רקמות המדמים מטוסי פנטום להערכת יישומי דימות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום פוטנציאליים בכירורגיה סרטן השד

Summary

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Abstract

אי דיוקים בלוקליזציה גידול במהלך ניתוח והערכה של תוצאת מעמד שוליים ניתוחית בתוצאה הכי מוצלחת של ניתוח שימור שד (BCS). הדמיה אופטית, בהדמיה מסוימת הקרינה אינפרא אדום קרובה (NIRF), עשויה להפחית את התדירות של שוליים ניתוחיים החיוביים הבאה BCS על ידי מתן המנתח עם כלי ללוקליזציה גידול לפני ותוך ניתוחית בזמן אמת. במחקר הנוכחי, את הפוטנציאל של BCS המודרך-NIRF מוערך באמצעות רוחות רפאים שד מדמה רקמות מסיבות של מטרות תקינה והכשרה.

רוחות רפאים שד עם מאפיינים אופטיים דומים לאלה של רקמת שד נורמלית שמשו כדי לדמות ניתוח שימור שד. תכלילים המכילים ירוק Indocyanine צבע פלואורסצנטי (ICG) הדמיית הגידולים שולבו ברוחות הרפאים במקומות מוגדרים מראש וצלמו עבור לוקליזציה גידול לפני ותוך ניתוחית, כריתת גידול מודרכת-NIRF בזמן אמת, הנחתה-NIRFהערכה על היקף הניתוח, והערכה לאחר ניתוח של שוליים ניתוחיים. מצלמה NIRF מותאמת אישית שימשה אב טיפוס קליני למטרות הדמיה.

רוחות רפאים שד המכילים תכלילים מדמה גידולים להציע כלי פשוט, זול, ותכליתי כדי לדמות ולהעריך את ההדמיה גידול במהלך ניתוח. יש לי רוחות הרפאים דביקות תכונות אלסטיות דומות לרקמה אנושית וניתן לחתוך באמצעות מכשירי ניתוח קונבנציונליים. יתר על כן, רוחות הרפאים מכילים המוגלובין וintralipid לחיקוי קליטה ופיזור של פוטונים, בהתאמה, יצירת תכונות אופטיות אחידות דומות לרקמת שד אנושית. החסרון העיקרי של ההדמיה NIRF הוא עומק החדירה המוגבל של פוטונים כאשר מתפשט דרך רקמות, אשר מעכבת הדמיה (לא פולשנית) של גידולים עמוקים עם אסטרטגיות עלית תאורה.

Introduction

ניתוח שימור שד (BCS) ואחריו הקרנות הוא הטיפול הסטנדרטי בחולי סרטן השד עם T ₁ טריקו ₂ סרטן השד ^1,2. אי דיוקים בהערכה תוך ניתוחית של היקף תוצאת ניתוח בשוליים ניתוחיים חיוביים ב20 עד 40% מהחולים שעברו BCS, דבר המחייב התערבות כירורגית נוספת או ^3,4,5 רדיותרפיה. למרות שכריתה נרחבת של רקמת שד בריאה סמוכה עשויה להפחית את התדירות של שוליים ניתוחיים חיוביים, זה יהיה גם להפריע תוצאות קוסמטיות ולהגדיל את ^6,7 התחלואה הנלווית. טכניקות חדשניות יש צורך, אפוא, כי לספק משוב במהלך ניתוח על מיקומו של הגידול הראשוני והמידה של ניתוח. הדמיה אופטית, הקרינה אינפרא אדום קרובה הדמיה מסוימת (NIRF), עשויה להפחית את התדירות של שוליים ניתוחיים חיוביים הבאים BCS על ידי מתן המנתח עם כלי ללוקליזציה גידול לפני ותוך ניתוחית בrEAL זמן. לאחרונה, הקבוצה שלנו דיווחה על המשפט ב- האנושי הראשון של דימות פלואורסצנטי ממוקד גידול בחולי סרטן שחלות, המראה את ההיתכנות של טכניקה זו כדי לזהות גידולים ראשוניים וגרורות intraperitoneal עם רגישות גבוהה ^8. לפני שאמשיך ללימודים קליניים בחולי סרטן השד, עם זאת, את הכדאיות של יישומים ממוקדי גידול שונים NIRF הדמיה בBCS יכולה כבר להיות מוערכת preclinically באמצעות רוחות רפאים.

פרוטוקול המחקר הבא מתאר את השימוש בהדמית NIRF ברוחות רפאים שד מדמה רקמות המכילות תכלילים מדמה גידולים ניאון ^9. רוחות הרפאים לספק כלי זול ותכליתי כדי לדמות כריתת לוקליזציה גידול לפני ותוך ניתוחית, בזמן אמת מודרך-NIRF גידול, הערכה של מצב השוליים הניתוחי, וזיהוי של מחלה שיורית. יש לי רוחות הרפאים דביקות תכונות אלסטיות דומות לרקמה אנושית וניתן לחתוך באמצעות של קונבנציונלימכשירי urgical. במהלך ההליך הכירורגי המדומה, המנתח מונחה על ידי מידע מישוש (במקרה של תכלילים מוחשיים) ובדיקה ויזואלית של שדה הניתוח. בנוסף, ההדמיה NIRF מיושמת כדי לספק למנתח משוב תוך ניתוחי בזמן אמת על היקף הניתוח.

יודגש כי ההדמיה NIRF דורשת השימוש בצבעי ניאון. באופן אידיאלי, יש להשתמש בצבעים ניאון שפולטים פוטונים בטווח הקרוב אינפרא אדום הרפאים (650-900 ננומטר) כדי למזער את הקליטה ופיזור של פוטונים על ידי מולקולות מבחינה פיזיולוגית בשפע ברקמה (למשל, המוגלובין, שומנים, אלסטין, קולגן, ומים) ^10,11. יתר על כן, autofluorescence (כלומר, פעילות הקרינה הפנימית ברקמות עקב תגובות ביוכימיות בתאים חיים) ממוזער בטווח הספקטרום הקרוב אינפרא אדום, וכתוצאה מכך יחסי גידול ל-רקע אופטימלי ^11. על ידי להטות NIRF צובע לגידולי targemoieties טד (למשל, נוגדנים חד שבטיים), ניתן להשיג אספקה ​​ממוקדת של צבעי ניאון עבור יישומי הדמיה תוך ניתוחיים.

שהעין האנושית אינה רגישה לאור בטווח הספקטרום הקרוב אינפרא אדום, מכשיר מצלמה רגיש מאוד נדרש עבור ההדמיה NIRF. מערכות הדמיה NIRF כמה לשימוש במהלך ניתוח פותחו עד כה ^12. במחקר הנוכחי, השתמשנו מותאם אישית לבנות מערכת ההדמיה NIRF שפותחה עבור יישום במהלך ניתוח בשיתוף פעולה עם האוניברסיטה הטכנית של מינכן. המערכת מאפשרת לרכישה בו זמנית של תמונות בצבע ותמונות הקרינה. כדי לשפר את הדיוק של תמונות הקרינה, ערכת תיקון מיושמת לשינויים בעוצמת אור ברקמות. תיאור מפורט מסופק על ידי Themelis et al. ¹³

Protocol

.1 צור סיליקון תבניות לתכלילים מדמה גידולים

1. איסוף פריטים מוצקים של הצורה הרצויה וגודל שיכול לשמש כמודלים לתכלילים הדמית גידולים, למשל, חרוזים או גולות.
2. לנקות ביסודיות את המודלים של הגידול. כדי להבטיח הסרה קלה מתבנית סיליקון, ניתן לרסס דגמי גידול עם ספריי אנטי מקל או מכוסה בשכבה דקה של וזלין או שעוות דבורים.
3. מניחים כל מודל בכיכר מוקפת חומה תיבה נפרדת דקה (פלסטיק) עם משטח חלק. במידת צורך, לקבע את המודל לחלק התחתון של התיבה כדי לשמור אותו בעמדה. השתמש בתיבה שהיא מעט גדול יותר מהמודל עצמו גידול כדי להימנע מבזבוז כמויות עודפות של סיליקון.
4. יוצקים את הכמות הנדרשת של רכיב סיליקון בקערת ערבוב ומוסיף רכיב סיליקון B ב10: 1 יחס לפי משקל. מערבבים את שני המרכיבים ביסודיות. לחלופין, משאבת ואקום יכול לשמש כדי להסיר בועות אוויר מתערובת סיליקון.
5. בעדינות פוur תערובת סיליקון בקופסא הפלסטיק כדי למנוע השמנה בועות אוויר. תערובת סיליקון צריכה להיות מעובד בתוך 45 דקות כדי להשיג תוצאות אופטימליות.
6. תן לתערובת סיליקון לחזק במשך לפחות 6 שעות לפני חיתוך העובש והסרת דגם הגידול. לחלופין, עובש סיליקון ניתן לחתוך בדפוס זגזג כדי לאפשר לו להשתלב בחזרה ביחד בצורה נקיה. כוח מרבי של סיליקון מתקבל לאחר 3 ימים.

.2 יצירת תמיסת מלח שנאגר טריס

1. ליצור פתרון שנאגר מלוח טריס (TBS) על ידי הוספת 6.1 g (50 מ"מ) טריס ו8.8 g (150 מ"מ) NaCl למים ללא יונים 800 מ"ל.
2. הוספת 1.0 g (15 mmol) של נאן ₃ לחסום חמצון של המוגלובין (שלב 3.3 ו4.4) ולעכב התפתחות חיידקים. זהירות: NaN ₃ הוא רעל חמור. זה עלול להיות קטלני במגע עם עור או במקרה של בליעה. הרעילות של המתחם הזה היא דומה לזו של ציאנידים אלקלי מסיסים והמנה הקטלנית לאדם בוגרהוא על 0.7 גרם. תמיד פעל לפי הוראות הבטיחות כפי שנקבע על ידי היצרן.
3. התאם את רמת החומציות ל7.4 ולהביא את נפח 1,000 מ"ל עם מים ללא יונים.

.3 יצירת תכלילים פלורסנט

1. הוסף 2 agarose גרם ל50 TBS מ"ל מהצעד .2 נקודת ההתכה גבוהה יותר של agarose בהשוואה לג'לטין (שלב 4.2) ימנע תכלילים מהמסה ודולפים צבע פלואורסצנטי כאשר הניח ג'לטין המומס. לחלופין, הסכום של agarose הוסיף ניתן לשנות ל1 גרם או 3 כדי לקבל תכלילים גידול רכים יותר או מוחשיים, בהתאמה.
2. מחממים את תערובת agarose באמצעות מיקרוגל עד שתגיע לנקודת הרתיחה. מערבבים היטב עד agarose נמס לגמרי.
3. הוספת 1.1 גרם המוגלובין (17 μmol) ו5 מ"ל 20% intralipid מומסים ב50 מ"ל של TBS לתערובת agarose תחת בחישה מתמדת להידמות המאפיינים האופטיים של הרקמה הסובבת פנטום שד (שלב 4).
4. הוספת 20.0 מ"ג (25.8 Μmol) של צבע Indocyanine הניאון הירוק ל83.8 מ"ל מים deionized. ודא הצבע נמס לגמרי.
5. Pipet 5.0 מ"ל מפתרון זה ולהוסיף אותו לתערובת agarose להשיג ריכוז סופי של 14 מיקרומטר. לחלופין, צבעי ניאון אחרים מאשר ICG יכולים לשמש אם רצויים עם הריכוז האופטימלי שלהם.
6. בעדינות למלא את תבניות סיליקון יצרו בשלב 1 עם תערובת agarose החמה באמצעות מזרק (איור 1 א). חזור על תהליך זה עד שכל התבניות מלאות.
7. בואו תכלילים הניאון לחזק ב RT במשך כשעה. הגן על תכלילים מאור על ידי כיסוי כל התבנית ברדיד אלומיניום.
8. לאחר התמצקות, בעדינות לפתוח את העובש ולחץ את ההכללה (איור 1). לחלופין, השתמש בקצה של המזרק כדי להחיל טיפות קטנות של תערובת agarose נמסה על פני השטח של ההכללה. על ידי חזרה על תהליך זה כמה פעמים באותו המיקום, tu הקטןניתן ליצור דורבנות מור כדי לדמות גידולי infiltrative.
9. הגן על תכלילים agarose מהאור והתייבשות על ידי עטיפתם בנייר אלומיניום ולאחסן אותם במכל אחסון humidified על 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: השימוש בריכוזי צבע פלואורסצנטי נמוכים יותר או גבוהים יותר מאופטימלי הריכוז הידוע יהיה גם התוצאה בעוצמת אות ניאון פחתה. ההפחתה לכאורה בניגוד לאינטואיציה בעוצמת אות עם עלייה בריכוזי צבע מעל ריכוז צבע פלואורסצנטי האופטימלי בשל תופעה הידועה במרווה. בעת ההערכה החדירה לעומק המקסימאלי של צבע פלואורסצנטי ברוחות רפאים, באמצעות הריכוז האופטימלי הוא חובה.

.4 צור פנטומים שד

1. להשיג עובש בצורת כוס כדי ליצור רוחות רפאים שד בגודל הרצוי והנפח, למשל, קערת זכוכית או פלסטיק. העובש צריך משטח חלק כדי למנוע צורת ג'לטין דבקות בעובש. Volum עובשדואר של 500 מ"ל ייצור רוחות רפאים שד בגודל מספיק.
2. כדי ליצור פנטום שד עם נפח של 500 מ"ל, להוסיף 50 גרם של פריחת 250 ג'לטין 500 TBS מ"ל (שלב 2). מחממים את תערובת הג'לטין ל50 מעלות צלזיוס מתחת ערבוב מתמיד.
3. ברגע שאת הג'לטין נמס לגמרי, לתת לתערובת הג'לטין להתקרר בהדרגה ולתחזק אותו בטמפרטורה קבועה של 35 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים חם.
4. תחת בחישה מתמדת, להוסיף 5.5 גרם המוגלובין (85 mmol) שור ו25 מ"ל 20% intralipid כדי לדמות קליטה ופיזור של פוטונים ברקמה, בהתאמה.
5. Prechill העובש בצורת הכוס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. , הבא לשפוך את תערובת הג'לטין בעובש לרמה שמתאימה לעומק המוגדר מראש של הכללת מדמה הגידולים agarose (איור 1 ג). תן לתערובת הג'לטין לחזק על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשעה אחת.
6. לאחר התמצקות, למקם הכללת agarose ניאון המדמה גידולים על פני השטח של הפנטום ואופן זמני לקבע הכללה עם מחט קטנה. עד למקסימום של שלושה תכלילים ניאון המדמה גידולים יכול להיות משולב בפנטום שד אחד. מספיק מקום (5 ס"מ לפחות) צריך להיות כל הזמן בין תכלילים פרט לדמות גידולים (1D איור).
7. יוצקים את שארית תערובת הג'לטין החמה שבנותר עובש הנפח, המאפשר לדבקות של שני השכבות מבלי ליצור חפצים שבירה. סמן את המיקום של תכלילים הדמית גידולים ניאון על התבנית. בואו הפנטום לחזק O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
8. ברגע שהקרושה, להסיר את המחטים המשמשות לקיבוע זמני של תכלילים ובעדינות להסיר את פנטום השד מעובשה (איור 1E). הגן על פנטום השד מהאור והתייבשות על ידי עטיפתו בנייר אלומיניום ולאחסן אותו במכל אחסון humidified על 4 מעלות צלזיוס.

יור 1 "FO: תוכן width =" "src =" 5in / קבצים / ftp_upload / 51,776 / "width =" 51776fig1highres.jpg 500 "/>
איור 1 צעדי סדרתית של יצירת רוחות רפאים שד המכילים תכלילים מדמה גידולים ניאון. לאחר יצירת תבניות סיליקון של הצורה וגודל הרצויים, את התבניות מלאות בתערובת agarose מותכת באמצעות מזרק (). תכלילים מדמה גידולים של שונה גודל וצורה יוצרו במחקר הנוכחי (B). בשלב בא, בשכבה דקה של תערובת הג'לטין נמסה היא שפך במותאם אישית עובש מצופה שד עץ (C). לאחר התמצקות, תכלילים מדמה הגידולים ממוקמים, מקובעים באופן זמני, ומכוסים בשכבה נוספת של תערובת נמסה ג'לטין (ד '). לאחר התמצקות, פנטום השד מוסר בעדינות מהתבנית שלו (E). הפנטום אז יכול להיות מיושם ליישומי הדמיה שונים NIRF הדמיה (F).נ"צ = "קבצים / ftp_upload / 51,776 / / 51776fig1highres.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

.5 הגדר את מערכת המצלמה NIRF

1. מערכת מצלמה NIRF ליישום תוך ניתוחי נדרשת להדמיית ההדמיה NIRF ממוקדת בניתוח סרטן השד. מערכות הדמיה NIRF כמה להדמיה תוך ניתוחי NIRF בזמן אמת כרגע זמינות לשימוש מחקרי. למרות שחלק מהבדלים בין התקנים אלה קיימים, כל שהם מכילים מקור אור העירור (לעירור של תכלילים גידול ניאון) ומכשיר הדמיה רגיש מאוד לגילוי של פוטונים נפלטים.
2. הקפד להשתמש במקור אור העירור של אורך גל מספיק. עבור תכלילים הדמית גידולים המכילים ICG, להשתמש במקור אור עירור (למשל, לייזר) שפולט פוטונים בין 750 ו800 ננומטר. אם נעשה שימוש בצבע פלואורסצנטי חלופי, גל העירור צריך להיות מותאם להתאים ma ההוראות של nufacturer.
3. במקרה מערכת המצלמה NIRF מכילה מסנן פליטה לסנן אותות רקע לא רצויים, לוודא כי המסנן הנכון ב. עבור תכלילים הדמית גידולים המכילים ICG, להשתמש במסנן פליטה בין 800 ו850 ננומטר. צבעי ניאון אלטרנטיביים עשויים לדרוש מסנני פליטה שונים, בהתאם להוראות היצרנים.
   הערה: ודא שיש אפס חפיפה בין העירור ואורכי גל הפליטה כדי למנוע תמונות oversaturated. בנוסף, זמן רכישת תמונה ייתכן שיצטרך להיות מותאם כדי להשיג תמונות ניאון אופטימליות. במקרה של תכלילים ניאון עמוקים או אותות ניאון חלשים, זמן רכישת תמונה ניתן להגדיל עד כמה שניות לדקות. במקרה של תכלילים שטחיים או אותות ניאון חזקים, זמן רכישה יכול להיות ירידה לכמה אלפית שניים כדי לאפשר לדימות פלואורסצנטי וידאו שער בזמן אמת.

דואר "> 6. סימולציה של יישומי NIRF הדמיה בכירורגיה סרטן השד

1. קח את פנטום השד מדמה רקמות מיכל שלו ומניח אותו על משטח שטוח nonfluorescent. בשלב הבא, תציב את מכשיר ההדמיה NIRF מעל פנטום השד, והשאיר מרחק עבודה מספיק לכריתה של תכלילים מדמה גידולים.
2. למקם את הכללת ניאון המדמה גידולים באמצעות הדמיה ו / או מישוש של שד פנטום NIRF. במקרה ניתן לאתר שום אות ניאון, ההכללה ממוקמת גם עמוקה מדי בפנטום לגילוי או זמן רכישת תמונה צריך להיות מוגבר.
3. ברגע שההכללה היא מקומית, לחתוך את שד הפנטום ולהסיר את הכללת הדמיית גידולים תחת בזמן אמת NIRF-הדרכה באמצעות מכשירי ניתוח קונבנציונליים. לחלופין, ההכללה ניתן נכרת מודרכת אך ורק על ידי בדיקה ומישוש של פנטום השד חזותי כדי לדמות את רמת הטיפול.
4. מייד לאחר ההסרהשל הכללת מדמה גידולים, תמונת החלל כירורגית לכל פעילות ניאון שנותרה מצביעה על כריתה בלתי מספקת.
5. במקרה של כל פעילות ניאון שנותרה, יחתוך את שריד ההכללה תחת הדרכת NIRF הישירה עד אין אות ניאון נשארה.
6. תמונה שברי הפנטום נכרתו כדי לדמות הערכת מצב שוליים מקרוסקופית מודרכת-NIRF. לעתירה, פורסת את רקמת הפנטום ב3 - 5 לוחות מ"מ ותמונת הלוחות בהתאם. אות הקרינה להגיע לשולים הניתוחיים מלמדת על קיומו של שוליים ניתוחיים חיוביים.

תוצאות

תוצאות ממחקר זה כבר דיווח בעבר במקום אחר ^9.

הנתונים שלנו מראים כי ההדמיה NIRF ניתן ליישם כדי לזהות תכלילים מדמה גידולים ניאון ברוחות רפאים שד מדמה רקמות, המדמה ניתוח שימור שד מודרך-NIRF בחולות סרטן השד. שימוש במודל הפנטום שלנו נמ...

Discussion

אנחנו מדומים יישומים קליניים פוטנציאליים של BCS המודרך-NIRF באמצעות רוחות רפאים בצורת שד עם תכלילים מדמה גידולים משולבים. לוקליזציה תוך ניתוחית של גידול, כריתת גידול מודרכת-NIRF, הערכה על היקף הניתוח, וההערכה לאחר ניתוח של שוליים ניתוחיים היו כל מצאו אפשריים באמצעות מערכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine hemoglobin	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	H2500	Simulates absorption of photons in tissue
Intralipid 20%	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	I141	Simulates scattering of photons in tissue
Silicone A translucent 40 (2-components poly-addition silicone)	NedForm, Geleen, The Netherlands		Package consists of components A and B, that should be mixed one on one (A:B=10:1).  Link to manufacturers page: http://tinyurl.com/ncjq7jx
Gelatine 250 Bloom	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	48724	Construction of breast-shaped phantoms
Agarose	Hispanagar, Burgos, Spain		Construction of tumor-simulating inclusions
Tris	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	T1503
HCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	258148
NaCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	S9888
NaN3	Merck, Darmstadt, Germany	822335	CAUTION: severe poison. The toxicity of this compound is comparable to that of soluble alkali cyanides and the lethal dose for an adult human is about 0.7 grams.
Examples of NIRF imaging devices for intraoperative application:
T2 NIRF imaging platform	SurgVision BV, Heerenveen, The Netherlands		Customized NIRF imaging system used in the current study. More details available at www.surgvision.com
Photodynamic Eye	Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH, Herrsching am Ammersee, Germany	PC6100	www.iht-ltd.com
FLARE imaging system kit	The FLARE Foundation Inc, Wayland, MA, USA		www.theflarefoundation.org
Fluobeam	Fluoptics, Grenoble, France		www.fluoptics.com
Artemis handheld camera	Quest Medical Imaging BV, Middenmeer, the Netherlands		www.quest-mi.com
Examples of NIRF fluorescent dyes for intraoperative application:
Indocyanine green	ICG-PULSION,  Feldkirchen, Germany	PICG0025DE	Clinical grade fluorescent dye for NIRF imaging used in the current study. More details available at www.pulsion.com
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA	929-70021	www.licor.com