הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

Summary

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Abstract

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Introduction

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own ^1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established ⁴. Our protocol is a streamlined version of the original protocol ⁴ that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines.

In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo ⁵. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains ^6,7.

The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. העובר הכנה

1. אם לא נעשה באופן שגרתי כחלק מתרבות עובר, דה-הג'לי עובר באמצעות ציסטאין 2.5%, pH 8.0 לפני קיבוע ^8. למרות שזה לא הכרחי, הוא שימושי וללאחר מכן להסיר באופן ידני את מעטפת ההפריה לפני הקיבוע באמצעות מלקחיים בסדר.
   1. השתמש בטפטפות פסטר זכוכית להעביר את העוברים. פיפטה אינה רחבה מספיק כדי להעביר עוברים כך להשתמש בעט יהלום לחתוך טפטפת הזכוכית בנקודה רחבה מספיק כדי להרים את עובר. לחסל את הקצוות החדים של טפטפות לאחר החיתוך על ידי העברה במהירות את הקצה לחתוך דרך הלהבה של מבער בונזן כדי להמס את הקצוות החדים.
      הערה: טיפול צריך לקחת, כמו הזכוכית עדיין יכולה להיות חמה מספיק כדי לגרום לכוויות למרות שזה נראה שמקורר על ידי בדיקה ויזואלית.
2. בצע את קיבעון העובר בשלבים. ראשית, להכין צלוחיות זכוכית לשימוש בקיבעון עובר. השתמש בבקבוקונים הללו לכל השלבים כולל סופיאחסון. השתמש בבקבוקונים שברורים עם חותם טפלון טוב במכסה, המאפשרים לניטור עוברי במהלך כל השלבים של התהליך. תווית הצלוחיות עם מידע ניסיוני מתאים באמצעות סמן קבוע ולאחר מכן לכסות את התווית עם סרט ברור, כמו גם סמן קבוע יאבד במהלך ההליך בשל השימוש באלכוהול וממסים אחרים.
   1. השתמש Mempfa לתקן את העוברים. הפוך מניות של paraformaldehyde 8% בקבוצות של 50-100 מיליליטר בכל פעם. השתמש בכ -75% מH ₂ O הנדרש וחום 50-60 מעלות צלזיוס, אשר נדרשה כדי לקבל את paraformaldehyde לפתרון.
      הערה: פתרון זה הוא מעט שונה מMemfa שימש בגרסות פרוטוקול שפורסמו מבוגרות בכך שהוא מנצל paraformaldehyde במקום פורמלדהיד.
   2. להוסיף 2-3 טיפות של NaOH 10N או עד pH הוא כ 7.5 (נייר pH שימוש כדי לבדוק pH). Paraformaldehyde הוא מאוד רעיל, ולכן ליצור פתרון המניות במנדף. ברגע שפסקפורמלדהיד הוא בפתרון, לסנן את הפתרון באמצעות נייר Whatman לתוך מיכל טרי ולהוסיף H ₂ O לנפח הסופי. במידת הצורך, לאחסן פתרון paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות.
   3. להרכיב את הרכיבים הנותרים של פתרון Mempfa קיבעון (טבלת 1). ודא שריכוז העבודה הסופי של paraformaldehyde הוא 4%. אחסן את כל הרכיבים של פתרון הקיבעון על 4 מעלות צלזיוס במניות.
   4. בעזרת פיפטה קריסטל, לתקן את העוברים על ידי הוספת העוברים לבקבוקוני זכוכית שכותרתו כי כבר מלאים במ"ל כ 3-4 פתרון Mempfa (טבלת 1). הימנע מתיקון יותר מ 20-30 עוברים לכל בקבוקון. הוסף את העוברים עם מינימום של העברת נוזל ממדיום העובר. תקן את העוברים בפתרון Mempfa לשעת 2 ​​בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
   5. למבנים האנדודרם מאוחר לבצע במנח על מכשירים נגזרים בטן והאנדודרם מבודדים באופן ידני ^9,10, המאפשר לחדירה טובה של החללית וגם ימנע כתמי חלל.
   6. אחסן פתרון של מתנול 100% ב -20 ° C. לאחר קיבוע paraformaldehyde, להחליף את פתרון Mempfa עם כ 4 מיליליטר של -20 ° C, מתנול 100% לאחסון של העוברים.
   7. לערבל את הבקבוקונים לאחר תוספת של מתנול כדי למנוע את העוברים יידבקו לזכוכית או עוברים אחרים. כמו כן, ודא הבקבוקונים בחוזקה אטומים כי מתנול יכול להתאדות במקפיא לאורך זמן אם רופף.
      הערה: ניתן לאחסן עוברים לשנה לפחות, וסביר יותר, במתנול לפני מכתים ללא איבוד איכות הכלאה באתר.

2. בדיקה הכנה

1. השתמש 1-2 מיקרוגרם של תבנית ה- DNA על מנת להפוך את הבדיקות שכותרתו digoxigenin. פלסמיד Cut המכיל את רצף ה- DNA המתאים בסוף '5 של הגן של עניין עם הגבלת האנזים מתאים לthaוקטור t ליצור בדיקות antisense.
   הערה: פלסמיד צריך אתר קישור RNA פולימראז המתאים (למשל T7, T3, או SP6).
2. לאפשר את ה- DNA, מים, NTP לערבב וחיץ פולימראז כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני הרכבת תגובת סינתזת בדיקה. מוסיף את הרכיבים של סינתזת התגובה RNA לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר בצו כמפורט בטבלה 2. התאם את נפח מים הוסיף להביא את הנפח הכולל של סינתזת תגובת בדיקה עד 20 μl. להרכיב את התגובה בטמפרטורת חדר, כי רכיבים של חיץ פולימראז יכולים להאיץ את ה- DNA התבנית כאשר בריכוזים גבוהים וקרים.
3. דגירה תגובת השעתוק עבור שעת 2 ​​ב 37 ° C.
   הערה: incubations של מעט יותר משעתיים מובילה לשום תופעות לוואי, אלא גם להראות קצת גדלה תשואה. אם טופח במשך שעה אחת, התשואה תקטן, אבל עדיין מספיק כדי להפוך את בדיקה טובה.
   1. בזמן ההמתנה לתגובת השעתוק ועד סופו, להפוך את הג'ל agarose אשר ישמש כדי לבדוק את האיכות של החללית. להמס 1 מיקרוגרם של agarose בשל חיץ 1x טה 100 מיליליטר (ראה טבלה 1) על ידי חימום הפתרון לנקודת הרתיחה. הסר את הפתרון מחום כאשר אבקת agarose נמסה לגמרי.
   2. הוסף 2 μl ethidium ברומיד פתרון מניות (10 מ"ג / מיליליטר) לכ -100 מיליליטר של ג'ל agarose כאשר agarose התקרר לכ -60 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר ויזואליזציה של RNA באור אולטרה סגול (UV).
      הערה: פתרון agarose ג'ל זה יכול להיות כל הזמן בחממה C ° 60, כך שיכול להיות שפכו ג'לי עתיד ללא המסה חוזרת ונשנית. תשמרו על עצמך בטיפול ברומיד ethidium בשל רעילות אפשרית.
4. להוסיף μl 1 DNAseI (כיתה חופשית RNAse) לתגובת השעתוק לאחר הדגירה שעה 2 ודגירה נוספת 10 דקות ב 37 ° C לחסל תבנית ה- DNA.
5. הסר 1 μl של תמהיל התגובה ללבדוק 1% ג'ל agarose-טה והשאר (20 μl) להוסיף 80 μl של 1% SDS במאגר TE (10 מ"מ טריס pH 8.0, 1 mM EDTA), 10 μl של 5M NH ₄ Acetate, ו- 220 μl אתנול קר של. וורטקס התמהיל נמרץ ומניח בצד על קרח עד לתוצאות בדיקת איכות RNA ידועות.
   1. הפעל את μl 1 של RNA להסיר לפני הממטרים ב1% ג'ל agarose-טה. כדי להקל על העמסה על הג'ל, להוסיף 4-5 μl מים וμl 1 של צבע טעינה הסטנדרטי לRNA. צפה RNA על הג'ל באמצעות transilluminator אור UV כדי לבדוק את איכות הבדיקה (ראה דיון).
6. לזרז את הרנ"א שנותר ששמר בצד על קרח בשלב 2.5 על ידי ספינינג בmicrocentrifuge במלוא מהירות במשך 10 עד 15 דקות. לצייר את supernatant עם טפטפת זכוכית נמשך החוצה ולאפשר לו להתייבש בקצרה.
   1. Resuspend הבדיקה עם 1 מיליליטר של חיץ הכלאת RNA (טבלת 1) בצינור Eppendorf. וורטקס וbriefly לחמם את הצינור עד 37 מעלות צלזיוס ומערבולת שוב. מעביר את פתרון הבדיקה כדי 15 מיליליטר בורג צינור קלקר כובע ולמלא ל7-10 מיליליטר עם חיץ הכלאת RNA. הערה: הבדיקה יכולה להיות מדוללת נוספת (דילול נוסף של 10 לקפל עדיין יכול לעבוד) ופעמים רבות תוצאה רקע נמוך אבל התגובות מכתים גם להימשך זמן רב יותר.

3. הכלאה באתר

1. קח את העוברים שאוחסנו במתנול -20 ° C ולאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר. בצע את ההליך כולו בבקבוקוני הזכוכית. אם עוברים שונים מקבוצה אחת הולכים להיות הסתכלו על ידי בדיקות שונות, לשמור אותם בבקבוקון אחד עד ממש לפני הבדיקות נוספות כדי להפחית את השונות ועבודה ביום הראשון.
   1. רעננותם עובר דרך סדרת מתנול כפי שמתואר בטבלה 3 (ראה טבלה 1 למתכונים לשטוף) בהכנה לתוספת של הבדיקה. מערבולת בעדינות את אמברימערכת ההפעלה לאחר כל שינוי כדי להבטיח שהם לא נשמרים לצדדים או אחד את השני, ולטלטל את העוברים על ידי הרכבה הבקבוקונים על nutator. בעת העברת הנוזלים, לבדוק את החלק הפנימי של הכובעים כדי להבטיח שעוברים לא היו לכודים שם.
   2. פעם אחת בפתרון הבדיקה, להכליא את עוברי לילה כפי שמתואר בטבלה 3.
2. הסר את פתרון הבדיקה. שמור את הבדיקה בשימוש על ידי אחסון 15 מיליליטר בורג צינור כובע קלקר, מסומן בתאריך ומספר הפעמים שהבדיקה נעשתה שימוש, ב -20 ° C.
   הערה: אותו הבדיקה ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות שללאחר מכן בהכלאות באתר עד תגובות colorimetric להתחיל לקחת זמן רב באופן חריג להגיע עוצמה רצויה.
   1. ברגע שהבדיקה היא שהוסר, להכין את העוברים למכתים נוגדן נגד הבדיקה באמצעות הסדרה של שוטף המפורטים בטבלה 4. שינוי הטמפרטורה כנדרש (לוח 4) על ידי הזזת tהוא nutator, עם בקבוקונים של עוברים המצורפים, ישירות לתוך תנורי הכלאה שמוגדרים לטמפרטורה המתאימה.
   2. מרכיבים את הנפח המתאים של MAB + HTSS + BR + אנטי-Dig נוגדן (לוח 4) בזמן שהעוברים שטופחו על ידי MAB + HTSS + BR פתרון חסימה כך שהנוגדן חסום לפני הוספה ל עוברים. הפוך את פתרונות החסימה טריים ביום של שימוש.
3. הסר את פתרון הנוגדן ולהתחיל שטיפות כפי שמתואר בטבלה הבאה 5 דגירה הלילה עם נוגדן. לבצע לפחות עשר 30 שטיפות דקות כדי להתכונן לצביעה עם מצע phosphatase אלקליין ולהפחית את הרקע ככל האפשר. השתמש באחת חיץ MAB או פתרון TBT (טבלת 1) לשלבי הכביסה.
   הערה: פתרון TBT הוא TTw כי יש 2 מ"ג / מיליליטר של BSA הוסיף.
   1. החלף את הפתרון לשטוף האחרון עם מצע phosphatase אלקליין הסגול BM. בצע את reac מכתיםtion באו טמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: מכתים הוא יותר מהיר ב- C ° 37, אבל אם נשאר כל הלילה, מכתים רקע מקובל לעתים קרובות יכול להיות תוצאה. התגובות מכתים לעתים קרובות דורשות צביעת הלילה וטמפרטורת חדר היא הבטוחה ביותר לכך.
   2. אם נדרש צביעה נוספת והפתרון הסגול BM הוא לוקח על צבע כחול, להחליף את הפתרון מכתים עם טרי BM הסגול ולשים את הצינורות לתוך 37 מעלות צלזיוס. אם mRNA היעד הוא מאוד עשיר, לשים את העוברים בפתרון מכתים ב 4 ° C למשך לילה ולאחר מכן להעביר את העוברים לטמפרטורת חדר או 37 ° C כדי לאפשר ניטור טוב יותר של התגובה מכתים.
   3. צג תגובות חדשות בזהירות, כזמן תוצאה סופית משתנה במידה ניכרת בין RNAs היעד שונה. לשם עקביות, לעצור את התגובה מכתים (ראה 3.4) כאשר אין אתרים חדשים של ביטוי נובע עם דגירה ארוכה יותר. חשוב לציין, אם הכלאה באתר נמצא בשימוש כassayלניסויים מסתכלים על קבוצות טיפול שונות, להשתמש באותו הזמן לתגובות צבע בין עוברי טיפול ושליטה.
4. לעצור את התגובה מכתים ולהכין את העוברים לאחסון והקלטת תמונה על ידי שינוי הנוזלים כפי שמתואר בטבלה 6. לא לטלטל את העוברים בשלב זה, כי הסרת הכתם יכולה להיות דמיין כצביעה סגולה של מתנול סביב העוברים.
   הערה: לעתים קרובות יש לי עוברים צביעה בצבע תכלת מהפתרון מכתים ומתנול הקר לפחות באופן חלקי יכולה להסיר את זה, למרות שזה אינו מספיק כדי להסיר את הרקע כבד או כתמי חלל. מתנול קר מתייחס למתנול שנשמר ב-20 ° C במקפיא.
   1. רעננותם את העוברים ולתקן את הכתם עם Mempfa (לוח 6). ברגע קבוע, להסיר את Mempfa ולשטוף את העוברים עם מתנול 25%.
   2. הסר את מתנול 25% ולהוסיף את פתרון ההלבנה אם ההסרה של פיגמנט אנדוגנינדרש. תשמור על עצמך בטיפול בפתרון ההלבנה כפי שהוא יכול לגרום לכוויות. שים לב להלבנה מקרוב כפי שזה קורה במהירות יחסית ואת מידת ההלבנה יכולה להיות מגוונת לאפקטים שונים (איור 2).
   3. ליבש עוברים דרך סדרת מתנול מתנול 100% עבור אחסון לטווח ארוך הבאה הלבנה, או להעביר לPBS עבור אחסון לטווח קצר וההדמיה הבאה (ראה טבלה 6).

