JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה היא ללמוד המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב intraepidermal. לכן, פותחו טכניקות הדמיה וניתוח 3D לבודד עצב ספציפיים המיטוכונדריה ולהעריך הנוצרות על-ידי מחלת שינויים של המיטוכונדריה בקצה הדיסטלי של העצבים החישה. הפרוטוקול משלב אימונוהיסטוכימיה פלורסצנטיות, מיקרוסקופיה קונפוקלית וטכניקות ניתוח תמונה תלת-ממדית כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. פרמטרים מפורטים מוגדרים לכל אורך ההליכים על מנת לספק דוגמה מוחשית כיצד להשתמש הטכניקות הללו כדי לבודד עצב ספציפיים המיטוכונדריה. נוגדנים שימשו כדי לתייג עצב, אותות מיטוכונדריאלי בתוך מקטעי רקמת העור אגרוף ביופסיות, אשר בעקבות immunofluorescence עקיף כדי להמחיש את העצבים ואת המיטוכונדריה עם אות ניאון אדום וירוק בהתאמה. Z-סדרת תמונות נרכשו עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, נעשה שימוש בתוכנות ניתוח תלת-ממד כדי לעבד ולנתח את האותות. אין צורך לעקוב אחר הפרמטרים המדויק תיאר בתוך, אבל חשוב להיות עקביים עם אלה שנבחרו לאורך מכתים, צעדים analysis של רכישת. הכוח של פרוטוקול זה היא שזה ישים למגוון רחב של נסיבות שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד אחרים אותות שאחרת היה בלתי אפשרי ללמוד לבד.

Introduction

המיטוכונדריה לשרת פונקציות הסלולר חיוניים הכוללים הפקת אנרגיה בתא, מאגרי סידן, ועל ויסות נמק ו מוות תא מוות1,2,3. למערכת העצבים יש שיעור חילוף החומרים גבוה לעומת גוף4 רומז כי נוירונים לייצר רמה גבוהה של האנרגיה התאית בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך נשימה מיטוכונדריאלי. הרבה מסמכים ראיות כי פונקציות עצביים תלויות ב- ATP5, במיוחד בזמן הסינפסות6. לכן, ההתפלגות של המיטוכונדריה בתוך הנוירונים הוא חשוב.

במהלך 10 השנים האחרונות שהרבה מידע הראה ש של סחר בבני אדם, עגינה של המיטוכונדריה עצביים מאוד מווסתות. מנוע חלבונים מעורבים הפצת המיטוכונדריה כדי ספציפי תאים סלולריים לאורך הנוירון. סחר בבני אדם של המיטוכונדריה חשוב במיוחד כי נוירונים פרויקט אקסונים ו דנדריטים הרחק מן סומא. קינזין מנוע חלבונים בעיקר לכוון anterograde (הרחק סומה) סחר של המיטוכונדריה לאורך microtubules תוך דינאין חלבונים מנוע ישיר תנועתיות רטרוגרדי (לכיוון סומה)7,8,9 , 10. שם הן אותות תאיים כזה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית הולכה דחף המשפיעים על נוכחות והכיוון של מיטוכונדריאלי סחר11,12,13.

בנוסף לשינוע המיטוכונדריה, ישנם חלבונים מיוחדים כדי להתאים לשפה המיטוכונדריה כדי תאים הסלולר ספציפיים שיש להם דרישות אנרגיה גבוהה, כגון Ranvier של צמתים, הסינפסות8,14, 17. למעשה, הרוב המכריע של המיטוכונדריה בתוך אקסונים הם שאינם תאי9,13,18. חלבונים מיוחדים כמו syntaphilin המיטוכונדריה עוגן כדי microtubules לאורך אקסונים בזמן לחלבונים אחרים עיגון המיטוכונדריה אקטין שלד התא19–21. גורמי גדילה, יונים כגון סידן דווחו לתמוך הפסקת תנועת המיטוכונדריה למקם אותם לאזורים איפה הם הצורך21,22,23.

יחדיו, סחר עגינה של המיטוכונדריה הם חיוניים לתפקוד תקין של נוירונים. כדי לתמוך בזה, הפרעה סחר מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר מחלות נוירולוגיות כולל מחלת אלצהיימר, נוירודגנרטיביות, שארקו-מארי-טות ', מחלת הנטינגטון, עוויתי תורשתי paraparesis, ניוון אופטיים15,24,25,26,27. המחקרים האחרונים התמקדו בתפקוד מיטוכונדריאלי, פתולוגיה כמנגנון פוטנציאליים עבור נוירופתיה סוכרתית, אובדן חושים הקשורים לסוכרת28,29,30,31 32, ,33. ההשערה היא כי סוכרת הפיצולים ההתפלגות של המיטוכונדריה בתוך ההשתקפויות חושית של ותאי העצב עורית. לכן, הטכניקה פותחה כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה בתוך סיבי העצב intraepidermal (IENFs), קצות דיסטלי שורש העזוב גנגליון afferents חושית. הטכניקה משלב פלורסצנטיות אימונוהיסטוכימיה של ספציפי מיטוכונדריאלי ותוויות סיבי עצב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית רכישת מסדרת z של אותות עם תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית חזק כדי למדוד את ההתפלגות של עצבים ספציפיים המיטוכונדריה מן האדם עורית אגרוף ביופסיות להשגת מטרה זו.

Protocol

נושאים גויסו מרשת טיפול ראשוני בקהילה גדולה במרכז לסוכרת אוניברסיטת יוטה (סולט לייק סיטי, יוטה), ביופסיות ניקוב עור התקבלו. מחקר זה היה אושרו על ידי ועדת הבדיקה מוסדיים באוניברסיטת מישיגן, פעלו לפי עקרונות הצהרת הלסינקי. נכתב מדעת היה המתקבלים לכל נושא לפני בדיקות.

1. קרינה פלואורסצנטית אימונוהיסטוכימיה

  1. הכן ביופסיות אגרוף עבור אימונוהיסטוכימיה סיבי עצב intraepidermal:
    1. עור 3 מ מ לבצע ביופסיות מאת רפואי צוות ולמקם את הביופסיה כל 1.5 mL זמבוני ' s מקבע פתרון (2% paraformaldehyde, חומצה picric 0.3% רווי buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. לשטוף את דגימות עם פתרון של 30% סוכרוז ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך 16-24 שעות או עד המדגם כיורים.
    3. Embed דגימות בטמפרטורה האופטימלית חיתוך תרכובת (אוקטובר) באמצעות של cryomold. למקם את הביופסיה כל 3 מ מ עם האפידרמיס פונה כלפי מטה, כייר ולמלא את התבנית כ 2 מ ל אוקטובר להקפיא התבנית על קרח יבש כתוש. חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן להשתמש.
    4. לחתוך 50 מיקרומטר עבה באמצעות cryostat של חתכי רוחב ולאחסן בבארות בודדים של צלחת 96-ובכן באמצעות פתרון אחסון של חומר נגד קיפאון µL 180 לכל טוב (30% אתילן גליקול, גליצרול 30% ב- PBS). ההוראות הבאות הן עבור 8 בארות של צלחת טוב 96. כתם מקטעים של כל אתר ביופסיה כי הם 200-300 מיקרומטר רחוקים אחד מהשני.

יום 1:

  1. להרוות שאינם ספציפיים תיוג של השכבה הקרנית:
    1. לוחית התווית 96-ובכן כפי שמוצג באיור 1.
    2. µL pipet 150 בפתרון משפר אות מניות כדי להפחית את הכריכה לא ספציפית של נוגדנים משניים 34 , 35 לבאר כל. להעביר חלקים לתוך האות משפר הפתרון באמצעות ללולאה לחסן.
      הערה: שמור על עצמך תוך כדי עבודה עם הרקמה כדי למנוע פגיעה או קריעה הסעיפים רקמות. לשמור על האות משפר פתרון במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה שטוחה.
    3. שטיפה הכן בארות בשורות 2 ו- 3 של צלחת 96-ובכן על-ידי הוספת µL 150 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לבאר כל.
    4. בקפידה להעביר חלקים לתוך שורה 2 ולשטוף ב- PBS 1 x 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שטיפה פעם נוספת ב- PBS 1 x 10 דקות בטמפרטורת החדר (שורה 3).
  2. להכין 5% שור אלבומין (BSA) חוסם פתרון:
    1. להכין 5% חסימת פתרון המכילה 5% BSA ו- 0.3% X טריטון 100 (TX-100) ב- 0.1 M PBS (ראה טבלה 1) ואילו סעיפים הם המקננת ב אות משפר פתרון. BSA לא להיכנס פתרון בקלות. מערבולת פתרון עד BSA מתמוסס לחלוטין.
    2. להכין בארות חסימה בשורה 4 של צלחת 96-ובכן על-ידי הוספת µL 150 של BSA 5% חסימת פתרון טוב לכל.
    3. להעביר חלקים לתוך בארות בודדים של BSA 5% חסימת פתרון, דגירה ובסעיף 5% BSA חסימת פתרון 1-2 h בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה שטוחה.
  3. להכין 1% BSA שטיפה פתרון ודילול של נוגדנים הראשי:
    1. סעיפים TX-100 ב- 0.1 M PBS (ראה טבלה 2) בעת הכנת 1% פתרון השטיפה המכיל 1% BSA ו- 0.3%? המקננת בפתרון BSA 5% חסימה. BSA לא להיכנס פתרון בקלות. מערבולת פתרון עד BSA מתמוסס לחלוטין.
    2. לדלל נוגדנים העיקרי בפתרון השטיפה BSA 1% ואילו סעיפים הם המקננת בפתרון BSA 5% חסימה.
      1. להפוך µL 1,500 של נוגדן ראשוני פתרון ולהוסיף לכל טוב בשורה 5.
      2. לדלל את הנוגדנים ראשי: להשתמש תווית ספציפי עצב, ארנב polyclonal ג'ין חלבונים אנטי מוצר 9.5 (PGP9.5) ב- 1:1, 000. להשתמש בתווית המיטוכונדריה ספציפיים, העכבר נוגדן E2/E3bp monoclonal אנטי פירובט דהידרוגנאז (PDH)-מטריים ב 1% BSA שטיפה פתרון.
  4. להכין נוגדן ראשוני:
    1. µL Pipet 150 של נוגדן ראשוני לתוך כל טוב שורה 5 של צלחת 96-ובכן.
    2. באמצעות הכלי לולאה, להעביר מקטעי הפתרון חסימה (שורה 4) אל השורה 5 המכיל נוגדן ראשוני.
    3. לעטוף את הצלחת בחוזקה עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע את ייבוש.
    4. במקום דוגמאות על נדנדה שטוחה בטמפרטורת החדר במשך 1 h ולאחר מכן דגירה דגימות ב 4 ºC על כיסא נדנדה שטוחה בין לילה.

יום 2:

  1. לשטוף דוגמאות:
    1. הכן בארות שטיפה בשורות 6, 7 ו- 8 של צלחת 96-ובכן על-ידי הוספת µL 150 של 1% BSA שטיפה פתרון טוב לכל.
    2. להעביר חלקים 1% BSA השטיפה פתרון ראשון (שורה 6), תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר. חזור עוד פעמיים על ידי המקננת ובסעיף 1% BSA שטיפה פתרון בשורות 7 ו- 8 עבור 1 h בטמפרטורת החדר שטיפות.
  2. לדלל נוגדנים משניים ב 1% BSA שטיפה פתרון:
    1. µL 1,500 להפוך של נוגדנים משניים פתרון בזמן מקטעים הם המקננת ב השטיפה האחרונה של 1% BSA שטיפה פתרון (שורה 8).
    2. לדלל נוגדנים משניים: עבור PGP9.5 (נוגדן אנטי-ארנב עז מצומדת ירוק-פלורסנט, 1:1000), עבור PDH (אדום-פלורסנט עז מצומדת אנטי עכבר, 1:1, 000) ב 1% BSA שטיפה פתרון.
  3. הכנת נוגדנים משניים:
    1. µL Pipet 150 של נוגדנים משניים לתוך שורה 9 של צלחת 96-ובכן.
    2. בעדינות העבר הסעיפים 1% BSA שטיפה פתרון (שורה 8) לתוך בארות נוגדנים משניים (שורה 9).
    3. . מצלמות-באמצעות מיקרוסקופים, לעטוף את הצלחת בחוזקה כדי למנוע את ייבוש. מכסים ברדיד אלומיניום. במקום דוגמאות על נדנדה שטוחה בטמפרטורת החדר במשך 1 h ולאחר מכן דגירה דגימות ב 4 הלעפה תרוטרפמט על כיסא נדנדה שטוחה בין לילה.

יום 3:

  1. הכן לנקות 1 x PBS על-ידי סינון דרך מסנן מיקרומטר 0.22:
    1. µL Pipet 150 של סינון 1 x PBS לתוך שורה 10, 11 ו- 12.
    2. העברת דגימות שורה 10 ולשטוף ב- PBS x 1 לשעה בטמפרטורת החדר. לכסות את הצלחת 96-ובכן ברדיד אלומיניום ומניחים על כיסא נדנדה שטוחה במהלך השטיפה. חזור על סינון 1 x שטיפה PBS שני פעמים נוספות עבור 1 h כל בטמפרטורת החדר בשורות 11 ו- 12.
  2. להכין שקופיות מיקרוסקופ להרכבת מקטעי רקמת:
    1. µL 50 המקום של סינון 1 x PBS בשקופית.
    2. סעיף העברת מהערוץ 1 x (שורה 12) לתוך ה-50 µL טיפה. מקם בזהירות המקטע בתיבה הנפתחת של PBS מאת התגלגלות הרקמה ושיטוח אותו בעדינות על גבי השקופית זכוכית. להסיר את עודף PBS עם פיפטה מזכוכית כדי למנוע דילול הכימית הרכבה. . אל תיגע מקטעים עם הנורה מזכוכית.
      3. טיפול
    3. pipet 1 - 2 טיפות של ריאגנט הרכבה המכיל דאפי ישירות מעל המקטע בבאמצעות שקופיות מיקרוסקופ כדי לא להפריע את הכיוון של המקטע. הנח בעדינות coverslip זכוכית מיקרוסקופ של 50 מ"מ x 24 מ"מ #1.5 מעל המקטע.
    4. לנקות את כל בועות האוויר שנוצר תוך הצבת את coverslip ונגב עודף נוזל את הקצוות של coverslip. הכנת שקופית חדשה וחזור הרכבה ליחסי ציבורocess עבור כל מקטע.
    5. תרופה/יבש התקשורת גובר על-ידי הצבת את השקופיות הלילה חשוך בטמפרטורת החדר. להעביר את השקופיות 4 ° C לטווח קצר (1-2 שבועות) או-20 ° C לאחסון לטווח ארוך (גדול מ 2 שבועות).
      הערה: פקדי שלילי מושמט נוגדנים ראשי PGP9.5 או PDH בשלב 1.4.2.2 ויוצג אין תיוג ניתן להבחנה של העצבים או המיטוכונדריה האפידרמיס. חיובי פקדים בוצעו עבור PDH נוגדנים כדי להוכיח זאת מתייגת כל המיטוכונדריה (נתונים לא מוצג). פקדים חיובי בוצעו על הנוירונים גנגליון העזוב בסיס תרבותי. העכבר הראשי היו transduced עם baculovirus כדי המיטוכונדריה תווית עם קליטה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מכן קבועה, צבעונית עם נוגדן PDH, פלורסנט אדום נוגדנים משניים. המיטוכונדריה כל זאת הבעת GFP היו במשותף עם תוויות עם התווית אדום עבור PDH אימונוהיסטוכימיה (נתונים לא מוצג).

2. הדמיה קונאפוקלית

  1. לבצע הדמיה קונאפוקלית:
    1. לאסוף תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם 40 X שמן-טבילה (מפתח נומרי 1.25 (נ. א)) המטרה של מיקרוסקופ הפוכה סורק לייזר.
      1. -כל מטוס מוקד ברצף לרכוש אותות פלואורסצנט:
        גרעינים: עירור λ = 405 ננומטר, λ מסנן פליטה ספקטרלי = 420-480 ננומטר
        סיבי עצב: עירור λ = 488 ננומטר, λ מסנן פליטה ספקטרלי = nm 505-560
        Mitoch ondria: עירור λ = 543 ננומטר, λ מסנן פליטה ספקטרלי = 606-670 nm
    2. להיכנס הפרמטרים הבאים הסריקה התוכנה למיקרוסקופ: קצב סריקה של 600 הרץ עם מסגרת בממוצע 2 ו זום של 2.2; בעוצמה 12 סיביות ברזולוציה (4096 אפור רמות).
      1. להגדיר לתוכנה מיקרוסקופ ברזולוציה ממוטבת לרוחב (סריקה ברזולוציה = 1,024 x 1,024) ואת חלוקתה רזולוציה מפוח/אופטי (צמצם קונאפוקלית = 1 יחידה אוורירי (AU) עם z-צעד בגודל של 210 ננומטר).
        הערה: הפתרון XYZ וכתוצאה מכך הוא 172.2 ננומטר x 172.2 ננומטר nm x 210 עם גודל תמונה של מיקרומטר 176.1 x 176.1 מיקרומטר x 30-50 מיקרומטר.
    3. להפעיל סריקה בשידור חי עבור האות העצבי (ירוק-זריחה) ולהתאים לפקד z-המוקד כדי למצוא ולהגדיר העליון התחתונה מוקד מטוסים בתוכנה מיקרוסקופ שמעבירים את האות העצבי בתוך סעיף הרקמה. Z-הטווח הכולל הוא בדרך כלל 30-50 מיקרומטר עבור מקטע רקמות 50 מיקרומטר.
    4. לסובב את השדה סריקה עם התוכנה מיקרוסקופ במהלך סריקת בשידור חי כך האפידרמיס אופקית או אנכית ממוקם בתמונה.
    5. לסרוק כל אות בנפרד ולהתאים את הגלאי (הצינור האופטיקה, PMT) מתח וההיסט כדי למזער/להסיר כל מעל ומתחת פיקסלים רווי.
      הערה: סריקת פעמים עם הפרמטרים לעיל לקחת כ- 20-40 דקות בהתאם מספר הפרוסות z.

3. 3D להדמיה, ניתוח של המיטוכונדריה בתוך האדם סיבי עצב Intraepidermal

  1. לבודד את האפידרמיס 3D:
    1. לשכפל את התמונה המקורית והשתמש את העוצמה המקסימלית הקרנה (המוקד תצוגה מורחבת) של התמונה כדי לזהות ולבודד את האפידרמיס.
    2. השתמש באזור של כלי הריבית לעקוב לאורך הקצוות העליונים והתחתונים של האפידרמיס כדי להסיר אזורים בלתי רצויות כגון הקרנית ו הדרמיס נעדרים של סיבי עצב intraepidermal. יבול לבחירה הזו.
  2. שימוש deconvolution על העצבים ואת אותות פלואורסצנט מיטוכונדריאלי:
    הערה: Deconvolution עוזר להחזיר את תקינות אותות פלואורסצנט. השיקום נעשה שימוש בפרוטוקול זה נקרא deconvolution עיוור כי היא משתמשת את אותות פלואורסצנט של תמונות כדי לקבוע עד כמה האותות להתפשט מן המקור שלהם (נקודת להפיץ את הפונקציה). התהליך משפרת אות ברזולוציה באמצעות הקצאה מחדש של האות להתפשט חזרה למיקום המקור שלה.
    1. חישוב נקודת להפיץ את הפונקציה (PSF) לאות עצבי פלואורסצנטי ירוק (ירוק-זריחה) עם הפרמטרים הבאים:
      1. מוגדר PSF מחושב קונפוקלי. מוגדר בינוני מקדם שבירה 1.515 ואת מספרי הצמצם ל 1.25. הגדר חריר גלאי 1 יחידה אוורירי (א"א). אורך גל לייזר קבע עירור כדי 488 גל nm ו פליטה כדי 515 nm.
    2. לחשב PSF עבור האות מיטוכונדריאלי ניאון אדום (אדום-זריחה) עם הפרמטרים הבאים:
      1. סט מחושב PSF קונפוקלי. מוגדר בינוני מקדם שבירה 1.515 ואת מספרי הצמצם ל 1.25. מוגדר חריר גלאי 1 AU. אורך הגל עירור לייזר set כדי גל 543 nm ו פליטת 617 nm.
    3. מטב העצב ואת המיטוכונדריה אותות פלואורסצנט מאת deconvolution באמצעות את PSFs המתאים המפורטים לעיל וכוללים שיקום איטרטיבי שוכן בגובה 100% בטחון, הגבלת איטרציה של 10 מחזורים.
  3. ליצור משטחי עצבים ספציפיים:
    1. שימוש " ליצור משטח " כלי לעשות משטח יציב של העצבים מן deconvolved ירוק-פלורסנט משני תיוג של PGP9.5 זיהה את העצבים.
    2. בטל סימון " חלקה " כוללים, להשתמש בתכונה אינטנסיביות מוחלטת להציב את הסף עבור האות העצבי מאז זה משמעותית יותר קרינה פלואורסצנטית רקע בהיר-
    3. להשתמש בתכונה אינטנסיביות מוחלטת להציב את הסף עבור האות העצבי מאז זה משמעותית יותר קרינה פלואורסצנטית רקע בהיר. הגדר את ערך הסף נמוכה מספיק כדי לזהות במדויק את העצבים.
    4. מסנן החוצה משטחים קטנים, שאינם-עצב בהתבסס על גודל.
      הערה: במקרה הצורך, לערוך באופן ידני את משטחים נוספים שאינם-עצב בתוך " עריכה " טאב על-ידי החזקת המקש הבקרה כדי לסמן אובייקטים מרובים ומחיקת אותם אז עם המקש Delete.
  4. ולבודד עצבים ספציפיים מיטוכונדריאלי אות ניאון:
    1. בחר בכרטיסיה עריכה של המשטח חוצפה כדי להציג " המאפיינים מסיכת " תכונה. פני השטח עצב שנוצרו בשלבים 3.3 משמש כדי לבודד את המיטוכונדריה בתוך לשמרם הרחק מיטוכונדריאלי אותות הקשורים keratinocytes.
    2. כמו " כל מסכת ' לחצן פתיחה " מסיכת ערוץ " חלון, לבחור את האות האדום-פלורסנט deconvolved המשיכה למטה בתפריט תחת " בחירת ערוץ " לאות מיטוכונדריאלי.
    3. לחץ בתוך תיבת לשים סימון " הערוץ המשוכפל לפני החלת מסיכת " אפשרות.
    4. לחץ ברדיו כפתור בחזית " קבוע בתוך/מחוץ " באפשרות מסכת הגדרות ולחץ על בתיבה כדי לשים סימון " להגדיר voxel מחוץ למשטח " אפשרות וסוג 0.00 עבור הערך. לחצן לחץ על אישור כדי ליצור את הערוץ החדש המייצג אותות מיטוכונדריאלי בתוך השטח עצב.
  5. ליצור משטחי המיטוכונדריה ספציפיים:
    1. שימוש " ליצור משטח " כלי לעשות משטח יציב של המיטוכונדריה מערוץ פלורסנט החדש שנוצר של העצבים הספציפיים מיטוכונדריאלי אותות צעדים 3.4.
    2. בטל סימון " חלקה " כוללים ובחר " רקע חיסור " תכונה להציב את הסף. תכונה זו משתמשת ניגודיות מקומית סביב האות מיטוכונדריאלי לזהות את המיטוכונדריה מרקע.
      3. ערך הסף
    3. סט נמוכים מספיק כדי לזהות במדויק את המיטוכונדריה. בדוגמה זו הסף התחתון הוגדר ב- 2,000 מידה 16 סיביות (65,536).
    4. לסנן משטחים מיטוכונדריאלי בהתבסס על גודל. בדוגמה זו שהמגבלה voxel הוגדר ל 1.0 voxels, אשר הוא הנמוך ביותר להגביל את האפשרי. במידת הצורך, לערוך באופן ידני את משטחים ללא המיטוכונדריה בתוך " עריכה " טאב על-ידי החזקת המקש הבקרה כדי לבחור אובייקטים מרובים, ואז למחוק אותן עם המקש Delete.
      הערה: לעיתים, התוכנה תיצור משטחים אינם משויכים אות ניתן להבחנה מיטוכונדריאלי פלורסנט. במקרים אלה, זה אפשרי להסיר אותם עם " עריכה " בכרטיסיית
  6. לייצא ולחישוב ערכים morphometric לניתוח:
    1. לייצא ערכים עבור עצב ומשטחים מיטוכונדריאלי מ " סטטיסטיקה " טאב לצורך ניתוח נוסף עם תוכנת גיליון אלקטרוני.
    2. לייצא את הערכים אמצעי האחסון עבור עצב והן משטחים מיטוכונדריאלי.
    3. לספור את מספר סיבי עצב בודדים נוכח כל תמונה ולהקליט את הערך בגיליון אלקטרוני-
    4. עבור כל תמונה, לחשב את פוטנציאל הערכים הבאים עבור ניתוח בגיליון אלקטרוני:
      1. לסכם את אמצעי האחסון עבור כל המשטחים עצב.
      2. מסנן החוצה עצבים ספציפיים משטחים מיטוכונדריאלי מתחת נפח של פחות מ 0.02 נקודות מיקרומטר 3 ו- bin המשטחים לפי גודל. לדוגמה, השתמש פחי כגון 0.02 - 0.04 0.04 - 0.08, 0.08 - 0.16, 0.16 - 0.32, 0.32 - 0.64, 0.64 - 1.28, 1.28-2.56, גדול ממיקרומטר 2.56 3.
        הערה: הגבול התחתון של נפח מיטוכונדריאלי נקבע ל- 0.02 נקודות מיקרומטר 3 מבוסס על כרכים שפורסמו בעבר של 37 , 36 , mitonchodria 38.
      3. לספור את מספר משטחי מיטוכונדריאלי עצבים ספציפיים בתוך לכל סל ואת המספר הכולל של משטחים מעל הארגזים (0.02 - גדול ממיקרומטר 2.56 3).
      4. לחשב את הפרופורציה של משטחים מיטוכונדריאלי עצבים ספציפיים בכל סל. השתמש הרוזן לכל סל מחולק על ידי המספר הכולל של המיטוכונדריה משטחים.
      5. לסכם את אמצעי האחסון עבור כל המשטחים מיטוכונדריאלי עצבים ספציפיים.
      6. לחשב את הפרופורציה של עצב מיטוכונדריאלי קליטה על-ידי חלוקת האחסון עצב הכולל משטח בסכום של כל אמצעי האחסון משטח מיטוכונדריאלי.
      7. לחשב את מספר המיטוכונדריה לכל עצב אמצעי אחסון על-ידי חלוקת עצב הכולל משטח האחסון על-ידי הספירה של כל המשטחים מיטוכונדריאלי.

תוצאות

ויזואליזציה, כימות של המיטוכונדריה בתוך IENFs אנושי

קרינה פלואורסצנטית אימונוהיסטוכימיה מאפשר תיוג סימולטני של אותות מרובים בתוך ביופסיות העור האנושי לדמיין העצבים המיטוכונדריה, גרעינים. צלחת 96-ובכן הוא דרך נוחה כדי לארגן את השל...

Discussion

פרוטוקול זה תוכנן כדי לבודד, לכמת ולנתח את גודל ואת ההפצה של המיטוכונדריה עצבים ספציפיים בתוך IENFs תלת-ממד של ביופסיות העור האנושי. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. אימונוהיסטוכימיה פלורסצנטיות לתרשים נועד להכתים וניתוח אותות מרובים בכל מדגם, מתן מתודולוגיה תכליתיות עבור מחקר לקטעים

Disclosures

אין ניגודי עניינים להכריז.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים K08 NS061039-01A2, תוכנית למחקר נוירולוגיה & גילוי, א אלפרד טאובמן רפואי מכון המחקר של אוניברסיטת מישיגן. עבודה זו נעשה שימוש של מורפולוגיה הליבה ניתוח תמונה של מרכז מחקר סוכרת מישיגן, הממומן על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 90 P 5 DK-20572 במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה. המחברים רוצה להודות ג'י רובינסון סינגלטון ו א גורדון סמית ' (אוניברסיטת יוטה) לתרומה הנדיבה שלהם של דגימות העור האנושי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2% Zamboni's FixativeNewcomer Supply, Middleton, WI 1459A2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10x Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP399-4To make up 1x PBS
Image-iT FX Signal EnhancerThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsI36933enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)Proteintech Group Inc. Rosemont, IL14730-1-APabbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)abcam, Cambridge, MAab110333abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugateThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11034red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11032green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine SerumSigma-Aldrich, St. Louis, MOA7906-100abbreviated as BSA
Triton X- 100Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT9284abbreviated as TX-100
0.22 µm FilterEMD Millipore, Billerica
MA		MILLEX GP SLGP 033NS0.22 µm Millipore filter
Parafilm MFisher Scientific, Pittsburgh, PA13-374-10Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated LoopFisher Scientific, Pittsburgh, PA22-032092inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay PlateCorning Incorporated, Corning, NY360396-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPIThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsP-36931DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-544ECoverslips
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-550-15Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal MicroscopeLeica Microsystems, Buffalo Grove, ILSP5Confocal Microscope
Volocity x64 Software Perkin Elmer, Waltham , MAversion 4.4.0Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis SoftwareBitplane, Concord, MAversion 7.7.1Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
ExcelMicrosoft, Redmond, WAversion Office 2013Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature CompoundSakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA4583abbreviated as OCT
Leica CryostatLeica Biosystems, Buffalo Grove, ILCM1850Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsC10600Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

127intraepidermal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved