לחץ-נפח לב ניתוח לולאה באמצעות מוליכות קטטרים בעכברים

Summary

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Abstract

Cardiac pressure-volume loop analysis is the “gold-standard” in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Introduction

ניתוח נפח לולאת לחץ לב מספק מידע מפורט של תפקוד לב ואת תקן הזהב להערכה תפקודית ^1. בעוד שיטות הדמיה כגון אקו או MRI של הלב לספק אמצעים פונקציונליים, אמצעים אלה תלויים מאוד בתנאי טעינה. צעדי עומס עצמאי של התכווצות והרפיה של הלב דורשים מדידות דינמיות של לחץ חדרית ויחס נפח על פני טווח של preload וafterload. הבנה זו של יחס לחץ-הנפח נובעת מעבודתו פורצת הדרך של Sagawa ועמיתי ^2,3. הם הפגינו בvivo לשעבר לב הכלבי perfused כי צעדי ההתכווצות נובעים לחץ-נפח הלולאה היו עצמאיים של תנאי טעינה ^4.

ביישום vivo של ניתוחים אלו התאפשרו עם ההתפתחות של צנתרים מוליכות בשנת 1980. מראש טכני זה אפשר קהss ועמיתים לבצע ניתוח לולאת לחץ-נפח בבני האדם ^5,6. מזעור של צנתרים מוליכות ושיפורים בטכניקות ניתוחיות בסוף 1990 ⁷ עשה ניתוח של תפקוד לב מכרסמים אפשרי, המאפשר למחקרים גנטיים ותרופתיים שיש לבצע. מראש זה מאז להוביל לשימוש הנרחב בניתוח לולאת לחץ-נפח ויצר הרבה תובנה הפיסיולוגיה של לב של יונקים.

מושג מפתח בשימוש בצנתרי מוליכות והפרשנות של נתונים המתקבלים ממנו הוא מערכת היחסים בין הנפח ומוליכות. מוליכות היא ביחס הפוך למתח, הנמדד באמצעות צנתר עם ​​אלקטרודות המונחות proximally, בדרך כלל ממוקם מתחת לשסתום אב העורקים, וdistally, בשיא LV ^8. שינויים במתח או מוליכות נמדדים על ידי שינויים בזרם מהפרוקסימלי לאלקטרודה דיסטלי. למרות לתרום בריכת הדםזה משמעותי למוליכות, התרומה של קיר החדר, מכונה מוליכות מקבילות _{(עמ 'V),} למוליכות נמדדות חייבות להיות מופחתים להשיג מדידות LV נפח מוחלטות.

השיטות לבצע תיקון זה, הנקרא כיול מלוח, הם דנו בפרוטוקול בהמשך. מערכת היחסים המתמטיות בין מוליכות ונפח, שתוארו על ידי Baan ועמיתים, הוא נפח ש= 1 / α; (L ρ ²⁾ _{(עמ 'GG),} שבו גורם תיקון α = שדה אחיד, ρ = התנגדות דם, L = מרחק בין האלקטרודות, G = מוליכות _וp G = הלא דם מוליכות ^9. ראוי לציין, גורם תיקון השדה האחיד בעכברי גישות 1.0 בשל כרכי תא קטנים ^10. יחד עם מתמרי לחץ, קטטר המוליכות מספק נתוני לחץ ונפח בו זמנית בזמן אמת.

pressu לבמחדש נפח ניתוח מציג יתרונות מסוימים על פני מדדים אחרים של תפקוד לב, מאחר שהם מאפשרים למדידת התפקוד חדרים העצמאיים של תנאי טעינה ושל קצב לב. מדדי לב ספציפיים עומס עצמאי של התכווצות כוללים: יחס לחץ נפח הסוף-סיסטולי, ביחס ד P / D _מקס לא -end-דיאסטולי נפח, elastance המקסימאלי _{(מקסימום} E) (ESPVR) ולטעון מראש עבודת recruitable שבץ (PRSW). מדד עומס עצמאי של פונקציה הדיאסטולי הוא יחסי לחץ נפח סוף דיאסטולי-(EDPVR) ^11. הפרוטוקול הבא מתאר את ההתנהגות של ניתוח לולאת לחץ נפח לב, באמצעות שתי תרדמה וגישת הפסגה. בעוד המתודולוגיה לבצע מחקרים אלה תוארה בפירוט בעבר ^8,11, נסקור שלבים עיקריים להשיג מדידות לחץ-נפח מדויקים, כוללים שני התיקון המלוח וכיול קובט, ולספק הפגנה חזותית של thesנהלי דואר. מחקר עם בעלי חיים שבוצעו במחקר זה טופל על פי פרוטוקולים שאושרו ותקנות צער בעלי החיים של ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק.

Protocol

1. הכנות מוליכות צנתר וכיול לחץ

1. חבר קטטר מוליכות למודול קטטר המודינמית. אלקטרוני לכייל מדידות לחץ ונפח על ידי הקלטת לחץ קבוע מראש ונפח מוגדר על מודול קטטר. להקליט מעקב של 0 מ"מ כספית ו -25 מ"מ כספית (איור 1 א) ולהקצות מתחים לשני העתקים הלחץ (איור 1 ו1C). באופן דומה, להקליט מעקב נפח של RVU 5 ו -25 RVU (1D איור) ולהקצות מתחים לשני העתקים הנפח (1E ו1F).
2. לאשר את כיול לחץ האלקטרוני עם כיול לחץ ידני, באמצעות מד לחץ דם עמודת כספית. התאם את נמל שרוול מד לחץ דם עם ברזלים 3-דרך. מלא מערכת 3 יציאות סתום עצירת דימום, המשמשת לעתים קרובות לאנגיופלסטיקה כלילית, עם מים RT באמצעות יציאת הצד.
   1. הנח את קצה צנתר מוליכות לשסתום עצירת דימום נוזל מלא ובעדינות לאבטח שנינותHout מסתלסל קטטר. חבר את שסתום עצירת הדימום ולמד לחץ הדם לנפח 200 מ"מ כספית ולנעול ברזלים 3-דרך. לבחון האם הלחץ שנמדד בקנה אחד עם הלחץ המנופח במד לחץ הדם.
3. קטטר מקום במלח מחומם ל -37 מעלות צלזיוס, כי הוא ברמה של לחץ שדה ההפעלה ומידה. התאם בקרת לחץ עד לחצים נרשמו הוא באפס.

2. הרדמה / אינטובציה

1. לנהל קטמין / xylazine (80-100 / 10 קילוגרם מ"ג ^-1) כזריקה intraperitoneal.
   הערה: ניתן להשתמש בחומרי הרדמה אלטרנטיביים. רשימה מקיפה של הרדמה מסופקות בביקורות קודמות של טכניקה זו ^11,12. הרדמה נכונה יכולה להיות מאושרת על ידי קמצוץ זנב עדין.
2. הרדימו פעם, לגלח את הצוואר וחזה עם קוצץ שיער ומניחים על משטח לוהט. לשמור על הטמפרטורה רקטלית העכבר ב36.5-37.5 מעלות צלזיוס. טמפרטורות נמוכות גוףיגרום קצב לב מדוכא. החל משחה לעיניים למניעת יובש
3. לעשות חתך קו האמצע בצוואר ובלנתח את שרירי הנשימה משם כדי לחשוף את קנה הנשימה. הנח הטובוס דרך הפה, בעוד לדמיין את קנה הנשימה כדי להבטיח אינטובציה, ולהתחבר למכונת הנשמה.
4. לשמור על עכבר על ההנשמה במהלך ההליך. הגדרות הנשמה נקבע על בסיס משקל בעלי חיים כמתואר בעבר ^11. נפח גאות (מיליליטר) = 6.2 x (משקל בבעלי חיים בקילו) ^1.01 וקצב נשימה = 53.5 x (משקל בבעלי חיים בקילו) ^-.26.

3. מיקום של מוליכות צנתר בתא LV

1. גישה הראשי
   1. כדי להבטיח סטריליות, שני סטים של מכשירי ניתוח סטרילי הם used- אחד לחתך בעור ראשוני ואחד לפעול בפתיחת בית החזה. מכשירים יש לחטא באמצעות מעקר יבש בין בעלי החיים במהלך פגישת כירורגים בודדתND autoclaved בסוף כל יום כירורגית.
   2. לאחר העור כבר לחטא עם שלושה מחזורים של לשפשף chlorhexidine + אלכוהול עור (0.5% אלכוהול פתרון / 70% chlorhexidine), עושה חתך מעל הצוואר תקין מלסת תחתונה לעצם חזה. לנתח רקמות לחשוף את הצוואר תקין, וחתך את העצב התועה אשר פועל בסמוך לתרדמה.
   3. מניחים תפר 6-0 משי סטרילי סביב הקצה הדיסטלי (מהחזה) של עורק התרדמה, עניבה ומאובטחת. מניחים שני תפרים נוספים מתחת להפרוקסימלי של עורק תרדמה (קרובים יותר לחזה) לתפר הראשון, באופן רופף קשירת תפר האמצע. משוך בעדינות את התפר הפרוקסימלי ומאובטח על ידי הידוק אותו לעור. ודא שהעורק הראשי כבר הידק את שני proximally ו distally לפני שימשיך.
   4. לעשות חתך קטן בעורק הראשי ר ', הפרוקסימלי לתפר הראשון, ולהאריך longitudinally כיוון החזה.
   5. הכנס את קצה צנתר מוליכות,ספוג בעבר במלח חם למשך 30 דקות, לספינה דרך החתך ולאבטח את הצנתר באמצעות תפר האמצע.
   6. בעדינות לקדם את הקטטר בחדר השמאלי דרך הצוואר, תוך כדי צפייה בלולאת לחץ-נפח התחקות על מנת להבטיח מיקום נכון.
      הערה: מיקום אופטימלי של קטטר אמור להניב לולאות לחץ-נפח המופיעות מלבני (ראה איור 2). אם כל התנגדות למעבר של קטטר הוא נתקל, משוך בעדינות בחזרה ולקדם שוב עם לחץ עדין. סיבוב עדין של קטטר עשוי לעזור עם מיקום לתוך החדר השמאלי. מכריח את הקטטר המוליכות יכול להוביל לסיבוכי לב וכלי דם חמורים או נזק לקטטר.
   7. לחץ נפח הקלטה בסיסי לולאות ~ 10 דקות אחרי מיקום צנתר והשגת מצב יציב (איור 2).
2. גישת הפסגה
   1. בעכבר הרדים ומאוורר, לעשות חתך frאום ולחתוך את תהליך xiphoid דרך קיר החזה רוחבי עד הסרעפת היא גלויה.
   2. חותך למרות הסרעפת ולדמיין את שיאו של הלב.
   3. הכנס את קטטר המוליכות לשיא של החדר השמאלי דרך פצע דקירת מחט (באמצעות מחט G 25-30), עד אלקטרודה הפרוקסימלי היא רק בתוך החדר.
   4. לחץ נפח הקלטה בסיסי לולאות ~ 10 דקות אחרי מיקום צנתר והשגת מצב יציב.

4. משתנה afterload שימוש חלוף אבי העורקים ספיגה

1. כדי לבצע חסימה של אב העורקים חולף, לעשות חתך אופקי קטן בחזה העליון ולנתח רקמות לחשוף את אב העורקים הרוחביים.
2. הנח מייתר 6-0 משי מתחת לאב העורקים הרוחביים. לאחר לולאות לחץ-נפח חזרו לנקודת התחלה, לאחוז בשני הקצוות של התפר עם מהדק מחט, בעדינות ולאט לאט להעלות את התפר מעל 1-2 שניות, ולשחרר את המתח לאט.
3. חזור על תהליך זה, עד שלוש הקלטות אופטימליות נפרדות עשויות מאותו בעל החיים.
   הערה: הקלטות אופטימליות צריכים להיות לפחות 5 מחזורי לולאת לחץ נפח ועלייה מתמדת בלחצים הסיסטולי הסוף במהלך היישום של מתח על התפר (איור 3 א ו3C).

5. משתנה Preload שימוש הנבוב נחות חלוף קאווה ספיגה (IVC)

1. כדי לבצע חסימת וריד הנבוב נחות חולפת, לעשות חתך אופקי מתחת לתהליך xiphoid, מתחת לסרעפת לחשוף IVC.
2. הנח מייתר 6-0 משי מתחת IVC. לאחר לולאות לחץ-נפח חזרו לנקודת התחלה, לאחוז בשני הקצוות של התפר עם מהדק מחט; בעדינות ולאט לאט להעלות את התפר מעל 1-2 שניות, ולשחרר את המתח לאט. חסימת IVC גם יכולה להתבצע על ידי היישום העדין של לחץ באמצעות כותנה הטתה ספוגית.
3. חזור על תהליך זה, עד שלוש הקלטות אופטימליות נפרדות מ 'ADE מאותו בעלי החיים.
   הערה: הקלטות אופטימליות צריכים להיות לפחות 5 מחזורי לחץ נפח לולאה וירידה מתמדת בלחצי הסוף-דיאסטולי של חדר שמאל במהלך היישום של מתח על תפר (איור 4 א ו -4 ב).

6. מלוח כיול

1. בסיומו של המחקר, מוליכות מקבילות ערך _{(עמ 'V)} יכול להיות להשיג על ידי הזרקת בולוס 10 μl של תמיסת מלח hypertonic (15%) לבעלי החיים דרך וריד הצוואר (איור 5 א ו5B).
   הערה: בולוס זה יגרום עלייה ניכרה בנפח ללא שינוי בלחץ. שינוי נראית לעין זה בנפח הוא התוצאה של שינוי במוליכות בריכת דם ולא בשל עלייה ממשית בנפח. ירידה זמנית _{במקסימום} / DT DP ניתן לצפות, כמלוח hypertonic יש השפעה שלילית האינוטרופית ^13. _P V מחושב יכול להיות נכנס לתוך תוכנת ניתוח לולאת לחץ נפח לאורךעם הפרמטרים של כיול קובט וללהמיר מRVUs במיקרוליטר.

7. קובט כיול

1. כדי לבצע כיול קובט, מקום קובט עם בארות של קטרים ​​ידועים המסופקים על ידי יצרן על כרית חימום או אמבט מים מחומם ל -37 מעלות צלזיוס. מלא 4-5 החורים הראשונים עם דם heparinized חם טרי מעכברים שעברו הערכות המודינמית.
   הערה: כיול קובט מאפשר הערכה מדויקת של בריכת הדם של חדר השמאלי באמצעות עכבר הדם ומאפשר להמרה של נתונים נפח מRVUs למיקרוליטר.
2. הכנס את קטטר המוליכות לתוך הבאר הראשונה, עד שכל האלקטרודות שקועות. בעדינות להזיז את הצנתר בבאר, שיפיק RVUs שונה.
3. רשום את שינויי המוליכות בערוץ הנפח בRVUs. בחר RVU הגבוה ביותר לכיול.
   הערה: הנפח של הבארות או יכול להיות מחושב על ידי 1) באמצעות המשוואה לvolumדואר של גליל, שבו הוא שהרדיוס של באר קובט והאורך מבוסס על האורך בין שתי אלקטרודות חישה הפנימיות או 2) בדיקה בהוראות היצרן. פלט המוליכות יכול להיות מתואם עם הכרכים הידועים לפתח משוואת כיול הממירה את הנתונים מRVUs למיקרוליטר ^11.

8. המתת חסד

1. בסיומו של הפרוטוקול, עכברים מורדמים באמצעות נקע בצוואר הרחם בזמן הרדמה.
2. כדי להבטיח את המוות, עכברים שיש נקע בצוואר הרחם עבר חייבים לעבור שיטה משנית של המתת חסד. אנו משתמשים בexsanguination תחת הרדמה, עם קציר של רקמת לב לניסויים, או פתיחת בית החזה בין שתי המדינות תחת הרדמה.

9. נפח לחץ באמצעות ניתוח נתונים Loop תוכנת ניתוח

1. חישוב _p V מתמיסת מלח כיול
   1. לחץ וvolu בחרשלי לולאות שהושגו במהלך הפליטה של תמיסת מלח hypertonic (איור 5 א 'ו5B)
   2. יצוא לולאות לתוכנת ניתוח לחץ נפח. בחר באפשרות לכיול מלוח (איור 5 ג)
   3. רשום את ערך _p V מחושב (איור 5D).
      הערה: ערך _p V מחושב על ידי זיהוי בצומת של הנפח) 1 הסוף-דיאסטולי לעומת הסוף-סיסטולי נפח מהכיול המלוח ו -2) קו נפח הנפח = הסוף-סיסטולי סוף-דיאסטולי. הצומת של קווים אלה מספקת _p V, המחושב על ידי תוכנת ניתוח לולאת לחץ נפח.
2. הזן את המוליכות לנפח (RVU) ביחס באפשרויות ערוץ נפח (איור 1F)
3. למדוד ביחס לולאת לחץ-נפח Baseline
   1. בחר 8-10 מחזורי לב מערוצי לחץ ונפח פעם מצב יציב הושג (איור 2 א) ויצוא לניתוח רךכלי. לזהות 5-6 לולאות הסוף-נשיפה (איור 2)
   2. השתמש בערך _p V לתקן למוליכות מקבילות. בחר באפשרות "המצב יציב", וליצור טבלת סיכום המודינמית (איור 2 ג)
4. יחס לולאת לחץ-נפח מדד במהלך אבי העורקים התכווצות
   1. בחר 8-10 מחזורי לב מערוצי לחץ והנפח שמתאימים להתכווצות אב העורקים לפני העלייה לחצים סוף-דיאסטולי (איור 3 א) ויצוא לתוכנת ניתוח. לזהות 5-6 לולאות הסוף-נשיפה (איור 3 ג)
   2. ניתוח בחר "התכווצות" (איור 3), שיחשב את יחס נפח לחץ הקצה הסיסטולי (ESPVR)
5. יחס לולאת לחץ-נפח מדד במהלך התכווצות IVC
   1. בחר 8-10 מחזורי לב מערוצי לחץ והנפח שמתאימים להתכווצות IVC (Figur4A ה) ויצוא לתוכנת ניתוח. לזהות 5-6 לולאות הסוף-נשיפה (איור 4)
   2. בחר ניתוח "התכווצות" (איור 3), שיחשבו עבודה שבץ Recruitable Preload (PRSW) (איור 4C), המרבי DP / DT vs EDV (איור 4D), כמו גם את ESPVR ויחס לחץ נפח סוף דיאסטולי-(איור 4E)

תוצאות

ניתוח לולאת לחץ-נפח ניתן להשתמש כדי למדוד תפקוד לב בעכברים מהונדסים גנטי ^14,15 או עכברים שעברו את הלימודים בסמים ^16. לולאות לחץ נפח נציג מסופקות מהעבודה שפורסמה בעבר ¹⁶ חוקרים את ההשפעה של SS-Arrestin מוטה יגנד AT1R, TRV120023. כדי לבדוק אם TRV120023 משפיע על תפקוד לב in...

Discussion

אנו מתארים שיטה לניתוח perfoming לולאת לחץ-נפח באמצעות צנתר מוליכות בעכברים, להפיק ניתוחים מקיפים של שני התכווצות והרפיה של הלב. Suga, Sagawa ועמיתים מנוצלים לחץ-נפח הלולאות להגדיר מדדים של התכווצות לב, במיוחד במדרון של ESPVR, או elastance הסוף-סיסטולי _(ES E), _{ומקסימום} E. Elastanc...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed (xylazine)	Lloyd Laboratories	NADA no. 139-236	Anesthetic
Ketaset (ketamine)	Pfizer	440842	Anesthetic
VIP3000	Matrx Medical Inc.		Anesthesia machine
Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683	Surgical Equipment
Tubing kit	Harvard Apparatus	72-1049	Surgical Equipment
Homeothermic Blanket	Kaz Inc.	5628	Surgical Equipment
Stereo microscope	Carl Zeiss Optical Inc.	Stemi 2000	Surgical Equipment
Illuminator	Cole–Parmer	41720	Surgical Equipment
Dumont no. 55 Dumostar Forceps	Fine Science Tools Inc	11295-51	Surgical Instruments
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools Inc	11052-10	Surgical Instruments
Moria MC31 forceps	Fine Science Tools Inc	11370-31	Surgical Instruments
Mayo scissors	Fine Science Tools Inc	14512-15	Surgical Instruments
Iris scissors	Fine Science Tools Inc	14041-10	Surgical Instruments
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc	12501-13	Surgical Instruments
Olsen–Hegar needle holder	Fine Science Tools Inc	12002-12	Surgical Instruments
spring scissors	Fine Science Tools Inc	15610-08	Surgical Instruments
disposable underpads	Kendall/Tyco Healthcare	1038	Surgical Supplies
Sterile gauze sponges, sterile	Dukal	62208	Surgical Supplies
Cotton-tipped applicators, sterile	Solon	368	Surgical Supplies
Surgical suture,  silk, 6-0	DemeTECH	FT-639-1	Surgical Supplies
1 cc Insulin syringes	Becton Dickenson	329412	Surgical Supplies
Access 9 Hemostasis Valve	Merit Medical	MAP111	Hemodynamic equipment
Sphygmomanometer	Baumanometer	320	Hemodynamic equipment
Millar PV system MPVS-300/400 or MPVS Ultra (includes calibration cuvette)	ADInstruments Inc		Hemodynamic equipment
1.4F conductance catheter	ADInstruments Inc	SPR-839	Hemodynamic equipment
PowerLab 4/30 with Chart Pro	ADInstruments Inc.	ML866/P	Hemodynamic software
animal clipper	Wahl	8787-450A	Miscellaneous
Intradermic tubing PE-10	Becton Dickenson	427401	Miscellaneous
Intradermic tubing PE-50	Becton Dickenson	427411	Miscellaneous
Needle assortment (18, 25 and 30 gauge; Thomas Scientific)			Miscellaneous
0.9% (wt/vol) sodium chloride injection, USP)	Hospira	NDC no. 0409-4888-50	Miscellaneous
Surgical tape			Miscellaneous
Alconox (Alconox Inc.) for catheter cleaning	ADInstruments Inc.		Miscellaneous