JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את היישום של אולטרסאונד בתדר גבוה (HFUS) לבלוטות לימפה בצוואר הרחם עכבר הדמיה. טכניקה זו מייעלת הדמיה וכימות של מורפולוגיה בלוטה לימפה בצוואר הרחם, נפח וזרימת דם. ביופסיה מונחה הדמיה של בלוטות לימפה בצוואר הרחם ועיבוד של רקמה לימפה להערכה היסטולוגית הוא הוכיח גם.

Abstract

אולטרסאונד בתדר גבוהים (HFUS) מועסק באופן נרחב כשיטת לא פולשנית להדמית מבנים אנטומיים פנימיים במערכות חיים קטנות ניסיוניות. יש HFUS את היכולת לזהות מבנים קטנים כמו 30 מיקרומטר, רכוש שנוצל להמחשת בלוטות לימפה שטחיות במכרסמים בבהירות -mode (B). כוח דופלר שילוב עם הדמיה B-מצב מאפשר למדידת זרימת דם במחזור הדם בתוך בלוטות הלימפה ואיברים אחרים. בעוד HFUS נוצל להדמיה בלוטה לימפה במספר המערכות במודל עכבר, פרוטוקול מפורט המתאר הדמיה HFUS ואפיון של בלוטות לימפה בצוואר הרחם בעכברים כבר דיווח. לא כאן, אנו מראים כי HFUS ניתן להתאים כדי לזהות ולאפיין בלוטות לימפה בצוואר הרחם בעכברים. B-מצב משולב וההדמיה דופלר הכח יכולים לשמש כדי לזהות עלייה בזרימת דם בבלוטות צוואר רחם מערכת חיסון-מוגדלים. כמו כן, אנו מתארים את השימוש של הדמיה B-מצב לנהל ביופסיות מחט דקות של הלימפה בצוואר הרחם לאdes כדי לאחזר רקמת הלימפה לניתוח היסטולוגית. לבסוף, צעדים בעזרת תוכנה מתוארים לחשב שינויים בהלימפה צומת נפח ולדמיין שינויים במורפולוגיה בלוטה לימפה הבאים שחזור תמונה. היכולת לעקוב אחר שינויים חזותי בביולוגיה בלוטה לימפה בצוואר הרחם לאורך הזמן מספקת טכניקה פשוטה ורבה עוצמה לניטור לא פולשני של שינויים בקשרים לימפה בצוואר הרחם בעכברי מודל פרה-קליניים של מחלת חלל פה.

Introduction

ניקוז הלימפה של נוזל רקמת ביניים הוא השיטה העיקרית של הפצה למיקרואורגניזמים זיהומיות וסרטן שמקורם באזור הפה ולסתות 1,2. הערכה קלינית של בלוטות לימפה בצוואר הרחם היא למעשה אבחון נפוץ המשמש לקביעת קיומו או התקדמות של מחלות שמקורן בחלל הפה. זה מדגיש את החשיבות של בלוטות לימפה בצוואר הרחם איסוף כאתרים אנטומיים חשובים למחלת פה אבחון 3. מתודולוגיות הדמיה מתמחה כמה מנוצלות קלינית לזיהוי בלוטות הלימפה בצוואר הרחם חולה. אלה כוללים טומוגרפיה פוזיטרונים פליטה (PET), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) והדמיה בתהודה מגנטית (MR). בעוד יקר מאוד, כל השיטות האלה דורשות הכנה נרחבת מטופל, ציוד מיוחד מאוד ו / או עירוי כימי למחזור הדם כדי להפעיל או לשפר את תהליך ההדמיה.

ההדמיה אולטרה- סאונד (אולטרסאונד; ארה"ב) היא טכניקה נפוצה המשמשת למיושמת imבלוטות לימפה בצוואר הרחם גיל הצגה עם בלוטות הלימפה עקב זיהום או מעורבות גרורתית 4-6. ארה"ב לעתים קרובות בשילוב עם PET-CT וההדמיה MR לספק ייצוג מקיף של מצב בלוטה לימפה מטופל, עוזר לקבוע בימוי גידול וצורך בכריתה כירורגית 7. הטבע לא פולשנית של ארה"ב יש גם יתרונות הגלומים על שיטות הדמיה אחרות, כוללים קלות שימוש, עלות נמוכה, אי נוחות מטופל מינימאלית והכנה. המיקום תת עורית השטחית של בלוטות לימפה בצוואר הרחם ביותר מאפשר לארה"ב כדי להנחות ביופסיות שאיפת מחט דקות פולשנית עם דיוק מוגבר, שיפור דיוק אבחון 8.

