SZ61
CCD camera	Infinity
Two-photon microscope	Prairie Technologies		Ultima IV
10X objective	Olympus		NA 0.30, air
60X objective	Olympus		NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser	Spectra-Physics		Mai Tai HP