בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

Abstract

הפרעות במערכת הלימפה כגון בצקת לימפתית העיקרית, מומים הלימפה וגידולי הלימפה הן תנאים נדירים הגורמים לתחלואה משמעותית אך מעט מאוד ידוע על הביולוגיה שלהם. בידוד תאים טהורים ביותר אדם הלימפה אנדותל (LECs) מהרקמה חולה ובריאה היה להקל על מחקרים של האנדותל הלימפה ברמות גנטיות, מולקולריות ותאיות. זה צפוי כי חקירות אלה עשויות לחשוף מטרות לטיפולים חדשים שעשויות לשנות את הניהול הקליני של תנאים אלה. פרוטוקול המתאר את בידודו של אדם עורלת LECs ותאי הלימפה מום הלימפה אנדותל (LM LECs) מוצג. כדי להשיג רקמת השעיה תא בודדת הייתה טחון וטופלה באמצעות אנזימי dispase השני וcollagenase השני. ההשעיה התא בודדת וכתוצאה מכך הייתה אז שכותרתו עם נוגדנים לאשכול של בידול סמנים (CD) CD34, CD31, כלי דם האנדותל Growth Factor-3 (VEGFR-3) וPODOPLANIN. Staiתאי קיימא נד מוינו על סדרן תא מופעל fluorescently (FACS) כדי להפריד את האוכלוסייה ^ממוצע PODOPLANIN ^ממוצע LM הבקר CD34 ^נמוך CD31 ^ממוצע VEGFR-3 מאנדותל האחר ותאי האנדותל אינו. LECs LM מסודרים היו בתרבית והרחיב על צלוחיות מצופים פיברונקטין לשימוש ניסיוני נוסף.

Introduction

תפקידה העיקרי של מערכת הלימפה וכלי הדם הוא לקלוט הלימפה, נוזל ביניים עודף המכיל שומנים, חלבונים ומרכיבים תאיים, ולנהל אותו למערכת ורידי דם. רשת של נימי הלימפה מכוונת לימפה לבלוטות הלימפה שבו הוא הוקרן לנוכחות של אנטיגנים זרים, תהליך חשוב במעקב ופריסה של תאי דם לבנים לנטרל אנטיגנים זרים חיסוניים.

מערכת הלימפה חד כיוונית מתחילה ברקמות עם נימי הלימפה הראשוניות, מבנה ייחודי עם שכבה אחת רציפה של תאי האנדותל שטוח מוקף חומה דקות עם צמתים תא מיוחדים המאפשרים כניסה לימפה ^1,2. נימים אלה מחוברות מטריצת רקמת חיבור השכנה באמצעות עיגון חוטים כדי למנוע קריסת ספינה בנוכחות של לחץ מוגבר ביניים ^3. נימי הלימפה הראשוניות הריקות לאיסוף נימי הלימפהשלהתגבש לגדולים יותר כלי או ורידי הלימפה. בהשוואה ראשוני כלי נימי הלימפה, איסוף יש כלי הלימפה דפנות כולים עבים, שסתומים הלימפה לזווג ונארזים על ידי קרום מרתף רציף שבו כמה תאי שריר חלק מוטבעים ^4. פתיחה מתואמת וסגירת שסתומי הלימפה והתכווצות של תאי שריר חלק מאפשרים זרימת הלימפה ^3. בבני אדם, ורידי הלימפה מאזורים שונים בגוף מצטרפים לגזעי הלימפה המתמזגים ליצירת שתי צינוריות הלימפה: צינור החזה וצינור הלימפה תקין. צינור החזה מרוקן הלימפה מהצד השמאלי של הגוף ומהצד הימני מתחת לחזה בזמן הלימפה מתנקזת צינור הלימפה תקין מהזרוע הימנית וצד ימין של הראש, צוואר, בית החזה ו. שני צינורות הלימפה לנהל לתוך ורידי subclavian בצוואר ^5.

הפרעות של מערכת הלימפה מקובצים באופן כללי לרכשND מולדת (טבלה 1). דוגמאות לתנאים נרכשים הנן דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד ובצקת לימפתית משנית. דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד היא דלקת של כלי הלימפה עקב זיהום חיידקים. Lymphatics המושפעת להתרחב ולמלא עם תאי polymorphonuclear exudate מכיל. בעור, lymphatics אלה נראית כפסים אדומים, כואבים תת עורי לעתים קרובות מלווים בהגדלה של קשורים צומת הניקוז לימפה (בְּלוּטַת לְשַׁד) ^6. בצקת לימפתית משנית נובעת כתוצאה מניזק או שיבוש לחסימת כלי שיט או בלוטה לימפה הלימפה. זה מוביל לנפיחות מתקדמת כרונית עקב הצטברות של דיסטלי לימפה לנזק או שיבוש הליכי. במדינות מפותחות, בצקת לימפתית משנית קשורה לרוב עם ממאירות בי גידולי גרורות להכשיל כלי הלימפה או בלוטות הלימפה אזוריות, או כתוצאה מטיפול אנטי-סרטני לאחר ההסרה כירורגית של בלוטות לימפה, סיסטיק הודעה הקרנה-וthrom פוסט-דלקתיbosis וצלקות ^7. בחלקים אחרים של העולם, בצקת לימפתית משנית עשויה להיות משנית לחסימת הלימפה הנגרמת על ידי תולעים טפילים כגון bancrofti Wuchereria ^6.

הפרעות של מערכת כלי דם הלימפה
רכש	מולדים
בְּלוּטַת לְשַׁד בצקת לימפתית משנית	עיקרי בצקת לימפתית 10	הלימפה מומים סדירים 13	הלימפה מומים הקשורים תסמונות 13
	למשל Milroy תסמונת Meige תסמונת	פשוט: מומים הלימפה	למשל Klippel-Tranaunay תסמונת הפארקים וובר תסמונת סטרג'-וובר תסמונת
		בשילוב: מומים נימים-הלימפה מום נימים-הלימפה-ורידים מום נימים-הלימפה-arteriovenous מום ורידים-arteriovenous נימים-הלימפה

1. השולחן של ההפרעות של מערכת כלי דם הלימפה.

הפרעות מולדות של מערכת הלימפה כוללות בצקת לימפתית ראשונית (אידיופטית) חשבה שנגרם על ידי מוטציות גנטיות, lymphangiectasia וחריגות של ^8,9 מערכת הלימפה. בצקת לימפתית ראשונית יכולה להיות לא סדירה שנגרמה ככל הנראה על ידי מוטציות דה נובו, או בירושה. הפרעות הלימפה יכולות גם להיות מבודדות או מהוות חלק מתסמונת כללית יותר ^10. באוכלוסיית הילדים, 97% מהלימפההבצקת היא לא סדירה עם ליקויים במבנה כלי הלימפה הפוגעים בניקוז הלימפה אזורית ^11. המחלה Milroy היא דוגמא לבצקת לימפתית העיקרית הנגרמת על ידי מוטציה בגן ניכר בלידה או מייד לאחר ¹² VEGFR-3. למרות מצב משפחתי בעיקר, המחלה Milroy יכולה גם להיות מזוהה בתינוקות ללא היסטוריה של מחלות Milroy ³² משפחה. החומרה של כל בצקת לימפתית תלויה בכמות הייצור לימפה והיכולת להעביר לימפה בחזרה למחזור ורידי ^6.

בהתבסס על מצגת קלינית ובהתפשטות תאי אנדותל באתר, מומים של מערכת הלימפה מסווגות כגידולי הלימפה או מומים הלימפה ^13. Kaposiform lymphangiomatosis היא דוגמא לגידול הבקר ^14. מומים הלימפה הם חשבו להתעורר במהלך התפתחות עוברית ולגדול באופן יחסי לילד ^15,16. רק לעתים רחוקות הם לסגת אבל יכולים מאהלרn ללא תסמינים עד טראומה או זיהום משקעים צמיחה מהירה שמובילה לסיבוכים קליניים. המבנה המסודר של רשת והולכה של הלימפה הלימפה מרקמות למחזור ורידים שתואר לעיל הוא מוטרד במומי הלימפה אשר מורכב של אוספים מקומיים של מבני פיברוזיס חריגים מלאים בנוזל הלימפה. אמנם אין עדות קלינית או ניסויים שכלי פיברוזיס אלה מחוברים לזרימת הלימפה או שהם מכילים שסתומים הלימפה פונקציונליים, זהות הלימפה שלהם אושר על ידי ביטוי של מגוון רחב של סמני תא הלימפה כגון PODOPLANIN, CD31, כלי הלימפה האנדותל קולט 1 (LYVE-1), חלבון homeobox פרוספרו 1 (PROX-1) וVEGFR-3 ^15,17,18. מבני פיברוזיס אלה יכולים להיות קטנים (microcystic) או גדול (macrocystic), אבל רוב המומים הלימפה מכילים הן microcystic ורכיבי macrocystic (איור 1) ^16. לאחר ניתוח, Injection sclerotherapy ו / או גלי רדיו אבלציה המומים הלימפה לעתים קרובות מתרחשת שוב.

איור 1. מורפולוגיה של כלי הלימפה אנושי ומומי הלימפה. הלימפה אנושית רגילה () וכלי הלימפה מום (B ו- C) שכותרתו עם נוגדן לPODOPLANIN (תווית בצבע חום, חץ). כלי מום הלימפה אנושיים מאופיינים בהתרחבות ניכרת והבדלים ניכרים בגודל לומן. מבני פיברוזיס החריגים המקומיים אלה יכולים להיות קטן (ב) או גדול (macrocystic, #) (ג) (microcystic, *). רוב המומים הלימפה מכילים את שני מרכיבי microcystic וmacrocystic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

חוקרים אחדים הציעו שמומי הלימפה מייצגים הפרעה התפתחותית של כלי דם הלימפה שבאין לי LECs פוטנציאל צמיחה נורמלי אבל במקום לא הצליח להתחבר לזרימה הרגילה ^19. עם זאת, מצאנו כי LECs LM להתרבות מהר יותר ועמיד יותר לאפופטוזיס מאשר עורלת ¹⁵ LECs מצביע על כך שיש פגם עיקרי בLECs LM. כאשר LECs LM מושתל במודל xenograft עכבר, הם יוצרים מבנים דמויים מומים הלימפה ^15. זה תומך בהשערה כי מומים הלימפה עלולים להיגרם על ידי אחד או יותר מוטציות סומטיות שהמקורה בLECs LM במהלך התפתחות עוברית. ואכן, הדיווחים אחרונים זיהו מוטציה אחת כזו במקטע קטליטי p110α של phosphoinositide-3-קינאז גן (PIK3CA) ^20.

בהתחשב בהתקדמות טכנולוגית רצפי DNA, מוטציות רלוונטיות גולד להיות מזוהה בקלות רבה יותר בLECs LM המבודד, המנחה את המחקרים עתידיים של תנאים אלה. הבידוד של LECs קיימא יאפשר השוואות בין LECs נורמלי והרגיל במבחנים כגון הגירה, שגשוג, יכולת להרכיב צינור והישרדות בתגובה לזמינות חומרי מזון מופחת או סוכנים פרו-אפופטוטיים ^15. LECs המבודד יאפשר לנו לבצע עוד ביטוי גני תא ספציפי ומחקרי proteomic, להתוות אוכלוסיות הבקר חדשות ולגלות סוכנים תרופתיים רומן מתאים לניהול קליני של מומים הלימפה.

יש לנו שפורסם בעבר בשיטת בידוד הבקר המבוססת על הפרדה חרוז מגנטית של LECs מעורלה בילוד ומומי הלימפה ^15. דיווחנו אסטרטגיה של הפרדת LECs הבריא וחולה מתאי האנדותל של כלי דם המבוססים על היעדר ביטוי CD34, ואחרי חשיפת חלק תא CD34 ^נג לסלקציה חיובית לCD31.עם זאת, שיטה זו הקשתה על ידי הנוכחות של תאי האנדותל אינו שייר. זה לא היה תלוי בהסרת עור לפני עיכול רקמת חיבור שלאחר מכן. מזהמים אלה בדרך כלל התרבו במהירות רבה יותר ובכך בסופו overgrew תרביות תאי אנדותל למרות ניסיונות שלאחר מכן לחזור על בידוד הבקר. ואכן, זיהום ראשוני של תאי האנדותל אינו נמוכים כמו 2% עד 5% היה מספיק כדי להכניע את אוכלוסיית הבקר ^15. זה גרם לנו לבחון שיטת מיון תא מופעלת fluorescently כאופציה לשיפור תשואת תא הבקר וטהרה. בנוסף, השתמשנו רב פרמטר מיון כדי לשפר את הספציפיות של אוכלוסיות הבקר, הוספת VEGFR-3 וPODOPLANIN לסמני הבחירה לזהות CD34 VEGFR-3 LECs ^נמוך CD31 ^{ממוצע ממוצע ממוצע} PODOPLANIN.

הרציונל לבחירת סמנים אלה היה מבוסס על הדיווחים כי בעוד לסה"נ LECs וכלי דם דם האנדותלLLS יש סמנים פני תא משותף רבים כגון CD31, LECs להראות וריאציה פנוטיפי בביטוים של CD34, PODOPLANIN וVEGFR-3 סמן תא שטח בהשוואה לתאי האנדותל של כלי דם דם ^21-23. CD31 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני 130 kDa הידוע גם במולקולת הידבקות טסיות דם תא האנדותל 1 (PECAM-1). זה נחשב סמן תא פאן-אנדותל שכן הוא בא לידי הביטוי בכל הסוגים של כלי דם והלימפה ^21,24,25. CD34 הוא 110-kDa גליקופרוטאין הטרנסממברני נוכחי על אבות היווצרות הדם ביותר ותאי גזע, תאי האנדותל של כלי דם וכלי הלימפה כמה ^26.

VEGFR-3, קולט לצמיחה של אנדותל כלי דם גורמי C ו- D, הוא בתחילה קיימים בורידים המתפתחים בעובר העכבר, אך בעקבות מפרט הלימפה מוסדר על ידי שעתוק גורמי HMG-תיבה הקשורים ל- ¥ * $ (SOX) -18, hicken ג o valbumin u pstreaשחקן עמ 'מ' ו ranscription לא romoter 2 (COUPTF-השני) וPROX-1, VEGFR-3 ביטוי ורידים הולך לאיבוד והוא הופך להיות מוגבל לLECs העוברי ^25,27. PODOPLANIN, קרום kDa 38 mucoprotein, יצוין ראשון בכלי הלימפה בכ עוברי יום 11 (~ E11.0) של התפתחות העוברית של עכבר ²⁸ ותוך שהוא מתבטא בחריפות על ידי כלי הלימפה כלי דם, PODOPLANIN ביטוי על ידי האנדותל הלימפה macrocystic במומי הלימפה משתנה יותר ^15. Cytometry זרימת ניסויים מראים כי לפחות חלק מתאי אנדותל CD34 ^הגבוה CD31 ^ממוצע להביע את סמן הלימפה PODOPLANIN ^29. למרות הערכה שיטתית של מכתים LYVE-1 וPODOPLANIN במומי הלימפה אדם הראתה כי הן יעילות במכתימים האנדותל מום הלימפה ^30, ברקמות נורמליות, LYVE-1 נמסר להיות מאוד נוכח בהלימפה הראשוניתהאנדותל נימים אבל מופחת ואפילו נעדרו בהאנדותל הלימפה איסוף ^31. כמו המטרה שלנו היא לבודד את שני תאי האנדותל הלימפה הראשוניים ואיסוף שבחרנו שלא להשתמש LYVE-1 כחלק מהאסטרטגיה שלנו בחירת תא. לבסוף, ההחלטה להעסיק סמנים אלה הייתה מבוססת גם על הזמינות של נוגדנים המשמשות diagnostically לתיוג כלי הלימפה להדמיה מיקרוסקופית, תכונה שתאפשר קשר בין cytometry זרימה ומחקרי immunofluorescent.

מאמר זה יתאר את שיטת עיכול רקמה, מכתים תא והגדרות FACS נדרשת לבידוד מוצלח של CD34 ^נמוך CD31 ^ממוצע VEGFR-3 LECs ^ממוצע PODOPLANIN ^ממוצע, כמו גם תאי האנדותל CD34 ^גבוהים CD31 ^ממוצע VEGFR-3 ^ממוצע PODOPLANIN ^ממוצע מעורלה ומום הלימפה רקמה.

Protocol

הצהרת אתיקה: אישור אתי לאיסוף רקמות מום ועורלת הלימפה התקבלה מועדות האתיקה מחקר האדם בבית החולים מלכותי לילדים, מלבורן, אוסטרליה. הסכמה חתומה התקבלה מההורים של החולים לפני הניתוח. דגימות רקמה נאספו מחולים שאובחנו עם LMS עובר ניתוחים כחלק מהניהול הקליני שלהם וחולים שעבר ברית מילה בחירה. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של הבריאות הלאומית ומועצה למחקר רפואי, אוסטרליה.

1. הכנת תרחיף תא מהעורלה והלימפה מומים רקמות

1. מאגרים ומדיה הכנה.
   1. הכן תקשורת תא האנדותל מלאה באמצעות ערכת Bullet זמינה מסחרי EGM-2 MV ידי התחממות EGM-2 תקשורת ועדינות הפשרת רכיבי הערכה 37 ° C אמבט מים. בכיתה השנייה קבינט בטיחות ביולוגית, סביבה נקיה מחיידקיםלהוסיף כל רכיב לEGM-2 התקשורת. לאחר שכל הרכיבים נוספים לתקשורת, מתייחס לזה כאמצעי תקשורת "תקשורת תא האנדותל מלאה '. השתמש פיפטה 50 מיליליטר סטרילי לערבב את התוכן לפני השימוש.
      הערה: כל הצעדים הנוגעים לתרבות תא מבוצעים בקבינט Biohazard בכיתה השני. כל הפתרונות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בהתאם להוראות יצרנים והם חיממו לטמפרטורת חדר לפני השימוש. התקשורת המלאה אנדותל התא, מאגרי תרבית תאים ופתרונות אנזים הם חיממו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני השימוש.
   2. להשלים תקשורת תא אנדותל להשלים עם 50 VEGF-C ng / ml. Aliquot תקשורת תא האנדותל בתוספת לצינורות 50 מיליליטר וחנות סטרילי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. התקשורת היא יציבה לפחות 4 שבועות, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס.
   3. הכן סידן ופוספט שנאגרו מלוח חופשי מגנזיום (PBS) על ידי המסת 8.752 גרם NaCl, 1.416 גרם Na ₂ HPO ₄ .2H ₂ O ו.395 גרם KH ₂ PO ₄ ב1,000 מיליליטר של מים. התאם ל- pH 7.4. סנן לעקר PBS באמצעות 0.22 מיקרומטר לסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפני השימוש להוסיף פתרון אנטיביוטי / antimycotic (ששמש בשעה 1: 100).
   4. כדי להכין פיברונקטין אדם, לפזר 1 מ"ג של פיברונקטין ב 10 מיליליטר של מים סטריליים. חנות מחדש פתרון ב100 aliquots μl ב -20 ° C. ביום שימוש להוסיף 10 מיליליטר של PBS סטרילי של aliquot פיברונקטין 100 μl (לתת ריכוז עבודה סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר).
   5. לתקשורת האנזים, להכין תמיסה המכילה 0.04% Dispase השני, 0.25% Collagenase השני ו0.01% DNase אני בPBS סטרילי. ראשית, לשקול dispase וcollagenase, מקום בצינור 50 מיליליטר סטרילי, להוסיף הנפח הנדרש של PBS ודגירה למשך 30 דקות עם רעד על 37 מעלות צלזיוס לפזר. ברגע שהתפרק, סנן לעקר (0.22 מיקרומטר מסנן) פתרון dispase / collagenase במכסת מנוע בטיחות ביולוגית. סביבה נקיה מחיידקים להוסיף I. חנות DNase הפתרון האנזימטית על 37 מעלות צלזיוס עדלהשתמש.
      הערה: אני DNase הוא מגיב כיתה מסחרית תרבית תאים זמינה כאבקת lyophilized סטרילי.

2. הכנת תרחיף תא ממומי עורלה והלימפה

1. שוקל שפופרת 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של / 2% פתרון antimycotic אנטיביוטיקה DMEM. צינור זה ישמש לאיסוף רקמות.
2. בעקבות הסרה כירורגית של מום הלימפה ורקמות עורלה, סביבה נקיה מחיידקים להוסיף דגימת רקמה לצינור וההעברה על קרח למעבדה תרבית תאים.
3. לשקול את הצינור המכיל את הרקמה ולחשב את משקל רקמה. השתמש במשקל זה כדי לחשב את הנפח של הפתרון האנזימטית הדרוש כדי לעכל את הרקמה.
4. בארון בטיחות ביולוגית Class II, להשתמש במלקחיים סטרילי להעביר את הרקמה ותקשורת לתוך צלחת תרבית רקמת 100 מ"מ. השתמש במספרי סטרילי כדי לרכך את הרקמה ל~ 1 מ"מ ³ חתיכות דק.
5. רקמה טחונות העברה מעורבבת עם i תקשורתn כדי שפופרת 50 מיליליטר המכילה תוספת של 10 מיליליטר של תמיסה סטרילית DMEM / 2% לאנטיביוטיקה antimycotic. מערבבים על ידי היפוך מחדש להשעות את הרקמה. צנטריפוגה המדגם XG ב 300 במשך 5 דקות.
6. הסר את supernatant. בהתבסס על משקל רקמה, להוסיף 1 מיליליטר של collagenase המחומם מראש (37 ° C) II / פתרון עיכול DNase I / II Dispase לרקמה טחון 100 מ"ג. בדרך כלל, להשתמש 10 מיליליטר של תמיסת אנזים לכ 1 גרם של רקמה טחונות.
7. דגירה הרקמות בחממה 37 ° C דקות 20-90 עם קבועים רועד ב 200 סל"ד. בתום תקופה זו, להבטיח כי כמעט כל הרקמה מתעכלת לרסיסים בסדר.
   הערה: חשיפה של התאים לcollagenase וdispase בעת הבידוד מהישרדות תא השפעות רקמות העיקריות. מצאנו באופן אמפירי שרוב דגימות עורלה בילוד בצורה אופטימלית דורשות 20-30 דקות של עיכול, ואילו דגימות מום הלימפה fibrotic עשויות לדרוש 60-90 דקות של עיכול. תשואת הבקר LMשל מושפעים מכמות סיסטיק הנוכחי, רקמה סיבית יותר מניב פחות תאים, אולי בשל השפעות מזיקות של חשיפה ממושכת לcollagenase השני וdispase השנייה.
8. בעקבות עיכול, להעביר את הצינור לארון הבטיחות הביולוגית ולהעביר את פתרון הרקמה מתעכל דרך מסננת 70 מיקרומטר להציב לתוך שפופרת 50 מיליליטר סטרילי. שימוש בבוכנת מזרק 3 מיליליטר עם בוכנת גומי, לטחון את הרקמה שנותרה עד שרק עקבות קטנות של מטריקס הם נצפו.
9. שטוף את מסננת התא עם נפח שווה ערך בינוני תא האנדותל להיקף מתנער בינוני אנזים להתאושש תאים נדבקו למסננת וכדי להשבית את האנזימים. לדוגמא, עבור 2 מיליליטר של חוצן בינוני אנזים לעכל את הרקמה הטחון, להוסיף 2 מיליליטר של מדיום תא האנדותל כדי להשבית את האנזימים.
10. צנטריפוגה פתרון התא XG ב 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. > R דואר להשעות את התאים ב 10 מיליליטר של PBS. תאי צנטריפוגה XG ב 3005 דקות, להסיר את supernatant לאחר מכן לחזור לשטוף תא פעמיים. > Resuspend התא גלולה ב 20 מיליליטר של מדיום תא האנדותל. ספירת תאים באמצעות כחול אז זרע trypan 2 x 10> ⁶ תאים ב150 סנטימטר> ² בקבוק מראש מצופה פיברונקטין בנפח סופי של 20 מיליליטר של מדיום תא האנדותל. תרבות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO> ₂ בחממת אוויר humidified.>
    הערה: צפוי כי 75% -90% מתאי בעלי הגרעין לשרוד עיכול רקמה כפי שהוערכו על ידי הרחקת trypan הכחולה. ספירת התאים הראשונית משקפת תאים כל גרעין בהשעית התא (כלומר קרטינוציטים, לויקוציטים, מקרופאגים, תאי רקמת חיבור ותאי כלי דם). ספירת התאים ב5-7 ימים משקפת תאים שצורפו, שרדו והתרבו במהלך תרבית תאים. ציפוי צלוחיות תרבית רקמה עם פיברונקטין גם משפר את הבקר הבא והישרדות LM הבקר.
11. לאחר דגירה הלילה, לשטוף תאים משם מאוגד בשלושה שוטף עם P/ 1% פתרון BS אנטיביוטיקה antimycotic ולהוסיף בינוני תא האנדותל טרי. לבצע שלושה שוטף כדי להסיר ביעילות תאים מאוגד ותאי דם אדומים הנמצאים בבקבוק. שינוי תקשורת בכל יום שני. תאים יהיו ~ 80% ומחוברות לאחר 5-7 ימים.

3. נוגדן צביעת תאים למשטח סמני תא האנדותל הלימפה לcytometry הזרימה

1. לאחר שהתאים הגיעו מפגש 80%, בינוני לשאוב ותאי שטיפה עם PBS.
2. ניתוק תאים חסיד ידי דוגרים תאים עם 7 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא כגון Accutase לבקבוק 150 סנטימטר ² 5-7 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
3. קציר תאים מנותקים, להשבית את פתרון ניתוק תא על ידי הוספת 3 כרכים של מדיום תא האנדותל ולהעביר את ההשעיה תא צינור סטרילי חדש.
4. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות.
5. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים 5 מיליליטר של PBS. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, להסיר את יםupernatant לאחר מכן לחזור לשטוף תא. מחדש להשעות את התאים ב 5 מיליליטר של PBS.
6. לספור את מספר תאי קיימא. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 90 μl של 0.4% trypan כחולים. ההעברה 10 μl של השעיה זו לhemocytometer לספירה.
   הערה: תשואת התא הסופית תהיה תלויה בגודל מדגם מעובד. התשואה הרגילה התא לטווחים של 150 סנטימטר ² בקבוק מ7 x 10 ^5-1.2 x 10 ⁶ תאי קיימא.
7. הכן את פתרונות נוגדן למכתים תא.
   הערה: דילולים הבאים טיטרציה למכתימים 1 x 10 ⁶ בצביעת נפח של 100 μl.
   1. עכבר לדלל PE מצומדות VEGFR-3 אדם אנטי (01:50); CD34 PE-Cy7 העכבר מצומדות אנטי האנושי מצומדות (1: 200); CD31 APC-מצומדות עכבר אנטי אנושי (1: 100) וAlexa אדם אנטי עכברוש 488 מצומדות- PODOPLANIN (1: 200) בהיקף כולל של 100 μl 5% FBS סטרילי / פתרון PBS לדגימה רקמה. בעקבות הכנתפתרון נוגדן, לשמור על קרח עד לשימוש. כמו כן להכין תערובת נוגדני שליטת אלוטיפ מדוללת כדי להקל על הגדרה של זרימת cytometry שערים.
8. כדי להפחית ספציפי מחייב של הנוגדנים, תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות, להסיר supernatant אז להשעות את התאים 100 μl 5% FBS סטרילי / פתרון PBS לדגימה להיות מוכתם. דגירה תאים על קרח למשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
9. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, להסיר supernatant אז מחדש להשעות תאים בקוקטייל הנוגדנים מצומדות. גם להכתים aliquot קטן יותר של תאים (1 x 10 ⁵⁾ בתערובת נוגדני שליטת אלוטיפ 100 μl. דגירה תאים על קרח למשך 20 דקות.
10. כדי להסיר את הנוגדן מאוגד, להוסיף 2 מיליליטר של 2% FBS / פתרון PBS ו צנטריפוגות התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וחזור לשטוף.
11. Resuspend התא גלולה לשליטה אלוטיפ ומדגם הנוגדן מוכתם להיות מסודר ב300 μl של 0.5 מ"ג / מיליליטר propidium iodide / 2% FBS פתרון / PBS. מניחים צינורות על קרח עד מיון.

4. מיון תא

1. השתמש בחומרים הבאים כדי להגדיר את המכשיר; חרוזים יישור כגון חלקיקים זמינים מסחרי ניאון, נוזל נדן מלוח מבוסס פוספט וחרוזים עיכוב ירידה, כגון חרוזי ניאון Accudrop.
2. לבודד את LECs האנושי המטוהר במכשיר סלולארי מיון הקרינה המופעל רב פרמטר. להגדיר את המכשיר וליישר לפי המלצות יצרן. בנוסף, להפעיל פקדי פיצוי כתם יחידים עם כל סוג כדי ליצור את מטריצת פיצויים ובכך לחסל את הדימום משמעותי בפליטה של ​​fluorochromes כגון PE לערוץ PE-סי.
   הערה: שיעור גבוה יותר של FACS מיון תאים לשרוד הבידוד אם נחיר 100 מיקרומטר משמש ותאים מסודרים לתוך מדיום תא האנדותל.

5. תא מיין תרבות ההודעה FACSING

1. בעקבות, תאי צנטריפוגה מיון ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וresuspend התאים 5-10 מיליליטר של תקשורת (תלוי בבקבוק המשמש לזרע התא). אם פחות מ -50,000 תאים מסודרים, התאים בתרבית פיברונקטין מצופה 25 סנטימטר ² בקבוק.
2. אחרת תרבות התאים בבקבוק ² מצופה פיברונקטין 75 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% humidified אוויר CO _2,. שינוי תקשורת לאחר 2 ימים.
   הערה: תקשורת נייד משתנה בכל יום שני כי הארכת הזמן בין שינויי תקשורת מופיעה להעדיף הישרדות של התאים הלא-אנדותל. אנו לאמת את הפנוטיפ תא האנדותל הלימפה באמצעות זיהוי immunohistochemical של סמנים: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 וCD31 כאשר התאים פיצול ראשון להרחבה נוספת ^15.

תוצאות

בעקבות עיכול רקמה ראשוני, לאחר 24 שעות בתרבות של דגימות unfractionated, ניתן לצפות מושבות תאי אנדותל שונות (איור 2 א) יחד עם תאים כמו פיברובלסטים ותאי שריר חלק. בעקבות מיון ולאחר 24 שעות בתרבית תאים, CD34 ^נמוך CD31 ^ממוצע VEGFR-3 התאים ^ממוצע Podoplanin ^ממוצע ל...

Discussion

LECs לשחק תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס נוזל, תגובה חיסונית לאנטיגנים זרים וקליטה והובלה של כמה חומרים מזינים. הומאוסטזיס הבקר יכול להיות מושפע מתהליכי מחלה כגון זיהומים חיידקיים וגרורות סרטניים, אך LECs יכול גם לפתח מוטציות סומטיות שתגרומנה להיווצרותם של כלי הלימפה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C	R&D Systems	2179-VC-025	Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F2006	Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Used as a viability stain.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Used at 0.04%
Collagenase II	Worthington Lab	4176	Used at 0.25%
DNase I	Roche Applied Biosciences	11284932001	Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers	BD Falcon	352350
[header]
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59	BioLegend	356204	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581	BioLegend	343516	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59	BioLegend	303116,	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80.	BioLegend	337006	Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400112	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400126	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400120	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758	BioLegend	400525	Used at 1:200 dilution