הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

Summary

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

Abstract

צמיחת סרטן שד ניתן ללמוד בעכברים באמצעות שפע של דגמים. מניפולציה גנטית של תאי סרטן שד עשויה לספק תובנות הפונקציות של חלבונים מעורבים בהתקדמות או בעזרה שבעור לגלות מדכאי גידול חדשים. בנוסף, הזרקת תאי סרטן לעכברים עם גנוטיפים שונים עשויה לספק הבנה טובה יותר של חשיבותו של תא סטרומה. דגמים רבים עשויים להיות שימושיים כדי לחקור היבטים מסוימים של התקדמות מחלה אך לא לשחזר את התהליך הסרטני השלם. בניגוד לכך, תאי סרטן השד engraftment לכרית שומן החלב של עכברים טובים יותר מסכמת את המיקום של המחלה ונוכחות של תא סטרומה הנכון ומחקה לכן טוב יותר למחלות סרטניות אנושיות. במאמר זה, אנו מתארים כיצד להשתיל תאי סרטן השד בעכברי orthotopically ולהסביר כיצד לאסוף רקמות לנתח: -14 פיקסלים; קו-גובה:. 28px; "> סביבת גידול וגרורה לאיברים מרוחקים שימוש במודל זה, היבטים רבים (צמיחה, אנגיוגנזה, וגרורות) של הסרטן יכולים להיחקר פשוט על ידי מתן סביבה נאותה לתאים סרטניים לגדול.

Introduction

הסרטן הוא מחלה מורכבת מאוד שהייתה הנתונה ללימודים במשך מאות שנים. סרטן השד הוא סוג הסרטן הנפוץ ביותר; היא מתרחשת בעיקר אצל נשים, אך עשויים להתרחש גם באופן ספורדי בזכרים ^27. המחלה בעיקר נגרמת על ידי האובדן של חלוקת תא שלטון מנגנון בקרה אשר בתורו מוביל לצמיחה אינסופית של תאים בגוף. יכולות להיגרם תקלות אלה על ידי מספר מנגנונים: ראשון, תאים בריאים צריכים אותות צמיחה מהתאים המקיפים על מנת להתרבות ואילו תאים סרטניים לעשות גורמי הגדילה שלהם ולהגדיל את הביטוי של קולטנים גורם גדילה וכך להשיג שיעור גבוה יותר שגשוג ^1; שני, תאי הסרטן הם פחות רגישים לאותות אנטי-שגשוג ^8; שלישי, כדי לאזן את המספר הסלולרי במוות של תאי גוף גם נדרש; עם זאת, תאים סרטניים להימלט ממוות מתוכנת של תאים, המכונים אפופטוזיס ^14; רביעי, תאים לדבוק מטריצות תאיעל מנת לשרוד, אך תאים סרטניים יכולים לגדול ללא הצורך בהתקשרות ולהראות התנגדות לanoikis ^19; חמישי, הפעלה של הטלומרז עוקפת את ההתקצרות הטלומרים ומונעת הזדקנות replicative ^21; ואחרון אחרון חביב, דילוג של בקרת איכות DNA בעקבות תוצאות מיטוזה בתוכן גנטי שינה ^15,16. על מנת לזהות אונקוגנים או מדכאי גידול שמשחקים תפקיד בהתפשטות הבלתי מווסתת זה, ניסויי צמיחת גידולים בעכברים הם קריטיים.

צמיחת גידול ראשונית היא בדרך כלל לא הסיבה העיקרית למוות. הגירה של תאים סרטניים מהאתר הראשי לאתר המשני, המכונה גרורות, הוא הגורם המוביל למוות ברוב חולי סרטן ^22. גרורות הכרוכות פלישת תאים סרטנית, intravasation, נסיעה דרך מחזור הדם, הימנעות התקפה חיסונית, extravasation וצמיחה באתר המשני. אפיתל מעבר mesenchymal (EMT) הוא תהליך מפתח בגרורות וכרוכות מתג בפרופילי ביטוי גני מניב תאים עם תנועתיות והפולשנות גבוהות יותר, שהם דרישות קדם לתא הגרורות ^12. ככל שהתהליך הסרטני היא התוצאה של שילוב של פעולות שונות, כוללים אינטראקציות הדדיות בין תאים סרטניים, תאי סטרומה ותאים פרו ואנטי דלקתיים, גישה במבחנה לסרטן לעתים קרובות אינה מספקת הבנה מלאה של התהליך הסרטני. בדומה לכך, לעתים קרובות יכולים להיות לא למדו טיפולים נגד הסרטן משפיעים על כלי הדם של גידול במבחנה, ובכך השימוש בin vivo הגישות הוא בלתי נמנע.

ללמוד התקדמות סרטן השד, שיטות ניסיוניות שונות פותחו. המודל הנפוץ ביותר הוא ההזרקה תת עורית של תאי סרטן השד בעכברים ^5. בהגדרת ניסוי זה, החוקר יכול להציג מגוון רחב של שינויים בקו תא של בחירה במבחנה (כלומרupregulation, downregulation של חלבונים) ולהזריק את התאים מתחת לעור. למרות ששיטה זו היא פשוטה ותהליך ההזרקה הוא פשוט ללא כל צורך בביצוע ניתוח בעכברים, האתר שבו הגידול מוזרק אינו מייצג את הסביבה המקומית החלב גידול והיעדר הסביבה זו עלולה לגרום להתפתחות סרטן שד ש שונה מזה שנצפה בהפתולוגיה אנושית. שנית, עכברים מהונדסים גנטי נמצאים בשימוש לעתים קרובות ככלי in vivo ללמוד התקדמות סרטן השד. במודל זה, ביטוי אונקוגן (כלומר PyMT, Neu) הוא מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפי החלב מוביל להיווצרות של של גידול בשד ספונטני. התקנה ניסיונית זו שימושית כדי ללמוד את היבט טיפול במחלה על ידי הזרקת סמים או נוגדנים בעת בדיקת גודל גידול בזמן ^3. עם זאת, גידול עכברים אלה עם זני עכבר אחרים חסרים או מוטציה בגן של עניין גם יכול לתת תוספותights לתוך התפקיד של חלבונים שונים בצמיחה של גידולי סרטן שד ^24. החסרון של המודל הזה הוא שהוא נוטה וריאציה בגודל הגידול ומספר. יתר על כן, את רמת ביטוי transgene תלויה באתר האינטגרציה בגנום ויכולה להשתנות מזן עכבר אחד לעוד ^4. במודל זה, הביטוי של transgene יכול להיות מושגת על ידי כל התאים אפיתל עם מקור ואילו במחלות של בני אדם, רק תת-אוכלוסייה של תאים לבטא אונקוגן או downregulate הרמות המדכאים גידול ^26. ללמוד גרורות, תאי סרטן השד יכולים גם להיות מוזרקים לוריד (מודל מכונה גרורות ניסיוני) ^25. עם זאת, גישה זו משחזרת רק את התהליך גרורתי באופן חלקי; עוקף את הדרישה לתאים סרטניים לפלוש וintravasate, ומתחיל מהנקודה שבה תאי גידול הם בקלות הווה במחזור הדם.

בעבודה שלנו, אנו משתמשים להזריק orthotopicמודל היון ללמוד את מעורבותם של הגנים של עניין בהתקדמות סרטן השד ^13. אנו ביטוי היתר של החלבון בתאי סרטן השד אנושיים ולהזריק אותם לתוך כרית שומן החלב של NOD גמא SCID עכברים / (NSG). שיטה זו יש יתרון בדרכים רבות: היא מאפשרת שינויים גנטיים מהירים מאוד ומגוונים בשורת התאים המוזרקת, הוא מכסה את כל התהליך של התקדמות סרטן השד מצמיחת גידול ראשונית לגרורות באתרים רלוונטיים באופן פתולוגי, והוא גם מספק מודל ניסיוני טוב לבוחן את ההשפעה של טיפולים טיפוליים במחלה מוקדם או מאוחר שלבים. בנוסף, משתמש באחד מודל זה יכול לחקור את התפקיד של סטרומה לעומת חלבונים המופקים מתאים סרטניים בהתקדמות מחלה באמצעות עכברים או תאים מהונדסים גנטי. למרות זריקות תת עורית קלות יותר לביצוע, דגמי orthotopic להצמיח אוכלוסיית תאי הסרטן יותר tumorigenic וגרורתי יותר. לפיכך, תוצאות שהושגו באמצעות ההזרקה תת עוריתים יכול להיות גם שגוי שלילי או חיובי שגוי ^6,17 עידוד השימוש במודלי orthotopic ללמוד את צמיחת הגידול.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC).

1. הכנת תאים, מכשירים ועכברים

1. יום לפני המבצע, לגלח את NOD גמא SCID העכברים / (NSG) מהפטמה הרביעית לקו האמצע ולשקול את העכברים כדי לוודא שיש את כל העכברים משקולות שווים בקירוב.
2. החיטוי מספריים, שתי פינצטה ושני מלקחיים ישר יתוש (איור 1 א).
3. ביום הפעולה, לשטוף את אדנוקרצינומה השד האנושית (מד"א MB-231) תאים שניתן להזריק פעם אחת עם ופר פוספט (PBS), pH 7.4 וtrypsinize התאים. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר תקשורת DMEM סרום המכיל בחלק העליון של התאים. צנטריפוגה התאים ב1,200 סל"ד 7 דקות ב RT להסיר סרום על ידי resuspending התאים או בPBS או באמצעי תקשורת ללא סרום. צנטריפוגה אותם שוב כדי להסיר עקבות של סרום לחלוטין. Resuspend תאי PBS אותקשורת.
4. ספירת התאים עם hemocytometer ולחשב את כמות התאים. השתמש 500,000 תאים / עכבר בלא יותר מ -150 μl. אופציונאלי לPBS או תקשורת, resuspend תאי matrigel.
   הערה: קבע את כמות התאים בהתאם לסוג התא בשימוש.
5. מקום תאים בצינורות microcentrifuge סטרילי ולשמור אותם על קרח.
6. מלא את אחד 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי עם 35 מיליליטר של pH 7.4 PBS וצינור נוסף 50 מ"ל חרוטי צנטריפוגות עם אתנול 70%. משרים צמר גפן לתוך צינור אחד.

2. הזרקה Orthotopic

1. לבצע את הניתוח בשכונת סטרילי כדי לשמור על אווירה סטרילית. להרדים את העכבר על ידי תת עורי הזרקת תערובת Xylazin / קטמין במינון של 10 מ"ג / קילוגרם, 100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף בהתאמה. תקן את העכבר על כרית חימום. לאשר את ההצלחה של הרדמה על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן.
   הערה: אם אחד הוא לא מכיר היטב את ההליכים כירורגיים, ניתוח עשוי להימשך זמן רב יותר. לארגןההרדמה במינון בהתאם.
2. החל משחה עיניים על העיניים של עכברים, כדי למנוע את העיניים מהתייבשות.
3. נקה את האזור המגולח באמצעות מקלון צמר גפן טבול אתנול מוכן בשלב 1.6. לסירוגין סקראבס באמצעות בטאדין ואלכוהול שלוש פעמים בצורה מעגלית מסתובבת ממקום החתך המתוכנן צריכה להתבצע. לחלופין, להשתמש ionophore כחומר חיטוי.
4. לעשות חתך קטן בין הפטמה הרביעית וקו האמצע עם מספריים ולעשות כיס על ידי החדרה מקלון צמר גפן טבולה בpH 7.4 PBS.
5. השתמש בפינצטה כדי לחשוף את כרית שומן החלב. שים לב לכרית השומן על ידי הצבע הלבן שלה.
6. לסחוט את כרית השומן עם פינצטה האחרות מבסיסו; בדרך זו, לחשוף באופן מלא את כרית השומן (איור 1) כדי לבצע זריקות בקלות.
7. Homogenize תערובת התא על ידי pipetting למעלה ולמטה. לשאוב בעדינות 50 μl של השעיה תא לתוך מזרק אינסולין להזריק לכרית שומן החלב על ידי החזקת המחט אופקית. לאשר זריקה מוצלחת על ידי בדיקה לנפיחות של כרית השומן.
8. שחרר את כרית השומן בעדינות.
9. תפר את החתך באמצעות נהג מחט. הפוך שלושה זורק על ידי סיבוב התפר סביב נהג המחט בכיוון השעון, נגד כיוון השעון וכיוון השעון. יש להשתמש בשני קשרים לתפר.
   הערה: ודא שהקשרים הדוקים אחרת עכברים יכולים לפתוח את התפרים.
10. לאחר ניתוח, להזריק משכך כאבים, כגון temgesic ב0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, מתחת לעור כדי להקל על הכאב.
11. אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם מרוויחים את ההכרה ולשמור על recumbence sternal. מניחים את כל החיות לכלובים שונים עד שהם התאוששו באופן מלא.
12. כדי לשמור על סטריליות, להשתמש כלובים ומים autoclaved. לשנות את הכלובים כל שלושה ימים כדי לשמור על האווירה נקייה.

3. קצירת איברים לניתוח

1. ביום של קציר, 8 שבועות לאחר ההשתלה של התאים, למלא צינורות צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר עם 3 מיליליטר הפתרון של Bouin לכל עכבר. בנוסף, משתמש בשני 15 מיליליטר צינורות מלאים ב5 מיליליטר פתרון פורמלין לכל עכבר.
2. להרדים את בעלי החיים על ידי הזרקת Xylazin / קטמין, במינון של 10 מ"ג / קילוגרם 100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף מתחת לעור. חכה עד שהחיה מאבדת את רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן.
3. תקן את החיה עם מחטים על בסיס. ביצוע חתך ארוך, אנכי קו האמצע עם מספריים. לעשות שני חתכים אופקיים ממש מתחת לרגל הקדמית ומעל הרגל האחורית. לחשוף את הגידול על ידי מצמיד העור לבסיס. למדוד באמצעות קליפר נפח הגידול.
4. לנתק את הגידול מהעור באמצעות מספריים. Snap להקפיא חלק מהגידול בחנקן נוזלי לבידוד RNA. מניחים את החלק השני, לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי מלאים בפורמלין לבצע אימונוהיסטוכימיה הבאה הטבעת פרפין.
5. מוציאים בעדינות את הריאות. הנח אתעזב את הריאות לפתרון של Bouin. שמור את הריאות בפתרון במשך 3 ימים. שימו לב מוקדים גרורתי שטחיים באופן ברור לעין בלתי מזוינת. לחלופין, למקם את הריאה הימנית לתוך פורמלין כדי לוודא micrometastasis באמצעות haematoxylin וeosin מכתים (H & E).
   הערה: למרות ש, גרורות ריאות נצפו לעתים קרובות בסרטן השד, אפשר גם רוצה לאסוף עצם, כבד, מוח וטחול לנתח גרורות. התאים באזור גרורתי הם צפופים יותר ושונים מורפולוגית ולכן ניתן להבחין בקלות מרקמת ריאה.
6. יום לאחר קציר, לשאוב את פתרון פורמלין מ -15 מיליליטר צינורות ולהחליף עם 70% אתנול. להטביע רקמות פרפין ולבצע מחקרי אימונוהיסטוכימיה.
7. לבדיקת דם, לפתוח את חלל החזה עם מספריים. למשוך 450 דם μl באמצעות לנקב לב. מניחים דגימת דם בצינור microcentrifuge המכיל 50 μl של 3.2% נתרן ציטרט. אחרי הדם נאסף, לסובב אותו XG ב 2000 עבור 10 מייליםn. אחסן את דגימות הפלזמה ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
   הערה: קיימות מספר טכניקות איסוף דם אחרות נפוצה בתרגול ²⁰ והטכניקה שצריכה להיות בשימוש תלויה בהגדרת ניסוי ובחירתו של המדען. אם דגימת דם אינה נדרשת, להרדימו על פי הפרוטוקול של בעלי החיים או על פי הנחיות המוסד.

תוצאות

יישום מוצלח של "מודל סרטן שד orthotopic" מבוסס על הזרקה נכונה של תאים לתוך כרית שומן החלב. שגיאות ניסיוניות כגון חיסון מדויק של תאים או דליפה עלולות לגרום לשינויים בגודל גידול או אפילו העדר גידול שמוביל להיווצרות של מבנה מחפשים דומה לכרית שומן החלב מוזרקת עם חיץ שליט?...

Discussion

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד היא מודל רב עוצמה כדי לחקור את כל ההיבטים של צמיחת הסרטן. השתלה של תאים אלה בכרית שומן החלב של העכברים צריכה להתבצע בזהירות על מנת למנוע שינוי בצמיחת גידול. והכי חשוב, הזרקה את אותה הכמות של תאים לכל עכבר היא קריטית. לשם כך, יש trypsinize התאים בקפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9