4. עוברים הדמיה

1. ברגע שעובר השלים את תהליך הצביעה, תמונת העובר, כך שהמידע על איפה הגן של העניין מתבטא הוא נתפס לקהל רחב יותר. השתמש 1% agarose כרקע לצפייה בעוברים הבלתי מסולקת.
   הערה: agarose נותן רקע כחול / אפור שעומד בניגוד היטב עם העובר והצבע הכחול של התגובה מכתים. זה גם עוזר לפזר צללים והשתקפויות שלהסיט את תשומת לב מן העובר מסיחים את דעת.
   1. להוסיף agarose למים ולאחר מכן מביא לרתיחה עד agarose הוא בפתרון ולאחר מכן לתת מגניב עד 50 לפני שנשפכים לתוך צלחת פטרי. כמו במקרה של פתרון ג'ל טה, לאחסן פתרון agarose ב -55 מעלות צלזיוס חממה לשימושים מרובים. יוצקים את agarose עד לעומק של כ -2 מ"מ בצלחת פטרי. במידת הצורך, להתאים את עומק agarose להניב מעט שונה צל הרקע.
   2. בעקבות התייבשות מהאחסון במתנול לתמיסה מימית (PBS או TTw), באמצעות סדרת מתנול, מניח את העוברים בצלחת פטרי עם בסיס agarose (ראה לוח 6). שמור את הפתרון נקי ואם נדרש, להשתמש בסינון פשוט לחסל חומר חלקיקים קטן שיכול לשבש את הרקע הנקי של תמונות טובות.
   3. לתמונה עובר מהשקפות חלופיות, כגון מהצד הגחון, לחתוך דקים ערוצים בagarose כדי להתאים את העובר באמצעות מלקחיים עדינים ומניח את העוברים באותם ערוצים לכיוון (איור 3 ). תשמרו על עצמך במניפולציה של העוברים כפי שהם נפגעו בקלות.
      הערה: רוב השלבים עמדה אופיינית שהם מניחים כאשר הניחו פתרון. לדוגמא, עובר blastula השלבים נוטים לשבת בצד עד לבעלי חיים. ברגע שעובר מתחיל להאריך, הם שכבו בצד שלהם.
2. השתמש במקור האור האופטי סיבים כדי להאיר את העובר מזווית רדודה, יצירת צללים על העובר המספקים עומק לתמונה ולעזור להבחין מבני משטח. משום הלבנה יכולה לחסל פיגמנט המספק ציוני דרך שימושיות, להשתמש בהצללה לעוברים מאוד מולבנים.
3. נקה את העוברים לצביעת תמונה שהוא עמוק בתוך העובר, כגון בnotochord, הריאות, או באזורים של המוח, (איור 4). כדי להשיג זאת, לשים את העוברים דרך סדרת מתנול עד 100% מתנול.
   1. לאחר טבילה מלאה במתנול, להעביר את העוברים לנזיל אלכוהול פתרון של חלק אחד ושני חלקים בנזיל להיותnzoate (באב). עובר אשר יצוף על פני השטח, אלא כמתנול מתערבב עם באב, הם ישקעו באב. לבצע כל צעד העוסק באב בבקבוקוני זכוכית או כלים; באב יתמוסס כל פלסטיק או צבע.
   2. ברגע שפינה, להציג את העוברים עם אור מועבר מגיע מלמטה העובר. התאם את עוצמת האור, כמו גם את הזווית מלמטה כדי לשפר את הניגודיות ומספק את הצבע הטוב ביותר.
   3. כאשר עוברים פינו צפייה להעלות את צלחת פטרי מזכוכית משל הבסיס. לעשות את זה פשוט על ידי השימוש בשני מכסים בצלחת פטרי אחרים כדי לגייס אותו כך שהאזור של המנה עם עוברים הוא גבוה.
      הערה: זו יש את היתרון של לקחת את הבסיס מחוץ לפוקוס וביטול השפעות מסיחות את הדעת מפגמים או כתמים על בסיס מיקרוסקופ שיכול להפריע לתמונה.

הכלאה באתר 5. זוגי ב

1. כדי בו זמנית כדי להציג את דפוס הביטוי של two גנים שונים בעובר יחיד, לסנתז שתי בדיקות, אחת לכל אחד מהגנים השונים. לסנתז בדיקה אחת באמצעות DIG-11-UTP כתווית כפי שתואר לעיל. לדלל את המוצר של תגובת השעתוק במאגר הכלאה RNA להניב בדיקה מרוכזת יותר מאשר 3x משמש ליחיד בהכלאות באתר.
   1. לסנתז בדיקה נוספת של ריבית תוך שימוש באותו הפרוטוקול כלDIG שכותרתו חקר פרט לכך שההעמסה-12-UTP חייב להיות תחליף לDIG-11-UTP. לדלל את המוצר של תגובת השעתוק במאגר הכלאה RNA להניב בדיקה מרוכזת יותר מאשר 3x משמש ליחיד בהכלאות באתר.
   2. מערבבים את שתי בדיקות מרוכזות ביחס של 1: 1. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בבדיקה שכותרתו והעמסת לגן המציג את הביטוי החזק ביותר באחד בפרוטוקול הכלאה באתר.
2. השתמש באותו בפרוטוקול הכלאה באתר תאר לאחד באתרו </ Em> הכלאות, למעט שימוש בבדיקה הכפולה (בדיקה המכילה תערובת 1.5x מרוכזת של בדיקות שכותרתו digoxigenin ושכותרתו והעמסת) בסופו של היום הראשון במקום יחיד בבדיקת הכלאה באתר.
   1. בצע את פרוטוקול הכלאה אחת ביום השני של כפול בפרוטוקול הכלאה באתר, פרט לברי שימוש אנטי-והעמסת-AP Fab בדילול 1: 4,000 במקום של שברים אנטי DIG-AP Fab. לשטוף את הנוגדן העודף מהעובר כמו באחת בפרוטוקול באתר ולבצע את תגובת הצבע הראשונה באמצעות מצע BM-הסגול AP.
3. בעקבות תגובת הצבע הראשונה, להשבית את נוגדן flourescein ב 0.1 M pH גליצין 2.0 במשך 40 דקות ואחריו חמש עשר דקות בשוטף MAB. חסום את העוברים בMAB + HTSS + BR למשך 90 דקות. הוסף את הנוגדן אנטי DIG בדילול 1: 2,000 בMAB + HTSS + BR דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   1. למחרת, לשטוף את העוברים הoroughly בMAB (12 שטיפות של 30 דקות) כדי להסיר את הנוגדן העודף.
   2. לשטוף את העוברים במשך 10 דקות בAP הצפת (טבלה 1) ולאחר מכן כתם עם BCIP (0.5mg / מיליליטר בAP Buffer).
      הערה: באתרו שילוב צריך לתת כתם כחול-סגול כהה לתגובת הצבע הראשונה ותגובת צבע תכלת לשנייה (איור 5).
   3. לעצור את תגובת הצבע הסופית על ידי הסרת חיץ AP ולשטוף שלוש פעמים עם MAB. תקן את העוברים עם Mempfa במשך 10 דקות. לשטוף את העוברים עם 5 שוטף מהיר בMAB או TBT.
   4. עם שילוב הצבעים הזה, השימוש במתנול בטיפולים שלאחר הצביעה הוא כבר לא אפשרי, כפי שהוא יבטל את הצבע לבד BCIP. אחסן את העוברים לאחר מכתים וקיבעון בPBS עם 0.02% אזיד הנתרן. מכתים עוצמה יכולה להיות חלש עם כפול במנח. אם מדובר בבעיה, להפחית את שטיפות לארבעה, כל אחד מ2 משך שעה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השימוש בבדיקות רקמות ספציפיות יכול לספק מידע מצטיין בכל הקשור למצב של פיתוח לאיברים ספציפיים. בדוגמאות הבאות, שלבו של העובר מבוסס על שולחן בימוי Nieuwkoop וFaber ^11. אם האדם משתמש בגני טופס בדיקות ביטאו לאחר בידול, טרופונין אני לב בשלב 28-30, למשל (איור 1 ג), נ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

היכולת להשתמש בכלאה באתר כדי להמחיש את דפוס הביטוי של גנים מסוימים נשארת השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לזיהוי איברים ספציפיים או סוגי תאים בעובר Xenopus. סיבה לכך הוא מספר יתרונות המוצעים על ידי טכניקה זו. הביטוי של גן יכול לזהות מבנים ספציפיים היטב לפני כל סימן הי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labguake Tube Shakers	VWR	17-08-2011
VWR Vials	VWR	10-07-2012
L-Cysteine	BioShop	CYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polymerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polymerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polymerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Sheep Serum	Wisent	31150
Blocking reagent	Roche	11096176001
BM purple Ap Substrate	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments	Roche	11093274910
Methanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.500
Formamide	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Maleic Acid	VWR	CAMX0100-3
tri-Sodium Citrate	BioShop	CIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Benzyl Alcohol	Sigma	B-1042
Benzyl Benzoate	Sigma	B-6630
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500