בתדירות גבוהה מסחרית (HF) בארה"ב מספקת רזולוציה מפורטת של מבנים אנטומיים הפנימיים עד 30 מיקרומטר 9. באמצעות חיישני הנעים 22-70 MHz, HFUS כבר מיושם בקלות למגוון רחב של מערכות מכרסמים ניסיוניות כדי לאפשר הדמיה של איברים פנימיים בגוף חי בזמן אמת.; HFUS הותאם להדמיה של היווצרות גידול ב-mode הקונבנציונלי בהירות (ב '), כמו גם עם מספר agents9 שיפור לעומת כללי ומיוחד. שימוש בדופלר כוח עם HFUS מספק את היכולת לעקוב אחר זרימת דם בתוך גידולי עכבר, המאפשר הערכה מקיפה של זלוף angiogenic בעכברים חיים 10,11. HFUS נעשה שימוש כדי להמחיש בלוטות הלימפה עכבר חולות בתוך חלל הגוף העיקרי, מדגים שירות מקביל של טכנולוגיה זו לפרקטיקה קלינית. בשינויים בקשרים לימפה הקרביים בפרט, דלקתיים וגרורתי נצפו בעכברי מודל של סרטן שד מחסה 12,13, 14, מעי גס וסרטן ריאות 15 16 גידולי לבלב, כמו גם histocytomas הסיבי 17, ומודל עכבר בגיל של הידרונפרוזיס רכש 18 . דוגמאות אלה לחזק את הערך של HFUS ככלי רב עוצמה לחקירת בלוטות הלימפה נגרם גידול במגוון רחב של roמערכות שקע.

מספר דגמים של זיהום חיידקי 19,20 וראש וקרצינומה של תאי קשקש צוואר (HNSCC) 21,22 פותחו ללמוד מחלות אלה בהגדרה פרה-קלינית. בניגוד לבני אדם, עכברים מכילים שלוש בלוטות לימפה בצוואר הרחם שתסקורנה הלימפה מרקמות פה חלל (לסת, לסת תחתונה, submandibular והפרוטיד שטחי 23). לאחרונה, דיווחנו על השימוש בHFUS כדי למפות את המיקום ומורפולוגיה של בלוטות לימפה אלה, מעקב אחר שינויים בהלימפה צומת זרימת דם נפח ובמודל של עכברים הנגרמים מסרטן של HNSCC 24. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בHFUS לזיהוי, הדמיה וניתוח בלוטות לימפה בצוואר הרחם בעכברים חיים. פרוטוקול זה גם מדגים את הכדאיות של שימוש HFUS לנהל ביופסיה לדימוי מודרכת בסדר מחט של בלוטות לימפה בצוואר הרחם עכבר מוגדל, המאפשר ניטור היסטולוגית של שינויים בתוכן בלוטה לימפה בצוואר הרחם ופתולוגיות על tIME באותו בעלי החיים. פרוטוקול זה הוא ישים בקלות, כדי לאפשר מחקר מפורט של בלוטות לימפה בצוואר הרחם פתולוגיות תוצאה מכל מחלה חלל פה פולשנית בעכברים.

Protocol

נהלי כל החיה הפגינו בפרוטוקול זה כבר נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה המערבית תחת פרוטוקולי 11-0412 ו14-0,514 ונערכו בהתאם לעקרונות והנהלים המפורטים במדריך NIH לטיפול והשימוש של בעלי חיים.

1. הכנת בעלי החיים

  1. הרדימי עכבר אחת בתא אינדוקציה באמצעות isofluorane 3% מעורבבים עם 1.5 ליטר / דקה 100% חמצן. הסר את החיה מחדר האינדוקציה והמקום במצב שכיבה על פלטפורמת ההדמיה שחומם מראש ל 40 מעלות צלזיוס ומתוחזק בין C ° 37-42 (איור 2 א). לאשר הרדמה על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן.
  2. מקם את חוטם העכבר בתוך nosecone המחובר למערכת ההרדמה. החל הרדמה כדי לשמור על הרגעה מצב יציבה (isofluorane 1.5% מעורבבים עם 1.5 ליטר / 100% חמצן דקות).
  3. החל סיכה עין כל עין כדי למנוע מתייבשיםז. החל ג'ל אלקטרודה לאלקטרודות ולהשתמש בקלטת כדי לאבטח כל אחת מארבע כפות לאלקטרודה המקבילה. רפידות אלקטרודה תשדר א.ק.ג. של החיה למערכת ההדמיה כדי לאפשר ניטור של קצב לב וקצב נשימה. לשמן והכנס את הבדיקה הטמפרטורה רקטלית לניטור רציף של טמפרטורת גוף. טמפרטורת גוף עכבר רגילה היא 36.9 מעלות צלזיוס. 1-2 הווריאציה מעלות צלזיוס היא נורמלית ואילו בהרדמה.
  4. השתמש קרם מקריח להסיר את הפרווה מהצוואר של העכבר. יש לשטוף את אזור הצוואר עם גזה ספוגת מים כדי להסיר שיער וקרם מקריח עודף. לחלופין, להשתמש ביישום נוסף של קרם מקריח כדי להסיר כל שיער גוף הנותר (איור 2).

2. זיהוי ותמונת רכישה של עכבר צוואר הרחם בלוטות הלימפה שימוש HFUS

  1. כדי להתחיל, למרוח שכבה של ג'ל אולטרסאונד חימם לאזור הצוואר נטול פרווה. להשתמש ביישום ליברלי של ג'ל לתמונה אופטימליתאיכות (איור 2 ג). הימנע החדרת בועות אוויר בג'ל במהלך יישום, שיכול להפריע להדמיה קולית.
  2. התאם את פלטפורמת ההדמיה 20-30 מעלות כך העכבר ממוקם עם הראש המוגבה מעט. עמדה זו מסייעת להבטיח קצב הנשימה האופטימלי לעכבר. מניחים את מתמר 40 MHz רוחבי במערכת ההרכבה ומוריד אותה בזהירות עד שמול scanhead המתמר הוא שקוע בג'ל אולטרסאונד (איור 2 ג).
    הערה: הקפד לא לשים את הלחץ מוגזם על צוואר העכבר, מכיוון שזה עלול לגרום למצוקה נשימתית מופרזת. בנוסף, זה מועיל להדמיה יש חיץ של ג'ל בין המתמר והעכבר.

הדמיה B-Mode ואיתור של בלוטות לימפה:

  1. שימוש במחשב השליטה תוכנת רכישת HFUS, להתאים את הבהירות (B-) הגדרות מצב לפרמטרים הבאים: קבל 22 dB, עומק 10.00מ"מ, רוחב 14.08 מ"מ.
    הערה: הגדרות אלה הציעו נקודת התחלה, ועשויות לדרוש התאמה קלה לרכישת תמונה אופטימלית בין יישומים שונים. שים לב בלוטות לימפה בצוואר הרחם נורמליות כמבני hypoechoic סגלגלים קרובים לפני שטח העור בתוך שדה hyperechoic שמסביב. המראה של בלוטות הלימפה נגועות יכול להשתנות בין דגמים. לשיטתי תמונה כל בלוטות הלימפה באזור הצוואר בצע את הפעולות הבאות:
    1. השתמש בציר Y כדי לסרוק את הצוואר בגולגולת לזנב אופן כלפי אזור בית החזה. השתמש ציר ה- X כדי למרכז את התמונה.
    2. לזהות ציוני דרך עיקריות: חלל לחי, לשון, ובלוטת תריס (איורים 3 א, B ו- C; בהתאמה); להטות את פלטפורמת ההדמיה כדי להתאים את פני השטח הגחון של צוואר העכבר אופקי, מה שהופך את שני הצדדים של הצוואר מופיעים גם בתמונה B-המצב. הסכום של הטיה תלוי בפיסיולוגיה של כל עכבר בודד.
  2. לבצע סריקת 3D של האזור כולו הצוואר מאזור החלל / לשון buccal לבלוטת התריס, כדי למפות בלוטות הלימפה ואתרים הקשורים בכל רחבי הצוואר.
    1. אתר את הלשון / אזור לחי החלל (איור 3 א) וזכור את המיקום המספרי בסולם Y.
    2. אתר בלוטת תריס (3C איור) ולציין את המיקום המספרי בסולם Y.
    3. לחשב את ההפרש בין הערכים שהתקבלו ב( 2.4.1) ו- (2.4.2) כדי לקבוע את האורך הכולל במ"מ לאזור צוואר הדמיה.
    4. השתמש בכפתור Y כדי למרכז את המתמר על נקודת האמצע של האורך הכולל הנחוש.
    5. לחץ על "3D". הזן את האורך הכולל. לגודל צעד 3D, להשתמש .076 מ"מ לרכוש מחסנית סדרת תמונה לכל אזור הצוואר.
  3. ברגע שהסריקה הושלמה, בחר בימין או בצד שמאל של הצוואר ולמרכז את המתמר על בלוטות לימפה בודדות של עניין, אז להעלות את 4מתמר 0 MHz את העכבר. הסר את מתמר 40 MHz ולהחליף עם מתמר 50 MHz microscan (גם במצב רוחבי) כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה יותר. לחדש את ג'ל אולטרסאונד על צוואר העכבר ולהוריד את מתמר 50 MHz לג'ל אולטרסאונד.

3D כוח דופלר הדמיה

  1. התנהלות 3D סורק עם הכח דופלר לישבני נפח וכלי דם של בלוטות לימפה בצוואר הרחם פרט כדלקמן:
    1. לחץ על לחצן ההפעלה במקלדת מערכת לרכוש Dopper כוח ולהתאים את הגדרות צריכת חשמל במצב הבאות: KHz PRF 4, דופלר להשיג 34 dB, 2D רווח 30 dB, מ"מ 5.00 עומק, מ"מ 4.73 רוחב. הערה: כמו בעבר, הגדרות אלה הן נקודת התחלה הציעה ועשויה להיות שונה, בהתאם לצורך לרכישת תמונה אופטימלית בדגמים שונים.
    2. אתר את הגולגולת ביותר הנקודות של הבלוטה לימפה של עניין וזכור את המיקום בסולם Y.
    3. אתר את נקודת הזנב ביותר של אותה הצומת ופתקהמיקום בסולם Y.
    4. לחשב את ההפרש המרחק כדי לקבוע את האורך הכולל של בלוטות לימפה (ראה שלב 2.4.3).
    5. מרכז את המתמר על נקודת האמצע של האורך הכולל הנחוש, באמצעות מיקום Y בקנה המידה.
    6. לחץ על "3D" ולהיכנס כולל אורך בלוטה לימפה. השתמש .051 מ"מ לגודל הצעד.
      הערה: בשל הקרבה של המתמר לאזור החזה, מתמר 50 MHz עלולה לגרום לתמונת דופלר לא יציבה בשל זיהוי של תנועת נשימה רגילה. זה ניתן למנוע על ידי שימוש באפשרות "נשימת gating" זמינה תחת הלשונית "פיזיולוגית".
    7. מקיף את הבלוטה לימפה הנבחרת עם התיבה הצהובה שמייעדת את האזור להיות מנותחים על ידי דופלר כוח ובחר "סריקת 3D" לרכוש תמונות. להעלות את מתמר הנחה של העכבר ולהעביר אותה לצד השני של הצוואר. מנמיכים את המתמר על העכבר ולחזור על השלבים שתוארו לעיל להר"יבלוטות לימפה GE בצד הזה של הצוואר.
  2. להציל את סטי תמונה לניתוח שלאחר מכן.

3. צוואר הרחם לימפה צומת ביופסיה

  1. בחר את הבלוטה לימפה הרצויה לביופסיה ולשמור הדמיה HFUS עם מתמר 50 מגה-הרץ. בחר הבלוטה לימפה בצוואר הרחם גלויה הגדולה ביותר בכל צד של צוואר העכבר. הגדלת בלוטות לימפה בדרך כלל מצביעה על תגובה דלקתית, ולכן צמתים כאלה הם מועמדים אידיאליים לביופסיה.
    הערה: מצאנו את זה מאוד קשה לנהל ביופסיות בבלוטות צוואר רחם קטן מ -10 מ"מ 3.
  2. הכן את המחט ומזרק לביופסיה על ידי הצבת מזרק 1 מיליליטר עם 27 G המצורף, מחט 0.5 אינץ 'לבעל המזרק. התאם את בעל המחט כדי לכוון את המחט 90 מעלות לצוואר העכבר (איור 4 א).
  3. הכן על ידי הרמת כל פלטפורמת העכבר לרמה של המחט. להשיג זאת על ידי הסרת מנוע 3D ומיתוג לplatf גבוההORM, או על ידי הצבת אובייקט מוצק של גובה המתאים תחת הפלטפורמה הקצרה סיפקה. השתמש מתלה צינור microfuge פלסטיק למטרה זו. אם יש צורך, לסובב את הפלטפורמה 180 מעלות כדי בלוטות ביופסיה ממוקמות בצד של הצוואר הפוך למנגנון המחט.
  4. התאם את הגדרות רכישה על ידי בחירה "העדפות", ולאחר מכן על-ידי בחירה "מקס & מאגר מורחב". הגדלת שדה הראייה עד לעומק של 8.00 מ"מ ורוחב של 9.73 מ"מ. הפעל את מדריך המחט באמצעות מקשי מסך חיוג. מדריך המחט יהיה לחזות את דרכו של המחט על המסך ומאפשר למשתמש בשורה הבלוטה לימפה של עניין במיקום הנכון לביופסיה.
  5. ודא שהבלוטה לימפה נשארת כל הזמן בתצוגה על ידי מרכוז הבלוטה לימפה באמצע או מעט שמאלה מהמרכז במסך (איור 4). כדי להשיג את כל לולאת הקולנוע של ההליך, לחץ טרום הדק על מקלדת המערכת לפני תחילת הביופסיה.
  6. התאם את בעל המחט עד קצה המחט מגיע לעין ואנשי קשר העור (איור 4). לקדם את המחט עם חברה, מהר לדחוף לנקב את העור. תמשיך לקדם את המחט עד הקצה גם מפוצץ את הקפסולה (איור 4C) וגלוי בתוך הלשד (איור 4D).
  7. ברגע שהמחט נמצאת בתוך כראוי את הצומת, משוך בעדינות את בוכנת המזרק בחזרה בין 200-300 demarcations μl לנהל הביופסיה (איור 4D ו4E). שים לב שחומר הביופסיה הוא בדרך כלל לא נראה לעין בתוך המזרק.
  8. הוצא בעדינות את המחט מצוואר העכבר. לגרש את תוכן המזרק לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge. הסר את המחט מהמזרק, ומשאיר את המחט בצינור. לאסוף 1 מיליליטר של תקשורת ביופסיה (מaliquot, נפרד ממניית המקור) עם אותו המזרק, ולאחר מכן לצרף את המחט למזרק, תוך שמירה על המחט בהצינור דואר.
    1. יש לשטוף את המזרק ומחט עם תקשורת הביופסיה ידי גירוש תקשורת הביופסיה לתוך הצינור.
      הערה: אל תמשכי בחזרה על הבוכנה בעוד המחט מחוברת בכל נקודה לאחר הביופסיה. פעולה זו מפחיתה את הסיכון של אובדן חומר הביופסיה בשל גודל המדגם הקטן.
  9. אשר תוכן בלוטה לימפה באמצעות היסטולוגית (איור 4F) ולנתח בשיטות נוספות (היסטוכימיה, cytometry זרימה, וכו ') כמתאים.
  10. ברגע שהביופסיה היא שלמה, לכבות את ההרדמה ולהסיר את הבדיקה הטמפרטורה רקטלית. הסר ג'ל אולטרסאונד העודף מעכבר עם גזה ולהסיר את הסרט מכל כף.
  11. הסר את העכבר מפלטפורמת ההדמיה ולחזור לכלוב. דימום מינימאלי מאתר של ביופסיה עלול להתרחש, אבל זה מפסיק ללא התערבות. לפקח על העכבר במהלך התאוששות עד פעילות מלאה תתחדש.

4. ניתוח תמונה של בלוטות לימפה צוואר הרחם

  1. בתוכנת אולטרסאונד, לבחור את התמונה לניתוח ולנווט לכרטיסייה "עיבוד תמונה". בחר "טען ל3D".
  2. בחר "תמונת 3D משוחזרת" בפינה השמאלית עליונה, לחיצה על הכפתור "הצג חלונית יחידה". השתמש בפונקצית הזום להגדלת התמונה אם תרצה בכך. Toggle "פריסת תצוגה" כדי להציג את התמונה רק בB-מצב, אשר מסיר את שכבת דופלר הכח מתצוגה. זה עושה את זה קל יותר לראות את הקצוות של בלוטות לימפה בניתוח 3-D שלאחר מכן. גלול בסדרת התמונה כדי לאתר את תחילת הבלוטה לימפה.
  3. להותיר את הבלוטה לימפה, לנווט לכרטיסיית "הגדרות 3D". בחר "נפח", ולאחר מכן על הכפתור "התחל" "המקביל" לצד.
  4. לצייר קווי המתאר מסביב לאזור של ריבית בתמונות בודדות על ידי גלילה. המשך עד תמונות שתקפנה את כל בלוטות לימפה מסומנות. בחר "סיום" ללהשלים את הניתוח.
  5. בחלק התחתון של התמונה, כלי דם ונפח% 3D יוצגו באופן אוטומטי.
    הערה: 3D נפח מתאים לימפה צומת הנפח, וכלי דם אחוזים מייצגים את אחוז הבלוטה לימפה החיובית לזרימת דם על ידי דופלר כוח.
  6. Toggle "פריסת תצוגה" כדי להציג ההדמיה דופלר הכח כשכבת על תמונת B- המצב. במבט המשטח להתבונן תצוגה נקי של אזור הנפח של עניין. לייצא את התמונות בסריקות בפורמט 3D או קובץ תמונה (TIF) מתויגות כסרטים (.אבי) לשימוש נוסף.

תוצאות

סכמטי הכולל לנוהלי ההדמיה וביופסיה מוצג באיור 1. השלבים העיקריים בהליך כוללים הכנה נכונה של העכבר להדמיה, זיהוי של בלוטות הלימפה בצוואר הרחם, הכנה נכונה וביצוע של ביופסית המחט, וניתוח של B תמונות -mode ודופלר למדידת נפח וכמות כלי הדם בתוך כל צומת שנבחרה באמצעות תוכנת מחשב.

ההדמיה HFUS של בלוטות לימפה בצוואר הרחם עכבר דורשת יישום והתחזוקה של הרדמה תקינה לאורך כל תקופת ההדמיה (איור 2 א), וכן הסרת השיער מכסה את אזור הצוואר השלם (איור 2) מלאה. היישום הליברלי של ג'ל אולטרסאונד באזור המקולף מבטיח אות HFUS ברורה במהלך ההליך (איור 2 ג).

ההדמיה HFUS של אזור הצוואר מסתייעת ההדמיה של ציוני דרך אנטומי צוואר רחם המייצרים תמונות אולטרה- סאונד אופייניות. איור3 מציג דוגמאות של האיברים המרכזיים (איור 3 א-ג), בלוטות לימפה בצוואר הרחם בB-מצב (איור 3D) ובמצב דופלר הכח (איור 3E).

ההדמיה HFUS בזמן אמת בעכברים מורדמים מאפשרת לביופסיה מחט דקה מודרכת בלוטות צוואר רחם דומות למה שמתנהל בפרקטיקה קלינית. מיקום של מחט הביופסיה ומזרק אוסף מצורף לציוד microinjector השליטה מוצג באיור 4 א. תמונות אולטרה- סאונד B-מצב לאחר להראות מיקום אידיאלי מחט לפני ביופסיה (איור 4), כניסת קצה מחט לתוך בלוטה לימפה בצוואר הרחם (איור 4C), ומיקום מחט במהלך הביופסיה (איור 4D). תקריב תמונה מראה את קצה המחט בתוך הלשד של בלוטות לימפה (איור 4E). עיבוד של רכיבי ביופסיה על ידי cytospin מגלה אשכולות שופעים תאי הלימפה ורקמות חיבור הקשורים, אימות בלוטה לימפה מוצלחתביופסיה (איור 4F).

ניתוח של תמונות HFUS מבוססת חישובית מאפשר למידע מפורט שיתקבל בנוגע לארכיטקטורה לימפה צומת, נפח וזרימה בכלי דם. שימוש במצב דופלר הכח ומדידות נפח 3D, כלי דם אחוזים (PV) ניתן לחשב סדרת תמונה מקיפה כל צמתים (איור 5 א) מ. בנוסף, ההדמיה 3D מאפשרת לשיקום בלוטה לימפה וירטואלי, חושפת טופוגרפיה בלוטה לימפה כוללת (איור 5).

figure-results-2217
איור 1:. סכמטי סקירה של השלבים כרוכים בבלוטות לימפה בצוואר הרחם ההדמיה HFUS אבחון בעכברי השלבים העיקריים כוללים 1: הכנת עכברי הדמיה HFUS וקבלת 40 ו -50 תמונות ברזולוציה MHz של אזור הצוואר המכיל את בלוטות הלימפה בצוואר הרחם שלושה עכבר . 2: ביופסיה מונחה הדמית מחט העדינה של בלוטות לימפה בצוואר הרחם וניתוח היסטולוגית הבא של ביופסיה חומר. 3: ניתוח תמונה בעזרת מחשב ושחזור 3D של תמונות בלוטה לימפה שהתקבלו בB-מצב ודופלר כדי לקבוע את התאמת הבלוטה לימפה נפח ואחוזים (%) של זרימה בכלי דם.

figure-results-2841
איור 2:. סקירה של הרזולוציה הגבוהה במערכת מיקרו-vivo הדמיה להערכת בלוטות לימפה בצוואר הרחם וביופסיה () מערכת HFUS מוצגת עם עכבר הרדים מוכן להדמיה בלוטה לימפה בצוואר הרחם. כמו כן מוצג הוא microinjector (MI) ושלב 3D-מוטורי ציוד אבזר (MS 3D). (ב) סגור את התצוגה של עכבר הרדים מוכן להדמיה HFUS עם שיער הוסר באזור צוואר. אותו העכבר עם מתמר 50 MHz במקום בצוואר (C). שים לב לג'ל אולטרסאונד הנוסף המשמש כדי להקל על הדמיה אזור צוואר.

718fig3.jpg "/>
איור 3: HFUS נציג תמונות האנטומיה צוואר רחם בB-מצב ודופלר הכח. (A, B) תמונות B-מצב של חלל הפה, המציגות את חלל buccal (BC) ולשון (T) דמיין ידי הדמיה הקרובה ביותר לחלל האף. שלוש בלוטות לימפה בצוואר הרחם נמצאו בכל צד של הצוואר (שכותרתו M, לסת; SM, submandibular; SP, הפרוטיד שטחי), מופיע כקבוצה של מבני hypoechoic במטוס הדמיה יחיד, כפי שמוצג (ב '). בלוטת התריס (ה ') כדמיין באזור בית החזה העליון, המופיע כמבנה בצורת פרפר מוצק, echogenic (C). (AC) היה דמיין עם מתמר 40 MHz; סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (D, E) נציג תמונות של רגיל (ד) ו- (ה) בלוטות לימפה מוגדלות בצוואר הרחם עם B-מצב ודופלר כוח (אדום). קווים מקווקווים מתארים בלוטות לימפה בודדות. בר סולם = 0.5 מ"מ.

figure-results-4319
איור 4: הגדרת ביופסיה של בלוטת צוואר הרחם, הדמיה וניתוח cytospin חומר ביופסיה () פלטפורמת ההדמיה המציגה את מיקרו-המזרק ומיקום מחט ליד צוואר העכבר.. מדף רחב צינור microcentrifuge (בלוק כתום) משמש כדי להעלות מעט את הפלטפורמה, המאפשר מיקום מחט נכון תוך מתן מקום לבמת 3D-המוטורית. הסדר זה מצמצם את משך זמן הסרת השלב המוטורי לכל עכבר. (ב - ד) תמונות HFUS צוואר שלמות שנלקחו מוידאו של ביופסיה של בלוטת צוואר רחם באמצעות מתמר 50 מגה-הרץ. (ב) תמונת B-מצב HFUS מראה את המחט ממוקמת בצד של הצוואר לפני הביופסיה. קצה המחט הוא מבנה hyperechoic ממש מתחת לעמדה של מדריך המחט (קו מקווקו ירוק) גבי במהלך הדמיה כדי לציין את מסלול המחט. בלוטות לימפה היא במרכזהתמונה. בר סולם = 1 מ"מ. (ג) כניסת מחט לבלוטה לימפה. (ד) ביופסיה של בלוטות לימפה בצוואר הרחם. ביופסיה של בלוטות לימפה מוגדלת בצוואר רחם (E). בר סולם = 0.5 מ"מ. ניתוח (F) Cytospin של חומר לימפה ביופסית נציג המאשר ביופסיה מוצלחת. בר סולם = 100 מיקרומטר.

figure-results-5493
איור 5:. ניתוח ממוחשב של תמונות בלוטה לימפה בצוואר הרחם 3D () מסך נציג של בלוטה לימפה נותח באמצעות תוכנת מחשב. הצומת היא מוגבלת בכחול; תוצאות הניתוח מראות נפח 3D וכלי דם אחוזים (PV) כפי שצוין. צפייה בתמונה בשטח של אותו צומת לאחר ניתוח 3D (B). הופך נפח שלם של בלוטה לימפה מבוסס על מדידות שנלקחו ב.

Discussion

הפרוטוקול המתואר מאפשר הדמיה ובהערכה באתרו של בלוטות הלימפה בצוואר הרחם בעכברים באמצעות ההדמיה HFUS לא פולשנית. השימוש בB-מצב וההדמיה דופלר כוח לדמיין מורפולוגיה בלוטה לימפה בצוואר הרחם, זרימת דם ונפח הבלוטה לימפה מספקת לניתוח ניסיוני של מערכות מודל עכבר פרה-קליניים דומות לזה המשמש לאפיון של בלוטות מטופל צוואר רחם בפרקטיקה קלינית. היכולת לפקח על בלוטות לימפה cervial באמצעות ביופסית מחט דקה מספקת גם טכניקה שימושית לאיתור שינויי תא חיסון ואת הנוכחות של סוגי תאים זרים או חיידקים במהלך lymphadenopathies מושרה המחלה חלל פה בעכברים. קלות שימוש ועלות נמוכה הקשורים HFUS מאפשרת הסינון המהיר של מצב בלוטה לימפה בצוואר הרחם במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים.

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא זיהוי המוצלח הראשוני של בלוטות לימפה בצוואר הרחם בתמונות HFUS. המתקן שלנו יש מבחר של טראן HFUSsducers כפי שתואר, ולכן אנחנו לא השתמשנו בהם כדי להשיג את התמונות באיכות הגבוהות ביותר. עם זאת, אם מתמרים אנו מתארים אינם זמינים, ניתן להתאים את ההדמיה באמצעות מתמרים אחרים. לצורך כך, התאמת עומק תמונה ורוחב כדי להשיג תמונה נאותה היא כל מה שנדרש. רזולוציה של תמונות כאלה עשויות להשתנות, אבל זה עדיין צריך להיות אפשרי כדי להשיג תמונות באיכות גבוהות באמצעות HFUS. ציוני דרך הדמיה של חלל הפה ובלוטת התריס יסייעו מאוד במכוון את המשתמש לאזור שבו הראוי בלוטות לימפה מקומיות. , הטבע האופייני הסגלגל hypoechoic והמיקום שטחי קרוב לפני שטח העור מאפשרים זיהוי מהיר של מאשרים את בלוטות הלימפה בצוואר הרחם באזור הצוואר הנכון. בעוד שכל שלושת צמתים יכולים להיות גלויים במטוס הדמיה יחיד (איור 3), בדרך כלל אחד או שתיים הצמתים שנתפסו במשך הדמיה. התאמות קלות של העמדה רגשי יכולות להתנהל לקרועאה הדמיה שונה מטוסים גלויים, המאפשרים הדמיה של כל צמתים בצד אחד של הצוואר.

אמנם יש לנו מצאנו את הטכניקה המתוארת אמינה לזיהוי בלוטות הלימפה בצוואר הרחם, יש מגבלות מסוימות לטכניקת ההדמיה וביופסיה. הטבע השטחי של בלוטות לימפה בצוואר הרחם עכבר מקנה ניידות מופרזת כאשר אפילו לחץ קל מוחל על העור באמצעות הראש מתמר. זה יכול להיות נוטרל על ידי יישום לאט הראש מתמר לג'ל אולטרסאונד על צוואר העכבר עד תמונות אתר מזוהות. ניידות הבלוטה לימפה יכולה גם לסבך את ביופסית המחט דקה, במיוחד בעת שימוש במתמרת ברזולוציה גבוהה יותר טווח (50 מגה-הרץ). תמונות מרוכזות של בלוטות לימפה לביופסיה נדחפות בדרך כלל מחוץ לשדה הראייה עקב הכוח של מחט הביופסיה צריכה לנקב את העור שמעליה וכמוסה. זה ניתן לתיקון על ידי המיצוב מחוץ למרכז של הבלוטה לימפה לכיוון של כניסת מחט,מתן מקום לבלוטה לימפה שדחף לרוחב, אבל עדיין להישאר בתוך שדה הראייה במהלך ביופסיה. מניסיוננו, בלוטות לימפה> 10 מ"מ 3 קשים מאוד לביופסיה, ולעתים קרובות הם נדחפים על ידי המחט ולא חדרו במהלך קידום מחט. לפיכך, ביופסיה שמורה לבלוטות לימפה מוגדלות שבו הגודל הוא> 10 מ"מ 3 כדי להבטיח גודל יעד צומת מספיק ויציבות באזור צוואר הרחם. בנוסף, חומר ביופסיה אינו יכול להכיל מספרים סלולריים מספיקים לנהלים שבו מספרים סלולריים גדולים נדרשים (לדוגמא, cytometry זרימה).

HFUS נעשה שימוש כדי להמחיש בהצלחה HNSCC orthotopic גידולים 25, ויש לו הפוטנציאל לפקח גרורות צומת צוואר רחם בעכברים עם גידולים אוראליים 24. בנוסף לאולטרסאונד, הדמיה פליטת אור שימשה גם כדי לחזות היווצרות orthotopic אוראלית גידול וגרור בלוטה לימפה בצוואר הרחם בעכברים חיים 26,27. כalternגישה יצירתי, יש הדמיה פליטת אור יתרון בולט על פני HFUS ביכולת לכמת ישירות התקדמות גידול וניטל גרורתי לאורך זמן באותו בעלי החיים. בעוד ספק שימושי, הדמיה פליטת אור היא מסוגלת למדוד רב של הפרמטרים דמיינו ידי HFUS, כולל מורפולוגיה הלימפה צומת, כרכי קטרי או זרימת דם. הדמיה פליטת אור דורשת גם תיבות כהות מיוחדות כדי לשמור על עכברים במהלך הדמיה, עיבוד טכניקה זו אינה מתאימה להסתגלות לביופסיה מחט דקה.

יתר על כן, הדמיה פליטת אור דורשת ייצור של תאים סרטניים שיציבות להביע את האנזים בלוציפראז, המאפשר בטכניקה זו כדי לשמש רק במקרים של xenografts orthotopic עם תאים סרטניים-transfected לוציפראז בעכברי מדוכאי חיסון, או עם מערכות רקמות ספציפיות מושרה מהונדסים המגבילות את ביטוי לוציפראז באופן מרחב ובזמן ספציפי לרקמת המוצא גידול. לעומת זאת, HFUS יכול להיות used בשיתוף עם תמונות פליטת אור במודלים אלה, כמו גם להיות מסוגלים הדמיה בלוטות לימפה בצוואר הרחם במודלים של גידולים בעל פה נגרם מסרטן בעכברים בעלי מערכת חיסונית שלמה 28,29. בעוד HFUS עשוי להיות יותר וישימה ברוב דגמי עכבר של סרטן פה, בשילוב המידע שניתן להשיג מפליטת האור וההדמיה HFUS במערכות שבן תאים סרטניים להביע לוציפראז יכול לספק תמונה של מעורבות בלוטות לימפה בצוואר הרחם מאשר או שיטת הדמיה לבד מלאה יותר.

היכולת לזהות ולאתר בלוטות לימפה בצוואר הרחם עכבר בזמן אמת מאפשרת לטכניקה זו כדי לשמש ברוב הדגמים של מחלת פה שיגרמו לבלוטות הלימפה דלקתיות שבו החיה יכולה להישמר בעמדה הפוכה בהרדמה קצר טווח. זיהוי של גרורות בקשרים לימפה או זיהום חיידקים ואת ההשפעה הנלווית על מורפולוגיה בלוטה לימפה בבעלי חיים המתגוררים מציג יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיותהדורשים בלוטות לימפה ליוסרו מחיות מתות לעיבוד היסטולוגית. HFUS שילוב עם ביופסית מחט דקה מאפשר אמצעים לביצוע ניתוח פתולוגי שיגרתי של בלוטות לימפה בצוואר הרחם, בדומה למה שמתנהל במרפאת, מתן שיטה משופרת לניטור התקדמות מחלה ברוב דגמי עכבר הנוכחיים של מחלות חלל פה.

Disclosures

עלויות פרסום לכתבה זו בחסות Sonics החזותי.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן דור ד רדפורד קרן ממרי אוניברסיטת אב רנדולף מרכז סרטן המערב וירג'יניה. השימוש במתקן המודלים והדמיה המערב וירג'יניה בעלי החיים אוניברסיטה (AMIF) ומתקן מיקרוסקופית הדמיה (MIF) (נתמך על ידי RR16440 P20 מענקי מרכז מרי אב רנדולף הסרטן וNIH, RR032138 P30 / GM103488 וS10 RR026378) הוא הודה בהכרת תודה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaVS-11945
Power Dopper Mode and 3D ModeVisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaVS-11952; VS-11484
Vevo compact anesthesia systemVisualSonics, Toronto, Ontario, Canada
Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injectionsVisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaSA-11983
Thermasonic Gel WarmerVisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaOptional
Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz)VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaVS-11960Referred to as 40 MHz Transducer
Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz)VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaVS-12026Referred to as 50 MHz Transducer
Ophthalmic OintmentPatterson Veterinary07-888-1663
Electrode gelParker Laboratories174-1525
TapeMedical Arts Press174-153000
Depilatory CreamCarter Products
Cotton swabsGeneral Supply
GauzeFisher Scientific22-037-907
WaterGeneral Supply
Lubricating gelParker Laboratories57-05
Ultrasound gelParker Laboratories01-50
Microcentrifuge tube rackGeneral SupplyUsed to raise mouse platform for optimal biopsy position
27 G ½ inch needle with 1 ml syringeFisher Scientific14-826-87
ThinPrep PreservCyt SolutionHologic70097-002Refered to as biopsy media
Microcentrifuge tubesGeneral Supply
Thinprep 2000 processorCytyc, Marlborough, MABlue Filter
Olympus AX70 Provis MicroscopeOlympus, Center Valley, PA

References

  1. Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
  2. Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
  3. Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography - A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
  4. Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
  5. Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children--incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
  6. Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
  7. Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
  8. Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
  9. Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  10. Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
  11. El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
  12. Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
  13. Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
  14. Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
  15. Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
  16. Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
  17. Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
  18. Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
  19. Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
  20. Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
  21. Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
  22. Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
  23. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
  24. Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
  25. Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
  26. Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
  27. Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
  28. Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
  29. Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

101lymphnode

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved