עכברוש Heterotopic בטן לב / השתלת ריאה בודדת בתצורה טעונה נפח

Summary

We describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The transplant configuration results in a partially loaded graft circulation, allowing direct functional assessment. This model may be employed for acute or chronic studies of function and immunologic status of the transplanted graft.

Abstract

Herein, we describe a novel technique for heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) in rats. The configuration of the transplant graft involves anastomosis of donor inferior vena cava (IVC) to recipient IVC, and donor ascending aorta (Ao) to recipient abdominal Ao. The right upper and middle lung lobes are preserved and function as conduits for blood flow from right heart to left heart.

There are several advantages to using this technique, and it lends itself to a broad range of applications. Because the graft is transplanted in a configuration that allows for dyamic volume-loading, cardiac function may be directly assessed in vivo. The use of pressure-volume conductance catheters permits characterization of load-dependent and load-independent hemodynamic parameters. The graft may be converted to a loaded configuration by applying a clamp to the recipient’s infra-hepatic IVC. We describe modified surgical techniques for both donor and recipient operations, and an ideal myocardial protection strategy. Depending on the experimental aim, this model may be adapted for use in both acute and chronic studies of graft function, immunologic status, and variable ventricular loading conditions. The conducting airways to the transplanted lung are preserved, and allow for acute lung re-ventilation. This facilitates analysis of the effects of the mixed venous and arterial blood providing coronary perfusion to the graft.

A limitation of this model is its technical complexity. There is a significant learning curve for new operators, who should ideally be mentored in the technique. A surgical training background is advantageous for those wishing to apply this model. Despite its complexity, we aim to present the model in a clear and easily applicable format. Because of the physiologic similarity of this model to orthotopic transplantation, and its broad range of study applications, the effort invested in learning the technique is likely to be worthwhile.

Introduction

The first rodent model of heterotopic abdominal heart transplantation (HAHT) was described by Abbott and colleagues in 1964¹. This technique, and subsequent modifications have been widely applied to characterize transplant graft function and immunologic status. The majority of HAHT techniques described involve a non-volume loaded heart^2,3. Models of HAHT involving volume-loaded ventricles have been described, but they are frequently limited in one or more respects.

Heterotopic abdominal heart-lung transplantation (HAHLT) with a volume-loaded left ventricle (LV) has been described previously. Chen and colleagues⁴, and subsequently Ibrahim and colleagues⁵ described HAHLT with a single aorto-aortic (donor ascending to recipient abdominal aorta) anastomosis. The only volume load presented to the ventricle in this circulation is the coronary venous return. Asfour and colleagues described a HAHT technique in which the lung circuit was eliminated by anastomosing donor pulmonary artery (PA) to donor left atrium (LA)⁶. In this circulation, venous inflow to right ventricle (RV) occurs via a donor SVC to recipient IVC anastomosis, and the subsequent LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function was partially assessed in vivo, and also in vitro using a Langendorff rig. Figueiredo and colleagues described a HAHLT model similar to our own⁷, but in mice. Venous inflow to the RV occurs via donor SVC to recipient IVC anastomosis. Blood subsequently passes through the single lung circulation and LV load is ejected into the aorto-aortic anastomosis. Cardiac function in their study was assessed by magnetic resonance imaging (MRI). Wen and colleagues described a unique HAHT technique in which the LV is loaded by means of a recipient aorta to donor LA anastomosis⁸. The LV, therefore, fills at systemic pressures. Cardiac function, and whether LV stroke volume is ejected antegradely in their model was not assessed.

Many of the techniques referenced above involve non-physiologic LV loading conditions, including the techniques whose partial LV load is represented only by coronary venous return. On the other hand, many techniques do approach physiologic LV loading. The majority of these techniques, as with the technique of Asfour and colleagues, omit the pulmonary circulation and utilize a donor PA to donor LA anastomosis^6,9. The circulation described by Galinanes and colleagues¹⁰ employs a direct recipient cava to donor LA anastomosis, omitting the pulmonary circulation and the right heart. Yokoyama and colleagues achieve the same effect by ligating the donor PA and creating an interatrial communication in the donor heart (omitting donor lung and right heart circulations)¹¹. The circulation of Maruyama and colleagues¹² involves an anastomosis between donor left PA and recipient Ao, which permits LV filling via the pulmonary circulation as a conduit, but effectively excludes the right heart.

In cases where near physiologic loading conditions were met, we advance the technique of HAHLT in 2 major respects. First, to our knowledge, the exact configuration we report has not been described in rats. It is possibly the most versatile circulation for investigators wishing to study the physiology, structure, and immunology of the transplanted heart-lung graft. Second, we describe how the function of the transplant graft can be directly characterized in vivo. For this application, pressure-volume conductance catheters can be introduced directly into the LV apex of the transplant graft, which allows for complete cardiac functional characterization.

The technique described here can be applied to both acute and chronic studies of transplant graft function, while the functional assessment may be performed either in vivo or in vitro. We present a model in which the loading conditions can be near physiologic, however the degree of ventricular loading may be manipulated both acutely and chronically by diverting venous return towards or away from the graft. Afterload conditions can also be manipulated. Because the lung and its airway are retained in this transplant configuration, investigators can re-ventilate the donor lung acutely. Uniquely, lung re-ventilation changes the composition of blood perfusing the transplant coronary arteries. Under non-ventilated conditions, blood ejected from the donor aorta is deoxygenated, and mixes with oxygenated blood in the recipient aorta. Under acutely ventilated conditions, ejected blood becomes oxygenated. Thus, transplant graft function can be compared under ventilated and non-ventilated conditions, and also under variably loaded conditions.

The protocol below describes important modifications to previously described HAHLT donor and recipient operations. It also describes an optimal technique for protecting the transplant graft throughout the period of ischemia (time between donor explant and recipient implant). Advantages of this technique include physiologic conditions potentially approaching that of an orthotopically transplanted graft, and a wide range of investigative applications. An important limitation is its technical complexity. With adequate mentoring and practice, the advantages of this technique will likely outweigh the challenges in adopting it.

Protocol

כל בעלי החיים שוכנו וטיפלו בהתאם הלאומי והנחיות מוסדיים לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. אישור אתיקה לפרוטוקול זה הוענק על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת הטיפול בבעלי חיים של קולומביה הבריטית. , חולדות זכרי Sprague-Dawley משקל בין 300-450 גר שמשו לפרוטוקול זה.

מבצע 1. התורם

1. יש כ 100 מיליליטר של cardioplegia (RT) בבקבוק גלילי מחובר ל( IV) צינורות צנתר לוריד ארוכים על ידי ברזלים 3-דרך. השתמש עמדה לרומם את הבקבוק לכ 80 סנטימטרים מעל פני השטח האופרטיביים, המאפשר משלוח cardioplegia על ידי כוח הכבידה.
2. כדי להמחיש את המבנים כראוי, להשתמש גם זוג loupes כירורגית או מיקרוסקופ לנתח.
   הערה: בשלב זה אנו משתמשים במיקרוסקופ הפעלה משקפת 3.4 - הגדלת 21.3X.
3. מניחים את התורם בתא הרדמה ולגרום להרדמה עם 4 - 5% isoflurane.
4. העבר את העכבר לפלטפורמת הפעלה ולשמור על הרדמה על ידי האף-קונוס עם 1 - 2% isoflurane. החל משחה וטרינר לעיניו של בעל החיים למניעת יובש. לנהל midazolam (2 מ"ג / קילוגרם) תוך peritoneally עם מחט 25 G.
5. באמצעות קוצץ כירורגית, לגלח את התורם מxiphisternum ללסת תחתונה. לגלח אזור קטן של המפשעה השמאלית (לגישה הרביעית שלאחר מכן). החל סוכן depilating למשטחים האופרטיביים, לחכות כ 5 דקות, ולהסיר את השיער עם פיסת הגזה.
6. הכן את האתרים כירורגית עם פתרון המבוסס על chlorexidine povidone- יוד או (אנו משתמשים רק chlorhexidine). לחדור אתרי incisional עם 0.1 - 0.5% מתחת לעור לידוקאין.
7. Secure forelimbs וhindlimb שמאל לפלטפורמת ההפעלה עם דבק, עוזב את hindlimb תקין חינם לניטור של עומק הרדמה וסימנים חיוניים.
8. לאחר הבטחת עומק הרדמה מתאימה ידי קמצוץ דוושה, עושה חתך בקפל המפשעה השמאלי באמצעותאזמל 22-להב. על ידי נתיחה בוטה, לחשוף את וריד הירך הנפוץ עזב ולקבל גישה הרביעית כדלקמן:
   1. בעדינות לחזור בי הרקמה המכסה את וריד הירך, וcannulate את הווריד עם IV 24 G. חבר את IV לאורך קצר של צינורות IV מלוחים מלא, ולאבטח את הצינור במקום עם נייר דבק.
      הערה: הליך cannulation ורידי הירך בחולדות מתואר במקומות אחרים על ידי Jespersen ועמיתים ^14.
   2. חבר מזרק 10 מיליליטר מלוח מלאות לצינורות IV, ולשאוב בעדינות דם כדי להבטיח מיקום נכון של IV.
   3. הזרק 300-500 IU של הפרין unfractionated דרך צינורות IV, ולאחר מכן לשטוף את צינורות עם 3-5 מיליליטר של תמיסת מלח.
9. בשלב הבא, tracheotomize התורם כדלקמן:
   1. לעשות חתך קו האמצע ברקמות הרכות בין החריץ והלסת התחתון הצוואר באמצעות אזמל 22-להב. לחדור את הקפסולה של בלוטת התריס בקו האמצע באמצעות Metzenמספריים באום, ואונותיה נפרדות באמצעות נתיחה בוטה.
   2. באמצעות נתיחה בוטה, להפריד את שרירי רצועת הצוואר בקו האמצע כדי לחשוף את פני השטח הקדמי של קנה הנשימה.
   3. השתמש מלקחיים מעוקלים לנתח בצורה בוטה מטוס היקפי סביב קנה הנשימה. להקיף את קנה הנשימה עם עניבת משי 4-0.
   4. בעזרת המספריים איריס, לעשות חתך רוחבי בקנה הנשימה הקדמית, כ 5 מ"מ נחותים סחוס התריס. בעדינות להכניס הצינורית לקנה הנשימה (14 G IV) ולאבטח אותו במקום באמצעות עניבת משי 4-0.
   5. חבר את הצינורית לקנה הנשימה להנשמה מכאנית. הפניה זרימת החמצן וisoflurane דרך מעגל ההנשמה, ולאוורר את התורם בשיעור ונפח של גאות ושפל חזה לפי משקלה ^13.
10. עושה חתך בקו האמצע של החזה (באמצעות אזמל 22-להב), הארכת החתך בצוואר החריץ מתחת xipisternum.
11. להישאר בקו האמצע, בצע sternotomy חציון באמצעות חותך עצם. לחזור הקצוות של עצם החזה עם מפשק שמירה עצמית. הזן את קרום הלב והחללים pleural.
12. בצע thymectomy. זה הכי קל לחלק ראשון בבוטות התימוס בקו האמצע, ואז להפריד אותו ממבנים הסמוכים באמצעות שילוב של נתיחה בוטה וחדה.
    הערה: מקורו של העורקים החזי הפנימיים עלולה להיפצע כאשר לנתח התימוס מהקצוות sternal מעולים. כדי למנוע דימום, קליפים עוצר דמום ניתן להחיל לפני הסרת בלוטת התימוס בנקודות אלה.
13. בעזרת המספריים מצנבאום ו / או לאואר חד, לנתח פרי caval שומן מנחות הווריד הנבוב (IVC). ודא שIVC הוא חופשי יחסית של שומן ורקמת חיבור מצומת Cavo-פרוזדורי superiorly, לסרעפת inferiorly.
14. שימוש באואר חד, הווריד הנבוב מעולה circumferentially חופשי (SVC) ולהקיף אותו עם עניבת משי 4-0.
15. בשלב הבא, לנתח אתהשאיר וריד נבוב חופשי ממבנים סמוכים, ולקשור אותו proximally ו distally עם 4-0 עניבות משי. לכרות החלק להתערב קאווה לחשוף את העורק התת-השמאל.
16. Circumferentially בחינם כלי קשת אב העורקים באמצעות אואר חד. החל קליפים כירורגית הפרוקסימלי ודיסטלי לעורק innominate, ולחלק אותו בין קטעים. השאר את עורק תרדמה משותף שמאל ו- מקוטע האו"ם עורק subclavian השמאל.
17. בשלב הבא, cannulate SVC עם קטטר 24 G IV. Secure את הקטטר עם עניבת המשי הוצב בעבר 4-0.
18. היכונו לקציר שתל מועיל, אבל עדין.
19. בעזרת מספריים חדים, לחלק את IVC רק מעולה למשטח סרעפתית. מחלקים את SVC מעולה לאתר cannulation, על מנת להבטיח שמבנים סמוכים בדרכי נשימה לא נפגעו.
20. כבה את מכשיר ההנשמה ונתק את הצינורית לקנה הנשימה. Transect קנה הנשימה proximally.
21. לתפוס את קנה הנשימה transected עם מלקחיים, ולהסיר את הלבוריאות en-גוש. זה ידרוש מתיחה עדינה עם נתיחה חדה כמו שתל לב-הריאה הוסר. הפרד את קנה הנשימה מהוושט הבסיסי. להימנע מפגיעה באב העורקים היורדים, כך שחלק ממנה ארוך נותר בשלמותה לאחר קציר.

2. הכנה של הלב-הריאה השתל

הערה: בעת השלמת חלק זה של ההליך, עוזר צריך להיות הרדמה המכרסם הנמען והכנה להשתלת שתל.

1. מניחים את שתל לב-ריאה בגזה כירורגית עם המשטח הקדמי של הלב כלפי מטה. באמצעות נתיחה חדה, להסיר כל וושט שייר, הימנעות מפגיעה בדרכי הנשימה האחורית.
2. אתר את אב העורקים החזי יורדים ולהכניס צינורית קהה שקצה 16 G. אבטח את הצינורית במקום עם עניבת משי 4-0.
3. אתר את כלי קשת אב העורקים, ולהחיל קליפ כירורגית לעורק subclavian שמאל. השאר את העורק הראשי עזב בלתי מקוטעת למשנהדה-שידור שלאחר מכן.
4. לנהל את המנה הראשונה של cardioplegia על ידי חיבור צינורות cardioplegia לצינורית אב העורקים 16 G. העורק הראשי חייבים להיות occluded באופן זמני עם מלקחיים כדי להבטיח אספקה ​​נאותה של cardioplegia.
   הערה: יתרון לבעל צינורית אב העורקים המצורף היא שcardioplegia עשוי להינתן ברציפות ו / או לסירוגין כרצוי. למינון לסירוגין, אנחנו בדרך כלל להעביר cardioplegia כל 10 - 15 דקות ב 5 מיליליטר בולוס על 30 - 45 שניות.
5. בעזרת המספריים מצנבאום ו / או לאואר חד, לנתח שומן פרי-אב העורקים מאב העורקים. ודא שאב העורקים הוא חופשי יחסית של שומן ורקמת חיבור מהעורק השמאלי subclavian (קשת דיסטלי) לאתר cannulation.
6. בשלב הבא, לחשוף את סימפונות mainstem עזבו באמצעות אואר חד, ולקשור אותו proximally עם עניבת משי 4-0. Transect דיסטלי סימפונות השמאל לקשירה באמצעות מספריים איריס. בצע ריאה הותירה ligating הריאה השמאליתעורק לוריד עם 4-0 עניבות משי. Transect דיסטלי למייתר ולהסיר את הריאה השמאלית.
7. כאמור לעיל, להסיר את כל אונות הריאה האחרות למעט האונות העליונות ואמצעיות הנכונות. למנוע פציעת IVC בתהליך של ביצוע lobectomies.
8. חבר את צינורות cardioplegia לצינורית אב העורקים ולנהל cardioplegia הרציף תוך הנמען הוא להיות מוכן. מניחים את שתל לב-ריאה במכל סטרילי (למשל, כוס).

3. נמען מבצע

1. להרדים את הנמען כלפעולת תורם, לעיל. השתמש משחה וטרינר כדי להגן על עיניו של בעל החיים מיובש. לאשר הרדמה לעתים קרובות על ידי קמצוץ דוושה.
2. מקם את החיה כמו לכל הפעולה התורמת, זה זמן לעזוב את forelimb תקין החופשי כדי לפקח על סימנים חיוניים ועומק הרדמה.
3. לגלח את הבטן מxiphisternum לפין. לגלח אזור קטן של המפשעה השמאלית (לגישה הרביעית שלאחר מכן). החלdepilating סוכן למשטחים האופרטיביים, לחכות כ 5 דקות, ולהסיר את השיער עם פיסת הגזה.
4. הכן את האתרים כירורגית עם povidone- יוד או פתרון מבוסס chlorexidine. לחדור אתרי incisional עם 0.1 - 0.5% מתחת לעור לידוקאין.
5. Tracheotomize ולאוורר את הנמען כמכוון לעיל. לחלופין, לשמור על הנמען בהרדמה האף-קונוס.
6. להציג את צנתר לוריד הירך כפי שתואר לעיל. הזרק 300-500 IU של הפרין unfractionated דרך צינורות IV, ולאחר מכן לשטוף את צינורות עם 3-5 מיליליטר של תמיסת מלח.
7. בצע laparotomy על ידי ביצוע חתך בבטן קו האמצע עם אזמל 22-להב מxiphisternum לפין. לחזור דופן הבטן באמצעות מפשק שמירה עצמית. בשלב הבא, לחזור בו מהמעיים superiorly ולצד השמאלי של החולדה. לעטוף אותם בגזה חמה, ספוג מלוחה.
8. לחשוף את אב העורקים IVC ובטן על ידי חדות לנתח באמצעות שמעליה מחדששומן tro הצפק.
9. יש מהדק כלי מעוקל זמין ומוכן.
10. Circumferentially לשחרר את IVC ואב עורקי proximally ו distally ולהקיף אותם עם 4-0 עניבות משי. לא צריך להיות כ 2 - 3 סנטימטר של שטח בין אתרים אלה.
11. להחיל בזהירות את מהדק הכלי המעוקל, להבטיח כי חלק מספק של שני IVC ואב עורקים חשופים מעל הלסתות של המהדק.
12. עושה חתך בקיר הקדמי של IVC עם מחט 25 G מחוברת למזרק 1 מיליליטר מלוח מלא. להאריך את החתך עם מספריים פוטס כדי להתאים את אורכו של פתח IVC תורם.
13. הסר את שתל לב-ריאה מיכל שלו ונתק אותו מcardioplegia. מניחים את השתל בבטן של הנמען במיקום אופטימלי לביצוע ההשקה הוורידים.
    הערה: שתל לב-הריאה סופו של דבר להיות מכוון מעט באלכסון, עם ההצבעה השיא לקראת הבטן של רביע שמאלי תחתון.
14. אבטח את העקבובוהן מסתיימת בהשקה עם 9-0 תפר ניילון. לקשור קשר מאובטח בכל קצה, והשאיר את המחט מחוברת לזרוע של תפר ארוך, וקצה קצר של תפר להיות קשורה למאוחר יותר. לנהל מינון של cardioplegia.
15. בריצה אופנה, מחצית מקו התפר והעניבה לזרוע תפר הקצרה המנוגדות מלאה. לנהל מינון של cardioplegia.
16. השלם את המחצית השנייה של קו התפר ולקשור אותו. ההשקה הוורידים היא מלאה. לנהל מינון של cardioplegia
17. אוריינט שתל לב-ריאה עם הלב של הצבעה שיא לכיוון הבטן של רביע השמאלי תחתון. ודא שהשקת הוורידים אינה מפותלת או מעוות.
18. להעריך את אורכו של אב העורקים תורם שיידרש כדי להגיע לאב עורקי הנמען, שמירה על שני IVC וanastomoses אב העורקים בתצורות-מתח חופשי ובלתי מפותל.
19. מחלקים את אב העורקים היורדים (דיסטלי לעורק subclavian שמאל) עם איריס מספריים.
20. הפוך incision בקיר הקדמי של אב העורקים נמען עם מחט 25 G מחובר למזרק 1 מיליליטר מלוח מלא. להאריך את החתך עם מספריים פוטס כדי להתאים את אורכו של פתח אב העורקים תורם.
21. לעגן את הבוהן (היבט מעולה) של אב העורקים התורם למקבל אב העורקים באמצעות תפר 9-0 ניילון. לאחר מכן, להעביר את המחט להיבט המדיאלי של אב העורקים ולהשלים מחצית מההשקה בניהול אופנה.
22. בעקב של ההשקה אב העורקים, להפוך את הכיוון של קו התפר (מעבר בכיוון של תפרים), ולהשלים את מחצית הרוחב של ההשקה בניהול אופנה.
23. לאט לאט להסיר את הצנתר הרביעי בSVC, ולקשור SVC עם קליפ כירורגית.
24. דה-אוויר אב העורקים על ידי איתור עורק התרדמה משותפת-מקוטע של האו"ם עזב. החזק את העורק פתוח, בתנוחה זקופה שתאפשר אוויר להתפנות באופן חופשי.
25. בקצרה לפתוח את הלסתות של מהדק הכלי המעוגל ולאפשר את העורק הראשי לדמם (דדואר אוויר) 2 - 3 שניות. להחיל מחדש את מהדק הכלי.
26. החל קליפ כירורגית לעורק הראשי. הסר את מהדק הכלי המעוקל.
27. בדוק דימום בקווי התפר. אם הווה, להחיל דחיסה עדינה עם גזה או תיקון ניתוחי באורך של תפר 9-0 ניילון (בהתאם לחומרה של דימום).
28. לב התורם צריך לחדש את המכות בתוך דקות.
29. לשים לב לסימנים החיוניים של הנמען, עומק ההרדמה, ולנהל החייאת נפח בהתאם לצורך.
30. בהתאם לנקודתי הקצה הניסיוניים, או לסגור את הבטן של החיה ותן לזה להתאושש מהרדמה, או להכין את החיה להערכת לב וכלי דם.
    הערה: דוגמאות להערכת שתל כוללות באמצעים vivo של פרמטרים המודינמיים עומס תלוי ועומס-עצמאי, צעדים במבחנה של פונקציה בLangendorff ומצבי לב עובדים, ואקו (בניתוח הישרדות) או חקירות MRI.
31. בסוף ניסויי מסוף חריפים, בעלי חיים מומתים על ידי exsanguination.

תוצאות

טכניקת HAHLT שתוארה לעיל היא טכנית מאוד ודורשת תשומת לב לפרטים. טבלת 1 מדגיש חלק מהגורמים המרכזיים הקשורים להצלחה לעומת נהלים כושלים, ויכול לשמש כמדריך לפתרון בעיות בקשיים טכניים.

אחרי אב העורקים נמען unclamped, יש לראות עורקים...

Discussion

הצלחה עם הטכניקה שתוארה כאן תהיה מבוססת על מספר גורמים. מפתח ביניהם יהיה הבטחת יציבות של שני חיות התורם והמקבל, אימוץ טכניקה ניתוחית קפדנית, כי הוא בטוח וקשור עם איבוד דם מינימאלי, על מנת להבטיח מעצר מלא cardioplegic עם קירור שתל אחיד, צמצום זמן איסכמי כולל, ושתל השידור-דה כר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.