JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Abstract

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in naïve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Introduction

gondii Toxoplasma (ט gondii) הוא תאיים לחייב, הפתוגן protozoal. זה הוא הגורם הסיבתי של טוקסופלזמוזיס, סכנה בריאותית באנשי מדוכאי חיסון. כמו כן, מערכת המודל לפתוגנים apicomplexan אחרים שלהדביק בני אדם ובכלל זה Cryptosporidium וCyclospora. טוקסופלזמוזיס נרכש הנפוץ ביותר בבליעת מזון או מים מזוהמים בשלב bradyzoite או oocyst של הטפיל. על הבליעה, שלבים אלה להמיר לבמה tachyzoite של הטפיל שמשכפל בתוך תאי מארח ומפיץ מערכתי. תאי T, IFN-γ ו, ובמידה פחותה, תחמוצת חנקן 1-4, חשוב על שליטה בזיהום, אבל הם לא מסוגלים לחסל את המחלה, כאחוז מtachyzoites להמיר לבמה bradyzoite שמוגנות בתוך ציסטות רקמה וכתוצאה מכך זיהום כרוני חיים ארוכים. למעשה, אין תרופות יעילות נגד של ציסטה הכרוניתכאחוז מהמחלה. טוקסופלזמוזיס החמור הוא לרוב עקב ההפעלה מחדש של זיהום מתמשך, עם שלב bradyzoite של הטפיל המרה בחזרה למאפיין השלב tachyzoite מהירות משכפלים של הדבקה ראשונית וחריפה.

הישרדות בשלב מוקדמת של הפנים של התגובה החיסונית המולדת היא חשובה על מנת לאפשר את הטפיל להגיע מספרי טפיל מספיק, כמו גם להגיע לאתרי דיסטלי, כדי לאפשר הקמתה של דלקת כרונית. ט גונדי התפתח אסטרטגיות כדי לנטרל מנגנוני הגנת מארח שצפויה לתרום ליכולתו לשכפל ולהפיץ בשלבי הדבקה ראשוני. ראשית, ט ' גונדי יוצר PV ייחודי במהלך הפלישה טפילה שמופרד במידה רבה מתהליכי endocytic וexocytic של התא המארח בהשוואה לפתוגנים תאיים אחרים 5-9. כמו כן, כמו כל ט פתוגנים תוך-התאי המוצלח גונדי משנה תא המארח שלה כדי ליצור סביבה מתירנית fאו צמיחה. זה כולל ביטוי מארח תכנות מחדש של תאים על ידי שינוי גנטי גורמי שעתוק תא מארח כולל אלו חשובים להסדרת תא הפעלה 10-15. 16-19 ROP16, GRA15 20, GRA16 21 ו -22 GRA24 כולם הוכחו כחשוב בויסות תגובת תעתיק ותא איתות מפלים של תאי מארח נגועים בט גונדי. מחקרים שנעשה לאחרונה שימוש בצלבים גנטיים בין זני טפיל עם פנוטיפים שונים היו יעילים ביותר בזיהוי גני טפיל העומדים בבסיס תכונות גנוטיפ תלוי טפיל כוללים התחמקות של GTPases החסינות קשורה (IRGs) 16,19,23-26. בעכברים, GTPases החסינות קשורה (IRGs) הם קריטיים לשליטה של ​​סוג II ו- III גנוטיפים של הטפיל ואילו גנוטיפים סוג מאוד ארסי אני התפתחו מנגנונים להתחמק IRGs העכברי. עם זאת, ברור גם שהטפיל התפתח מנגנונים להתחמק תקשורת מיקרוביאליתtors בנוסף לIRGs וכי חלק ממנגנונים אלה עשויים להיות נשמר על פני גנוטיפים טפיל 27,28. בנוסף, מעט מאוד ידוע על המתווכים הקריטיים של חסינות אוטונומית תא נגד T. גונדי בטוקסופלזמוזיס האנושי. גני טפיל חשובים להתנגדות למתווכים של חסינות אוטונומית תא יכולים להיות גם חשובים להישרדות במהלך tachyzoite לbradyzoite המרה אשר יכול גם להיות מופעלת על ידי תגובות חיסוני מארח. לדוגמא, תחמוצת חנקן ברמות גבוהות יכולה לדכא את התרבות טפילה במקרופאגים נגועים אבל זה גם יכול לעורר tachyzoite לbradyzoite המרה וכתוצאה מכך ייצור ציסטה 30-32.

ToxoDB הוא מסד נתונים הגנומי פונקציונלי לט גונדי המתפקד כמשאב קריטי עבור השדה במונחים של מתן מידע לרצף הגנום הטפיל וגישה לנתונים בקנה מידה הגנומי שפורסמו ושלא פורסמו כולל הסברים קהילה, exp הגן נתונים ression ופרוטאומיקה 33. בדומה לרבים פתוגנים protozoal, רוב הגנום מורכב של גנים היפותטי ללא מידע זמינים על בסיס הומולוגיה גנטית כדי לספק תובנות לגבי פונקציות הפוטנציאל שלהם. לפיכך, גנטיקה קדימה היא כלי רב עוצמה לזיהוי גני טפיל רומן חשובים להעלמה חיסונית, המרת ציסטה ופונקציות אחרות קריטיות להיווצרות מחלה טפילה, כמו גם עבור המרה בין שלבי התפתחות שונים. כוח נוסף של גנטיקה קדימה הוא שניתן להשתמש בו כגישה יחסית שאינו מוטה לחקור את הטפיל כלגנים החשובים למשימות ספציפיות בפתוגנזה, כוללים העלמת חיסונית והיווצרות ציסטה. השיפורים אחרונים ברצף של הדור הבא לפרופיל מוטאציות הפכו אותה לשיטת בחירה לזיהוי גני הטפיל האחראים ממחקרי גנטיקה קדימה באמצעות mutagenesis הכימי וinsertional 34-37.

ntent "> חשוב לזהות נקודות תורפה בט gondii שניתן לנצל כדי לשפר את האפקטיביות של מנגנוני חיסון אוטונומיים תא נגד הטפיל במיוחד אלה שיכולים להיות גם פעילים נגד שלב ציסטה עמיד. לקראת מטרה זו, במבחנה עכברית זיהום מקרופאג ומודל הפעלה פותח כדי לזהות מוטציות בטפיל שדווקא לפגוע בכושר gondii ט לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים אך לא במקרופאגים הנאיביים. מסך מקרופאג זה שימש לחקור את ספרייה של מוטציות insertional ט gondii כדי סופו של דבר זיהוי גני ט gondii חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן 27,28. הבידוד של פנל של מוטציות ט gondii עם התנגדות לקויה להפעלה של מקרופאגים הנגועים, במיוחד רגישות ניכרת לתחמוצת חנקן, הוכיח את התועלת של המסך כדי לזהות גני טפיל חשובים להתנגדותלמתווכים של תא חסינות אוטונומית אחרת מאשר מנגנוני ההתנגדות תיארו לIRGs העכברי 28. יש mutagenesis insertional יתרונות על פני mutagenesis הכימי במונחים של יצירת מספר מוגבל של מוטציות אקראיות בכל שיבוט טפיל ו, בתאוריה, זיהוי קל יותר של האתר של מוטציה. עם זאת, זיהוי האתר הגנומי של הכנסת פלסמיד בט מוטציות insertional גונדי, בפועל, היו קשות באופן מפתיע, במקרים רבים 37. החדרת פלסמיד לגן היא גם עלולה לשבש את תפקודו של גן בניגוד לmutagenesis הכימי שבדרך כלל תוצאות שינויי נוקלאוטיד בודדים. עם זאת, mutagenesis הכימי עם או N-nitrosourea N-אתיל-(ENU) או sulfonate ethylmethane (EMS) עשוי להציע יכולת מוגברת לנתח חלק גדול יותר של הגנום הטפיל, בהשוואה לmutagenesis insertional, כפי שהוא יוצר פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד מרובה ( מוערך בכ 10 -100) למוטציה 34, 38. יתר על כן, התקדמות שחלה באחרונה בפרופיל הגנום כולו הפכה זה אפשרי להשתמש ברצף הדור הבא לזהות את הגנים המועמד הסביר ביותר האחראים לפנוטיפ המזוהה של טפיל מוטציה 34,38. ללא קשר לגישה mutagenesis, אישור על תפקידו של גן הטפיל בהתנגדות להפעלת מקרופאג סופו של דבר דורש מחיקת גן ושלמה למלא העיקרים של קוך המולקולרי.

היכולת לנתח את הפונקציה של גן על ידי מניפולציה גנטית של שתי הטפיל ומקרופאג חשובה כמו רבים מהגנים שזוהו באמצעות גנטיקה קדימה בט גונדי, כמו גם פתוגנים אחרים, עדיין מאופיינים כגנים היפותטי עם לא מעט הומולוגיה ברצף לחלבונים אחרים עם פונקציות ידועות. המאמר הנוכחי מתאר גישה כללית שיכול לשמש לזיהוי אם הגן המשובש במוטציה הוא חשוב להתנגדות לידועה אומתווך לא ידוע של חסינות אוטונומית תא. הניתוח הראשוני של גורמים אנטי-מיקרוביאלי מארח מתבצע על ידי הערכת ההישרדות של סוג בר וטפילי מוטציה במקרופאגים מעכברים מסוג בר לעומת אלו עם מחיקות גן ספציפיות בsynthase תחמוצת חנקן מושרה, GP-91 phox (מונואמין NADPH) (iNOS), ו GTPases חסינות הקשורים ספציפי (IRGs). זה יקבע אם הגנים הטפיל זיהו חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן, חמצן פעיל ביניים או GTPases חסינות הקשורים 28 בהתאמה, או אם מנגנון חיסוני ידוע הוא מעורב. הפעלה של מקרופאגים הנגועים עם שני IFN-γ וLPS, שתוארו בפרוטוקול הנוכחי, נובעת בעיקר בבידוד של גני הטפיל חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן 28. השימוש בסוכנים תרופתיים שיגרמו לתחמוצת חנקן בהיעדר הפעלת מקרופאג (תורמי תחמוצת חנקן) אישרו כי הרוב המכריע של הגנים שזוהו היה חשוב למחדשsistance לתחמוצת חנקן ולא תחמוצת חנקן בתיאום עם מתווכים נוספים הקשורות להפעלת מקרופאג 28.

שלב ראשון ושני לתאר מסך גנטיקה קדימה נועד לבודד מוטנטים טפילים עם פגם כושר לאחר ההפעלה של מקרופאגים נגזרות מח עצם נגוע במבחנה. השלב הראשון מתאר ניתוח טיטרציה מינון כדי לקבוע מינון של γ IFN- וLPS אמפירי לשימוש עבור הפעלת מקרופאג שמפחיתה שכפול טפיל אך לא לעכב את השכפול של ט הסוג בר באופן מלא זן הורים gondii המשמש ליצירת הספרייה של מוטציות טפילה. שלב שני מתאר את המסך הגנטי קדימה של השיבוטים המוטציה במקרופאגים ב96-גם צלחות. שלב שלישי מתאר גישה כדי לאשר את הפנוטיפ של כל מוטציה שזוהתה במסך של 96 הצלחות גם ולהעריך האם הפגם בכל מוטציה משפיע הישרדות טפיל, שכפול,או ייצור ציסטה בתגובה להפעלת מקרופאג. שלב רביעי מתאר את השימוש של מקרופאגים נגזרות מח עצם מעכברים עם מחיקות במסלולי מיקרוביאלית ספציפיות כדי לזהות את המתווכים חיסוניים שמוטצית הטפיל היא במיוחד רגישה. השלב חמישי מתאר גישה כדי לקבוע אם מוטציה טפיל גם התפשרה על הפתוגנזה in vivo כפי שהוערך על ידי ייצור ציסטה במוחם של עכברים נגועים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: כל הפרוטוקולים שכרוכים בשימוש בבעלים החיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי הטיפול בבעלי חיים של המכללה לרפואה בניו יורק וועדת שימוש.
פרוטוקולים מפורטים לmutagenesis הכימי 38, בידוד של טפילים על ידי הגבלת דילול 38, בידוד של מקרופאגים מח עצם נגזרים עכבריים 39, צמיחה של ט ': הערה גונדי בפיברובלסטים עורלת אדם ייצור תאים וציסטה במקרופאגים וניתוח immunofluorescence בסיסי (HFF) (IFA) 32 בהפניה. לבצע את כל תרבית התאים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בתקשורת D10 (של Dulbecco גלוקוז הגבוה השתנה נשר בינוני בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, L-גלוטמין 2 מ"מ, 100 U / פניצילין מיליליטר ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין) . שמור את כל חומרים כימיים סטרילי לאורך בידודי תא ותא תרבות.

1. מנה כותרות של IFN-γ וLPS לקביעת Concentrations להשתמש כדי להפעיל את המקרופאגים Infected למסך קדימה הגנטיקה

  1. מקרופאגים תרבות עצם עכברי-נגזר מח O / N בשמונה שקופיות זכוכית קאמרית בריכוז של 3 × 10 5 תאים / מיליליטר ב -250 μl של תקשורת D10 לכל תא. השתמש מקרופאגים 01:59-שבועות לאחר בידוד ממח עצם.
    הערה: מגלשות הלשכה נרכשות שיש לי צמיחה RS שיפור לשטוף.
  2. השתמש hemocytometer לספור טפילים מסוג בר שנקטפו מן פיברובלסטים עורלת אדם תאים (HFF) גדלו בבקבוק תרבות רקמת T25. Resuspend טפילים בריכוז של 5 x 10 5 טפילים מסוג בר לכל מיליליטר בתקשורת D10. ריכוז זה יגרום ריבוי של זיהום של כ 1: 1 כהמקרופאגים התרבו O / N. השתמש בצינורות קלקר או PET לכל המניפולציות עם טפילים כמו מקלות הטפיל לפוליפרופילן.
  3. הסר את המדיה D10 בשקופיות הקאמרית ולהחליף עם 250 μl שלהשעיה של טפילים מסוג בר. בעדינות להוסיף את ההשעיה הטפיל לכל תא של השקופית כך שהוא מאפשר לה לזרום במורד הפנים הפנימיים של כל תא. אל תאפשר מקרופאגים להתייבש בכל נקודה במהלך הפרוטוקול.
  4. שקופיות קאמריות כיסוי נגוע בטפילים עם כיסוי תא השקופית ומקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 4 שעות כדי לאפשר לטפיל לפלוש ולהקים PV.
  5. הפוך את דילולים של LPS וIFN-γ ב 1 מיליליטר של תקשורת D10 בצינורות סטרילית לtitrations המינון. למנה titrations לשמור או LPS או קבוע ריכוז IFN- ולהשתנות הגירוי האחר 40.
    1. לדוגמא, לשמור LPS הקבוע ב 10 LPS ng לכל מיליליטר ולהשתנות הריכוז של γ IFN- (0, 1 יחידה / מיליליטר, 10 יחידות / מיליליטר, 100 יחידות / מיליליטר, 1,000 יחידות / מיליליטר). שמור IFN- γ קבוע ב 100 יחידות / מיליליטר ולהשתנות הריכוז של LPS (0, 0.1 ng / ml, ng / 1 מיליליטר / מיליליטר, 10 ng, 100 ng / ml). מניית LPS בקצרה sonicate למשך 2 דקות בליחימום בsonicator אמבטיה (לא עם sonicator קצה) לפני הדילול.
      הערה: Sonication מומלץ לשבש אגרגטים micelle שהוקמו על ידי LPS שייתכן שלא לקשור כראוי לארח תאים.
  6. 4 שעות לאחר ההתחלה של התרבות המשותפת בין הטפילים ומקרופאגים חסיד בתא השקופיות, לבטל את תקשורת D10 בכל חדר ולהחליף אותו עם 300 μl של דילולים המתאימים של γ IFN- וLPS בתקשורת D10. כולל שליטה בתקשורת D10 רק להעריך שכפול טפיל בהיעדר הפעלת מקרופאג.
  7. שקופיות קאמריות מחדש כיסוי עם כיסוי תא השקופית והמקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ל24-30 שעות נוספות.
    הערה: זמן דגירה תלוי בזמן ההכפלה של מתח טפיל מהסוג בר שיכול לנוע 6-12 שעות בהתאם לזן הטפיל. נקודת זמן שנבחרה לפני טפילה תמוגה של מקרופאגים הנאיביים אבל מספיק זמן כדי לאפשר לפחות 3-4 douבלינג פעמים.
  8. הפוך פתרון פורמלדהיד 2.5% ב מלוח של Dulbecco פוספט (PBS). מחק את התקשורת בתא השקופיות ולהחליף עם 300 μl של תמיסת פורמלדהיד 2.5%. תקן עבור 20 דקות ב RT.
  9. שקופית שטיפה (ים) פעמיים עם 300 μl של PBS לכל תא. לכל שטיפה, לבטל את PBS בשקופית ולהוסיף PBS החדש בעדינות את הפנים הפנימיים של כל תא שקופית כדי למנוע שיבוש מקרופאגים דבקים לשקופית. להוסיף 300 μl של PBS לכל תא ותא בכיסוי מקום שקופית כדי למנוע שקופיות מהתייבשות לפני מכתים.
    הערה: ניתן להציב שקופיות ב 4 C עד 3 ימים בשלב זה לפני מכתים.
  10. פרוטוקול מכתים לט זיהוי gondii על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence (IFA).
    1. הפוך 0.2% בPBS פתרון Triton X-100 (חיץ permeabilization). מניחים את הפתרון בצינור במערבולת 37 אמבט המים ° C ובקצרה זה כדי להבטיח את Triton X-100 לפתרון הולך. מחק אתPBS בשקופיות הקאמרית ולהחליף עם 300 μl של חיץ permeabilization. השאר בRT למשך 30 דקות.
    2. הפוך פתרון של סרום עיזים 10% בPBS (פתרון חסימה). מחק את חיץ permeabilization בשקופית ולהחליף עם 300 μl של חסימת פתרון לכל תא. השאר בRT למשך 30 דקות.
      הערה: עגל בסרום עוברי ניתן להחליף לעז בסרום בכל הפרוטוקולים מכתים.
    3. לפרוטוקול מכתים IFA צעד אחד, לעשות דילול 1: 1000 של נוגדן fluorescently- מצומדות לט גונדי בחסימת פתרון. הסר פתרון חסימה מהשקופיות ולהוסיף 150 μl של פתרון נוגדנים לכל תא. החלף כיסוי להחליק על תא שקופית כדי למנוע מתאים מהתייבשות. דגירה עבור שעה 1 ב RT.
      הערה: ריכוז נוגדן צריכה להיקבע באופן אמפירי בהתאם למקור. נוגדן נרכש מצומדות ישירות לfluorochrome או מוצמד לfluorochrome על ידי המשתמש.
      1. לצביעת IFA שני שלביםפרוטוקול עם נוגדן unconjugated לט גונדי ונוגדנים משני מצומדות fluorescently, מגלשות כתם עם 150 μl של נוגדן ראשוני unconjugated נגד T. גונדי בחסימת מאגר לשעה 1 בRT. לשטוף 3x עם 300 μl של PBS בתוספת 1% עזים בסרום (חיץ לשטוף).
      2. להוסיף 150 μl של נוגדנים משני fluorescently- מצומדות ספציפי למינים ממוצא לנוגדן הראשוני. החלף כיסוי להחליק על תא שקופית כדי למנוע מתאים מהתייבשות. דגירה עבור שעה 1 ב RT.
    4. מגלשות יש לשטוף 3x עם PBS בתוספת 1% עזים בסרום (חיץ כביסה). לכל שטיפה, להסיר את הפתרון בשקופיות הקאמרית על ידי הצפת השוק את התוכן שלה ולהחליף עם 300 μl של חיץ כביסה.
    5. שקופיות שטיפה 2x עם 300 μl של PBS.
    6. הסר את התא מהשקופית הקאמרית לפי הוראות יצרן.
    7. הר שקופיות עם ההרכבה מדיה המכילה DAPI (4'6-diamidino-2-פנילאינדול, dilactate) וx 50 מ"מ coverslip 22 מ"מ.
  11. בדוק שקופיות באמצעות ניגוד שלב ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. לקבוע את המספר הממוצע של טפילים לvacuole על ידי בחינה מינימאלית של 100 לכל תא PVS גם. המנה הנבחרת של γ IFN- וLPS עבור המסך צריכה להיות מספיק כדי לדכא, אבל לא למנוע, שכפול של טפילים מסוג בר (ראה איור 1).

2. בידוד של טפיל מוטאנטים עם הפעלה בעקבות פגם כושר של המקרופאגים מאשרום

הערה: ספרייה של ט 'האקראי מוטציות gondii נדרש עבור מסך הגנטיקה קדימה. mutagenesis אקראי של ט ' ניתן לבצע gondii ידי כימי (ENU / EMS) או mutagenesis insertional 27,28,38. בעקבות mutagenesis, טפילי שיבוט על ידי הגבלת דילול ולגדול שיבוטים בודדים ב96-גם צלחות המכילות תאי HFF חסיד בהיקף של 200 μl של תקשורת D10 32,38.זה קריטי, כי יש לי 96-גם צלחות להקרנה של טפילים במקרופאגים על ידי מיקרוסקופ תחתית אופטית כדי לאפשר הקרנה מיקרוסקופית. בניגוד השלב ומיקרוסקופ פלואורסצנטי להקרנה מוכתם 96-גם צלחות דורשים מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם ניגוד שלב 4, 10, 20 או אובייקטיבי 40X המצויד למרחקים עבודה ארוכים. מטרת 4X היא שימושי בהצגה כולה, אבל גם רזולוציה טובה יותר של הטפילים מושגת במטרה 20X.

  1. ההעברה 50 μl של מוטציות tachyzoite גדלו בתאי HFF ומחוברות בצלחות תרבית רקמה 96-גם לשני לשכפל צלחות 96-היטב המכילות מקרופאגים המופק ממוח עצם העכברי (1-2 שבועות לאחר בידוד) בתקשורת של D10 100 μl.
    הערה: בצע את המסך הראשוני ב96-גם צלחות של הטפיל המבוסס על נפח של תרבות טפילה כדי להימנע מהצורך לספור את מספר הטפילים הועברו לכל אחד. לפיכך, הניתוח מיקרוסקופי 2.6 מבוסס על איכותי whethאה טפילים בדרך כלל משוכפלים או לא משוכפל. שלב 3 מתאר את הגישה כדי לאשר את הפנוטיפ של מוטציות בשקופיות קאמריות באמצעות מספר שווה של סוג בר או טפילי מוטציה להדביק מקרופאגים.
    1. להוסיף ישירות טפילים לתקשורת D10 כבר בכל טוב. להדביק שתי בארות עם tachyzoites סוג בר כביקורת חיובית עבור שכפול טפיל.
  2. מניחים את התאים הנגועים לחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 4 שעות כדי לאפשר לטפילי זמן לפלוש לתאים וליצור PV.
  3. הסר את המדיה מצלחת אחת על ידי שהשליך את תוכן הצלחת. השתמש להעיף יחיד של שורש כף היד לזרוק התקשורת בצלחת לכיור נזרק מכיל cidal חומר ניקוי לטפילים.
    1. הוספה של "תקשורת הפעלת מקרופאג" 100 μl באמצעות אגן סטרילי לתקשורת ופיפטה רבה. השתמש בריכוז האופטימלי של LPS וIFN-γ נקבע משלב 1 לmacתקשורת הפעלת rophage. בדומה לכך להסיר תקשורת מצלחת השליטה כפולה ולהחליף עם של תקשורת D10 100 μl.
  4. מניחים את התאים הנגועים לחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 24-30 שעות נוספות.
  5. פרוטוקול מכתים עבור 96-גם צלחות לIFA.
    1. מחק את התקשורת בצלחת ולהחליף עם של פורמלדהיד 2.5% ב PBS 100 μl. דגירה של 20 דקות ב RT. השתמש באגן סטרילי לפורמלדהיד ופיפטה רבה.
    2. מחק את פתרון פורמלדהיד בצלחת ולהוסיף 100 μl PBS לשטוף פורמלדהיד מהצלחת.
    3. מחק את הפתרון בצלחת ולהוסיף למאגר permeabilization 100 μl (PBS עם 0.2% Triton X-100) היטב כל אחד. דגירה למשך 30 דקות ב RT.
    4. מחק את הפתרון בצלחת ולהוסיף לפתרון חסימה (PBS עם סרום עיזים 10%) 100 μl היטב כל אחד. דגירה למשך 30 דקות ב RT.
    5. מחק את הפתרון בעמ 'מאוחר. הוסף 50 μl / היטב ט אנטי fluorescently מצומדות- נוגדן gondii בדילול 1: 1,000 ב PBS בתוספת 1% עזים בסרום. דגירה עבור שעה 1 ב RT עם כיסוי הצלחת על ועל כיסא נדנדה.
      1. לחלופין להשתמש בנוגדן ראשוני unconjugated נגד T. גונדי ואחרי צביעה עם נוגדנים משני fluorescently- מצומדות כפי שתואר ב1.10.3.1.
    6. מחק את פתרון הנוגדן בצלחת ולהחליף עם 100 μl / טוב של PBS בתוספת 1% עזים בסרום. לבצע שטיפת 3x זה ואחריו 2 שטיפות נוספות עם PBS לבד. השאר 200 μl של PBS היטב כל אחד ולהחליף את המכסה על הצלחת גם 96 כדי למנוע את הבארות מייבוש.
      הערה: הצלחת עם הכיסוי על יכול להיות עטוף בparafilm והניחו על 4 מעלות צלזיוס עד 3 ימים לפני ניתוח על ידי מיקרוסקופ.
  6. לבחון תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באמצעות מטרת 20-40X. מוטציות בחרו שלשכפל בna ו# 239; ve צלחת מקרופאג אבל בעיקר לא מצליח לשכפל מעבר טפיל אחד / vacuole ב" מקרופאגים מופעלים "או שמופיע אמורפי או מושפל ב" מקרופאגים מופעלים".
    הערה: מספר טפילים מסוג בר לvacuole יהיה תלוי במינון של IFN-γ וLPS משמש אך באופן אידיאלי היא סביב 4 טפילים לvacuole; מספר המשקף דיכוי צמיחה אך לא עיכוב מלא של שכפול על ידי גירוי ההפעלה.

3. להעריך מוטאנטים כדי לקבוע אם הפגם הוא ברמה של הישרדות טפיל או שכפול בעקבות הפעלה של המקרופאגים מאשרום

  1. ההעברה נבחרה מוטציות טפילה מ96-גם צלחות (תוכן של כל גם) לT25s המכיל תאי HFF ולאפשר שכפול.
  2. מקרופאגים מח עצם תרבות נגזרים O / N ב 8 שקופיות זכוכית קאמרית בריכוז של 3 × 10 5 תאים / מיליליטר ב -250 μl של תקשורת D10. הכן שקופית אחת כדי להשוות paשכפול rasite במקרופאגים הנאיביים ושקופיות נוספות כדי להשוות שכפול טפיל לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים.
  3. טפילי tachyzoite קציר ולספור בhemocytometer. הוסף 5 × 10 4 T. גונדי טפילים לתא המכיל גם מקרופאגים בתקשורת D10 ותרבות במשך 4 שעות. כולל גם אחד עם טפילים הוריים סוג בר כביקורת. לחסן שקופיות לשכפל זהות עם אותו שיבוט הטפיל שלא יקבל מדיה הפעלה על מנת לעקוב אחר השכפול של טפילים במקרופאגים הנאיביים.
  4. בטל תקשורת D10 מ1 של השקופיות קאמריות לשכפל ולהחליף עם 250 μl של "תקשורת הפעלה". בטל תקשורת D10 מהשקופית הקאמרית לשכפל אחרת ולהחליף עם 250 μl של תקשורת D10. דגירה שני ושקופיות "מופעלות" "נאיביות" מקרופאג עם כיסוי תא שקופיות על על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לadditiשעה 24-30 onal.
  5. לתקן, Permeabilize, ושקופיות בלוק עבור מכתים IFA וניתוח של טפילים כפי שמתואר בשלב 1. לבצע מכתים IFA עם התאים שלמים.
    1. תאי Co-כתם עם נוגדנים לlysosomal 1 קרום קשור (LAMP1) או Lysotracker ונוגדן לט גונדי להעריך האם הפעלה של מקרופאגים הנגועים מפעילה היתוך של PVS המוטציה עם lysosomes (איור 4).
    2. השתמש נוגדנים לתאים / אברונים מסוימים בתוך הטפיל / PV עבור מכתים על ידי IFA לזהות שינויים במוטצית הטפיל הניכרים הראשון שלאחר הפעלת מקרופאג 28.
      הערה: שינויים כאלה עשויים לספק תובנות לגבי המנגנון שבבסיס ההישרדות / השכפול הלקוי של המוטציה לאחר הפעלת מקרופאג.
  6. בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופיה אובייקטיבית וקרינת 100X שמן שלב.
    1. להעריך שכפול טפיל על ידי קביעתמספר הטפילים לPV 100 vacuoles האקראי. לבצע לפחות 2 סעיפים של 100 vacuoles כל לניתוח סטטיסטי.
    2. להעריך מורפולוגיה כללית טפילה באמצעות שני ניתוח הקרינה, כמו גם מיקרוסקופ לעומת שלב. צפה בטפילים תחת מטרת 100x שלב. טפילים בריאים טפילים סגורים בחוזקה בתוך vacuole parasitophorous צמוד. טפילים שיש לי vacuoles המרווח אמורפי עם חישוקים צפופים שלב או טפילי אמורפי מציעים מוות טפיל ולא רק פגם בשכפול (איורים 1 ו 3).

4. להעריך אם הרגישות של Mutant טפילים להפעלה של המקרופאגים Infected קשורה מגשרים אנטי-מיקרוביאלי ידוע

  1. לבודד מקרופאגים נגזרות מח עצם מעכברי C57 / BL6 סוג בר, iNOS - / -, gp91-phox - / - או Irgm1 / Irgm3 - / - עכברי 32.
  2. מק מח עצם המתאים תרבות נגזרrophages O / N ב 8 שקופיות זכוכית קאמרית בריכוז של 3 × 10 5 תאים / מיליליטר ב -250 μl של תקשורת D10.
  3. להמשיך עם אתגר טפיל, מכתים IFA, וניתוח כפי שתואר בשלב 3.
  4. לקבוע אם היכולת של טפילי המוטציה לשרוד ולשכפל לאחר ההפעלה של מקרופאגים הנגועים משוחזרת בהעדר חמצן פעיל או מיני חנקן או חסינות ספציפית הקשורים GTPases 28.
  5. השתמש סוכנים תרופתיים, כגון תורמי תחמוצת חנקן, כדי להעריך אם מתווכים אנטי-מיקרוביאלי הספציפיים מספיקים בעצמם לפגוע בטפילי מוטציה בתאי HFF או מקרופאגים נאיביים או אם הם פועלים רק בתיאום עם מתווכים אחרים של הפעלת מקרופאגים 28.

5. להעריך אם הפגם בזיהום הכרוני Mutant טפיל הפשרות

  1. לבודד tachyzoites מסוג בר, מוטציה או טפילי גן נמחק ממוקדים גדל בשיתוף T25sntaining תאי HFF. טפילים יש lysed טרי מתרבויות HFF.
  2. רוזן טפילים באמצעות hemocytometer. טפילים גלולים בפתרון הנקס המאוזן מלח (HBSS) בריכוז מתאים לכל מיליליטר למנה תת-קטלני של הטפיל מועבר ב200 μl על ידי הזרקת intraperitoneal (IP).
  3. השתמש במזרק טוברקולין 1 מיליליטר ומחט 25 G להזריק טפילים עם 200 μl נפח intraperitoneally (IP). המינון תלוי בזן הפראי הסוג של הטפיל וגנוטיפ העכבר.
    הערה: אני גנוטיפים סוג של הטפיל הם קטלניים לעכברים בשלב החריף של זיהום ללא קשר למינון טפיל ואינם מתאימים ללימודים של זיהום כרוני בהעדר כימותרפיה לט גונדי לדכא את התרבות טפילה.
  4. שלושים ימים לאחר אתגר טפיל, להקריב את העכברים על ידי שאיפה של CO 2 מטנק בלחץ בתא צפוף (כלוב עכבר בגודל סטנדרטי עשוי להכיל לא יותר מ -5 מ 'קרח) ואחריו נקע בצוואר הרחם.
  5. לבודד את המוח מהעכבר באמצעות נהלים שנקבעו 41-43.
    1. הנח את העכבר על הצד הקדמי שלה. לרסס את הראש עם 70% אתנול ללחטא את האזור.
    2. השתמש במספריים חדים לחתוך את גזע המוח. השתמש במספריים לנתח לעשות חתך רדוד רוחבי סביב הימני ולאחר מכן בצד השמאל של הגולגולת החלה מהבסיס של גזע המוח. שימוש במלקחיים כדי לקלף בעדינות את הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
    3. רם בעדינות את המספריים המוח ומקום בין המוח ובסיס הגולגולת לחתוך את עצב ההרחה לשחרר את המוח. הרם את המוח עם מלקחיים סטרילית או מרית ומניחים בצלחת פטרי בקטריולוגית המכילה 10 מיליליטר של PBS סטרילי.
  6. חותך את המוח במחצית עם אזמל סטרילי דרך המרכז בין הימין ושמאל האונות.
  7. להוסיף מחצית מהמוח למרגמה קטנה המכילה 1 מיליליטר של PBS. השתמש במכתש ועלי ללהפוך את ההשעיה רקמה עדינה של המוח שיכול לעבור בקצה פיפטה μl רחב נשא 20-200.
    הערה: החצי השני של המוח צריכה להיות קבוע בפורמלין 2.5% עבור שעה 1 אם סעיפי רקמות נחוצים לhistopathology.
  8. מקום lysate המוח 100 μl בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge. הוסף 1 מיליליטר של פורמלדהיד 2.5% ב PBS לתוך הצינור המכיל את lysate המוח כדי לתקן את ההשעיה המוח לצביעה. לדגור על RT למשך 30 דקות.
  9. צנטריפוגה lysate ב 8000 XG במשך 5 דקות בmicrocentrifuge וזורקים supernatant בזהירות.
  10. הוסף 1 מיליליטר של permeabilization / חיץ חסימה לlysate (סרום עיזים 10%, 0.2% Triton X-100 ב PBS). לדגור על RT למשך 30 דקות.
  11. lysate צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות ולהסיר supernatant.
  12. הוסף 200 μl של FITC מצומדות- לַבלָב biflorus agglutin (DBA). השתמש 1: של הקטינים בPBS בתוספת 10% עזים בסרום 100 דילול. בעדינות resuspend lysate ידי pipetting. דגירהעבור שעה 1 ב RT.
    הערה: DBA הוא יגנד שנקשר לCST1 על קיר ציסטה הטפיל.
  13. lysate צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות וזורקי supernatant. הוסף 1 מיליליטר של PBS לגלולה. לדגור על RT במשך 5 דקות. חזור על לשטוף 3x PBS. הסר את supernatant הבא לשטוף הסופי באמצעות פיפטה.
  14. השתמש קצה פיפטה μl רחב נשא 20-200 להכין 5 μl של lysate המוח המוכתם ומניחים על שקופיות מיקרוסקופ. הר השקופיות עם 25 x 25 מ"מ מכסה להחליק ליצור הר רטוב של lysate המוח. לעשות 3 שקופיות לשכפל באמצעות 5 μl של מוח lysate כל אחד.
  15. לספור את מספר ציסטות לכל aliquot 5 μl על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרת 10X (איור 6).
    הערה: ציסטות חלקם גדולים (8 או יותר טפילים כ) וחלקן קטן מאוד (1-2 טפילים לציסטה). לספור את מספר כולל של ציסטות לכל מספר שקופיות אבל מסמך של גדול לעומת מספר של ציסטות קטנות.
  16. הוסף את מספר det ציסטותהשתקף בשלושה aliquots 5 μl שונה ומתרבים על ידי הגורם הכולל דילול x 2 (רק חצי מהמוח נעשה לlysate) כדי להעריך את המספר של ציסטות הכוללת למוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Toxoplasma gondii משכפל בחופשיות במקרופאגים הנאיביים ויש לו זמן הכפלה בין 6-12 שעות, בהתאם לזן של הטפיל. איור 1 מציג טפילי נציג בנאיבי לעומת מקרופאגים המופק ממוח עצם הופעלו. איור 2 מציג את המורפולוגיה הכללית של טפילים בHFF לארח תאים ב 2, 4, 8, 16 ו -32 טפילים / PV. ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המתואר מספק גישה הלא-משוחדת המשתמשת בהפעלה של מקרופאגים העכבריים עצם נגזר מח וגנטיקה קדימה לבודד ט מוטציות גונדי עם מום ביכולתם לשרוד הפעלה של מקרופאגים הנגועים. הפנוטיפ של הפעלת מקרופאג הבאה מוטציות בדרך כלל משתייך לאחת משתי קטגוריות רחבות: 1) ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have no competing financial interests.

Acknowledgements

Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMHycloneSH3008101https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBSThermoSH3091003https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBSThermoSH3002802 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamineThermoSH3003401 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strepThermoSV30010 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSSThermoSH3003002https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPSLIST biologicals201http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γPepro Tech Inc50-813-664https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slidesThermo177402https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical platesThermo165306https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture platesFisher353072https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25Fisher156367https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehydeTed Pella18505http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100FisherBP151https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 - protein conjugation kitLife TechnologiesA20181http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serumMP BiomedicalsICN19135680https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting mediaVector LabsH1200https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichosVector LabsFL-1031https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1Developmental Studies Hybridoma Bankhttp://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTrackerLife TechnologiesL-7526https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 miceJackson Laboratories664http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out miceJackson Labaoratories2365http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out miceJackson Laboratories2609http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprussideACROS OrganicsAC21164-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOateACROS OrganicsAC32865-0250https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii AbFitzgerald Industries International10T19Ahttp://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483(2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589(2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236(2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14(2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784(2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091(2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354(2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180(2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807(2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966(2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348(2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225(2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358(2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927(2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97Toxoplasma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved