SIVQ-LCM פרוטוקול עבור מכשיר ArcturusXT

Summary

SIVQ-LCM הוא גישה חדשנית שרותמת אלגוריתם מחשב, מרחבית הקבועים וקטור קוונטיזציה (SIVQ), לנהוג microdissection ללכוד לייזר התהליך (LCM). זרימת העבודה SIVQ-LCM משפרת באופן משמעותי את המהירות ודיוק של microdissection, עם יישומים בשני המחקר ומסגרות קליניות.

Abstract

SIVQ-LCM הוא מתודולוגיה חדשה לאוטומציה ומייעלת את התהליך מסורתי יותר, המשתמש תלוי לייזר לנתיחה. מטרתו ליצור טכנולוגיה מתקדמת, במהירות להתאמה אישית פלטפורמה לנתיחה בלייזר. בדו"ח זה, אנו מתארים את השילוב של תוכנת ניתוח התמונה מרחבית הקבועים וקטור קוונטיזציה (SIVQ) על גבי מכשיר ArcturusXT. מערכת ArcturusXT מכילה גם אינפרא אדום (IR) ואולטרה סגול לייזר (UV), המאפשר לתא ספציפי או ניתוחי שטח גדולים. המטרה העיקרית היא לשפר את המהירות, דיוק, ושחזור של נתיחת הלייזר כדי להגדיל את התפוקה לדוגמא. גישה חדשנית זו מאפשרת microdissection של שני רקמות אנושיות במחקר ובזרימות עבודה קלינית בבעלי חיים ו.

Introduction

שפותח במקור באמצע 1990, microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר למשתמש ללכוד בדיוק תאים ספציפיים או אזורים סלולריים מקטע רקמה היסטולוגית באמצעות הדמיה מיקרוסקופית ^{1, 2.} מחקרים רבים השוו ניתוח מולקולרי של LCM לעומת שריטות רקמה להמחיש את הערך של ^3-12 השיטה. בנוסף, ישנם שלושה פרסומי פרוטוקול וידאו בטכנולוגיה שזמינות לצפייה ^{13, 14.} עם זאת, למרות הערך המוכח שלה, LCM יכול להיות מייגע ומפרך כאשר היעד של עניין הוא אוכלוסיית תאים מפוזרת בסעיף הטרוגנית רקמות, או כאשר מספר גדול של תאים נדרשים ליישומים במורד הזרם ספציפיים כגון פרוטאומיקה. הנטל שהוטל על המפעיל האנושי הוביל אותנו לפתח גישה לנתיחה אוטומטית למחצה לLCM על ידי שילוב של אלגוריתם ניתוח תמונה רב עוצמה כדי להנחות את תהליך LCM ^15.

<כיתת p = "jove_content"> בשיתוף עם אוניברסיטת מישיגן, המעבדה שלנו בNIH האריכה את פותח בעבר ודיווח קוונטיזציה וקטור מרחבית בלתי משתנה אלגוריתם (SIVQ) באופן שיאפשר לה למחצה להפוך את תהליך הבחירה לרקמות פנימי ל מודרך microdissection, ובכך זמין כלי עם פתולוג או מדען חיים בראש. קוונטיזציה וקטור במרחב בלתי משתנה (SIVQ) היא אלגוריתם המאפשר למשתמש פשוט "לחץ" על תכונה היסטולוגית של עניין כדי ליצור וקטור טבעת (תכונת תמונה נשוא) שניתן להשתמש בם כדי לחפש את התמונה היסטולוגית כל, התאמה לסף הסטטיסטי צורך ^כ16-21. מפת החום כתוצאה מציגה את האיכות של משחקים לתכונת תמונת נשוא הראשונית ומומרת לאחר מכן לתוך צבע אחד מפת ביאור (אדום) שיכול להיות מיובאת לתוך מכשיר LCM. תוכנה אוטומטי הבחירה, AutoScanXT, לאחר מכן נעשה שימוש כדי לצייר מפה מבוססתבביאור של SIVQ מנחה את לכידתו של תאי היעד מן מדגם הרקמות. הפרוטוקול מפורט להלן מתאר את היישום של SIVQ לתוך העבודה microdissection.

Protocol

הפרוטוקול המתואר הועסק על פי כללי NIH על השימוש בדגימות רקמה אנושיות.

1. הכנת רקמה

1. לפני ההתחלה, להשיג דגימות רקמה אנושיות על פי מוסדית מועצה לביקורת פרוטוקולים (IRB).
2. בחר את סוג בלוק רקמה / תא ושיטת עיבוד מקביל [קבוע פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE), קפוא, או קבוע אתנול (EFPE) פרפין, מוטבע]. קיבעון פורמלין מספק היסטולוגיה האופטימלית, ואחריו קיבעון אתנול ופלאש קפוא. עם זאת, שיטות עיבוד קיבעון ורקמה יכולות להשפיע על ה-DNA, RNA, וכמות חלבון ואיכות לניתוח מולקולרי במורד הזרם וצריכה להיחשב.
3. חותכים את חלקי גוש רקמה / תא על סוג השקופית (זכוכית, זכוכית קרום, או קרום מסגרת מתכת) של בחירה. ניתוח SIVQ עובד באותה מידה בכל שלושת סוגי השקופיות. שים לב כי השיטה פסאודו coverslip (שיפורט להלן) עם xylenes ואיתןol לא יכול להתבצע על שקופיות קרום מסגרת מתכת מאז השקופיות חייבת להיות הפוכה על הבמה.
4. בחר כתם רקמה כימי או מבוסס IHC כדי לזהות תאים של עניין מהרקע. שים לב ששיטות הצביעה יכולות להשפיע גם על DNA, RNA, ואיכות חלבון וכמות של הרקמה. בדוק את הרקמה לאחר הצביעה כדי להעריך את האיכות בסיסית של ביומולקולות לפני שתמשיך עם הפרוטוקול. SIVQ-LCM שבוצע בשקופיות רקמה / ציטולוגיה מוכתמת ב: אימונוהיסטוכימיה (IHC) עם ¹⁵ DAB, immunofluorescence, אדום מהיר, דה נובו אדומה, toluidine הכחול, וhematoxylin ו eosin (H & E) (נתונים שלא פורסמו).

2. דגימת הדמיה

1. העומס מחליק על הבמה הממונעת של מכשיר microdissection ולהפעיל את התוכנה בנושא. בחר בתיבות הסימון כדי לייעד את עמדותיהם של השקופיות עמוסות ולהבטיח את קבצי תמונה שנתפסו הם יישמרו בפורמט jpeg.
2. לייעל imאיכות גיל ידי כוונון הבהירות והמיקוד של התמונה על המסך, או באמצעות גלגל הפוקוס הידני או באמצעות התוכנה של המכשיר לנתיחה.
   1. שימוש בארגז הכלים של התמונה בתוך התוכנה של המכשיר לנתיחה, קבע את רווח בהירות המנורה ומצלמה כראוי. ערכי דוגמא הם בהירות = 60 ורווח = 220, עם המפזר.
   2. פוקוס באופן ידני או עם תכונת פוקוס אוטומטי בתוכנה.
3. ללכוד תמונת סקירת תמונה ממוזערת של השקופית לספק מפת דרכים לתהליך הנתיחה.
   1. לקבלת איכות תמונה אופטימלית של שקופיות uncoverslipped, לנצל את המפזר מתחת למעבה על המכשיר, או, להוסיף כמות קטנה (~ 30 μl) של או אתנול או xylenes כדי לשפר את המדד עקשן (פסאודו coverslip). בעת השימוש בxylenes, להיות מודע שהם חייבים לשמש אמצעי בטיחות רעיל ותקין, ובכלל זה השימוש במנדף וחלוק מעבדה מגן, משקפי מגן עיניים, וכפפות.
   2. אין להניח את כובע LCM בשקופית עד פתרון אתנול או xylenes יש פינה או הפולימרים על המכסה יהיו מעוות לחלוטין.
4. נווט בשקופיות ותמונות לכידתו של האזורים להיות גזורים ב10X, 20X, 40X או הגדלה. במידת צורך, לשפר את התמונה עם תוכנה כגון תיקון שגיאות אוטומטי (בתמונת מנהל Microsoft Office) כמתואר ²² בעבר. תמונות חייבת להיות בשבי בפורמט jpeg כדי לאפשר להם להיות מחדש מיובא לתוך תוכנת בחירה האוטומטית.

3. ניתוח האלגוריתם של התמונה

1. העברת תמונות שנתפסו ממכשיר microdissection לתיקיית SIVQ. להתקין ולפתוח את חבילות תוכנת ArcturusXT, AutoScan וSIVQ במחשב המחובר למכשיר לנתיחה. לקבלת גישה לתוכנת SIVQ, אנא צור קשר עם ד"ר יוליסס Balis (ulysses@med.umich.edu).
2. SIVQ להרחיב ולטעון את התמונה שצולמה (JPEG) של עניין.
3. נווט לאזור של ריבית ו / או להתאים את גודל חלונות הראווה (Viewport 5 ו -6). בתוכנת SIVQ, Viewport 5 מראה את התמונה מראש העיבוד וViewport 6 מציג את התמונה לאחר עיבוד ^16.
4. בחר את הגודל של וקטור הטבעת ומספר הצלצולים לשמש.
5. בחר בתכונת התמונה הנשוא להיות בשבי על ידי לחיצה ימנית על זה בViewport 6.
6. לחץ על "סריקה" כדי לנתח את התמונה.
7. התאם את ההסתברות הסטטיסטית של התאמת תמונה באמצעות שני ברים זזים. בר העליון מתאים את הספציפיות וקטור הכלליים, והוא משמש להוציא שטח מהסריקה הראשונית (עם רגישות כפי שהוגדר על ידי משתנה "Stat" נבחר) שעשוי לייצג שטח כלול מוגזם. לעומת זאת, את המחוון הנמוך מנוצל כדי להגביר את הרגישות, לאחר סריקה מתבצעת, מתוך הכוונה להגדיל את השטח שיסווג כמשחק. שני פקדי מחוון אלה UTIליזה משתנה "Stat" כסף רגישות בסיסית הראשוני.
8. כדי לשמור את התמונה, לחץ על "שמירה בשם JPEG" (תמונה נשמרה כעת בתיקיית C :/ vq_test / תמונות).
9. נתח את התמונה עם האלגוריתם. הפלט של ניתוח האלגוריתם צריך לגרום לתמונה מבוארת שזה יהיה בשימוש בSIVQ-LCM. נכון לעכשיו, הגרסה הנוכחית של מנוע ליבת SIVQ היא בבדיקת גרסת הבטא עם הציפייה כי הגרסה המלאה הייצור (Q1 זמין 2014) תשלב ערכת פיתוח תוכנה מלאה (SDK) וממשק תכנות יישומים (API) לשילוב פשוטים של מסננים המרחבי נוצר על ידי משתמש וצעדי עיבוד נתוני זרימת עבודה במורד הזרם עם מנוע התאמת טבעת הליבה. SDK זה יחולק עם סט של תיעוד מלא.
   1. ודא שHeatmap SIVQ משתנה לצבע אדום אחיד.
10. לייצא את התמונה. זה חיוני כדי להטביע מחדש את קואורדינטות positional בעמ 'תמונת JPEG OST-ניתוח באמצעות עורך HEX כדי להדביק בכותרת הקובץ מתמונת מכשיר נתיחה המקורית. הנתונים המתאימים, ניתן למצוא בין "התחלה של תמונה" סמן (0xFF, 0xD8) ואת הסמן הראשון "הגדרת קוונטיזציה טבלה" (0xFF, 0xDB).

4. Microdissection

1. מניחים את כובע LCM במרכזו של האזור של עניין, שבו התמונות שנתפסו לניתוח SIVQ.
2. כיול ובקרת איכות (QC) לייזרי UV / IR ולייעל את הפרמטרים, ובם חשמל, משך זמן, מקומות לייזר, ומהירות חיתוך UV (כפי שהומלץ על ידי היצרן). לבצע כיולים אלה לפני מחדש יבוא התמונה מנותחת.
3. AutoScanXT הפתוח (תוכנת בחירה אוטומטית) ולייבא את התמונה ניתחה מג :/ vq_test תיקייה / תמונות.
4. לאמן את תוכנת בחירה האוטומטית להכיר בביאור SIVQ וליצור את המפה לנתיחה.
   1. כדי ליצור traiקובץ נינג, בחר ארבעה אזורים של עניין (בסימן "עיגולים כחולים") על "צבע אדום" של התמונה ניתחה SIVQ.
   2. בחר את אזורי הרקע (מסומנים על ידי "ריבועים אדומים") שלא להיות גזור.
   3. לחץ על הכפתור "נתח" כדי ליצור את קובץ אימון, אותו ניתן לשמור לשימושים שלאחר מכן.
5. בצע microdissection באמצעות אינפרא אדום המתאים (IR) ו / או אולטרה סגול לייזרים (UV).
   1. העתק את האזורים שנבחרו על התמונה "בשידור חי".
   2. בארגז הכלים "microdissect", בחר בלכידת IR המתאימה או כפתורי חיתוך UV.
6. לאחר הנתיחה הושלמה, להעביר את כובע LCM לתחנת QC וללכוד תמונה של רקמות / תאים גזורים. גישה נוספת היא למקם את הכובע על אזור ריק בשקופית לפני שתעביר אותו לתחנת QC, זה מאפשר למשתמש לצלם תמונות בהגדלות שונות.
7. ללכוד תמונה של אזור הרקמה של עניין לאחר microdissection כדי להעריך עוד יותר מרים את יעילות.
8. אם התאים הרצויים כבר ניתחו בהצלחה, לחץ על הכפתור "השלב הנוכחי" בתוכנת ArcturusXT ולהסיר את כובע LCM ליזום הליך המיצוי המולקולרי לניתוח במורד הזרם.

תוצאות

קטע רקמת שד האנושי FFPE היה immunostained לcytokeratin AE1/AE3 באמצעות פרוטוקול IHC סטנדרטי ^23. לאחר צביעה, שקופית הרקמה הוצבה על הבמה ArcturusXT ופרוטוקול SIVQ-LCM יזם כפי שתואר לעיל. מאז הרקמה לא ניתן coverslipped לmicrodissection, התאים + המוכתמים IHC יכולים להיות קשים להבחין באופן חזותי (איור 1 א).

Discussion

אנו מציגים פרוטוקול ליישום SIVQ-LCM לmicrodissect תאי האפיתל immunostained מרקמת שד אנושי FFPE. השימוש באלגוריתם ניתוח תמונה, כגון SIVQ, מפחית את הכמות של ידיים על הזמן הנדרש לתהליך microdissection. זוהי התקדמות חשובה פוטנציאלי עבור השדה מאז ומפעיל ומאמץ הוא בדרך כלל צעד שער הגבלה לנתיחה המדויק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Positive Charged Glass Slides	Thermo Scientific	4951Plus-001
Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis	Sigma Aldrich	247642	CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous	The Warner-Graham Company	6.505E+12	CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Arcturus CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies	LCM0211
ArcturusXT Laser Microdissection Instrument	Life Technologies	ARCTURUSXT
AutoScanXT Software	Life Technologies		An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.
Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)	University of Michigan		This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]