JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Abstract

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Introduction

תאים חיסוניים מולדים מהווים שיעור מהותי של תאים במיקרו-סביבה של הגידול קושרו עם ממאירות הגידול בחולים ומודלים של בעלי חיים של סרטן 1. לאחרונה, זה הפך להיות יותר מוערך נרחב שתגובות חיסוניות כרוניות תפקיד קריטי בקידום התקדמות גידול, גרורות והתנגדות לכימותרפיה 2. המקרופאגים חשובים תאים חיסוניים מולדים אשר הוכחו להסדיר ישירות בתגובה תאים סרטניים לכימותרפיה 3,4. עם זאת, את התפקיד של נויטרופילים, שחקני מפתח במערכת החיסון המולדת, בוויסות תגובת הגידול לטיפול נגד סרטן אינו ידוע. מטרות הפרוטוקולים הללו הן להשתמש בשיטה מהירה ואמינה להפריד נויטרופילים מדגימים הדם של מטופל CLL וכדי להבדיל תאי HL60 לאורך מסלול granulocytic כדי ללמוד את תפקידם בויסות הרגישות של תאי לימפומה לסוכנים נגד לימפומה.

= "jove_content"> נויטרופילים הם מרכיב הסלולר הנפוץ ביותר של מערכת החיסון המולדת בדם 5 ולפעול כקו ההגנה הראשון נגד פולשים מיקרואורגניזמים 6. יש נויטרופילים תפקיד חיוני עולה תגובות חיסון מולדות יעילות בנוסף לפונקציות מפעיל משתנות במצבים פתולוגיים מספר 7. לכן, שיטה מהירה ואמינה כדי לבודד נויטרופילים מתאי דם אחרים, כגון שיטת הפרדת שיפוע צפיפות, נדרשה לבדיקות במבחנה. באמצעות שיטה זו לבידוד נויטרופילים יקל על המשך מחקר פונקציות חיסוניות בתיווך נויטרופילים in vivo לשעבר vivo.

היכולת להשיג אוכלוסיות טהורות של נויטרופילים היא צעד ראשון חשוב לחקירת חולים עם מחלות אימונולוגיות 8. שיטת צפיפות הפרדת שיפוע היא טכניקה אידיאלית שבו תשואה גבוהה של תאים מתקבלת. methoד יהיה כרוך בתוספת פתרון שיפוע צפיפות בתחתית צינור המכיל דם אדם מדולל ואחריו צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 35 דקות ללא הפסקה. הטבעת של תאי mononuclear מופיעה על הממשק ואת נויטרופילים מתגוררים מתחת לשעבר. יש שיטה זו יתרונות משמעותיים ביחס משיטות אחרות כגון ערכות בידוד נויטרופילים שהן הרבה יותר 9 יקרים. בנוסף, בידוד נויטרופילים מדם אנושי על ידי ערכות מסחריות באמצעות נוגדנים המכוונים סמן משטח ספציפי עבור נויטרופילים אדם, להגביר את הסיכון של הפעלה או התמיינות תאים. שיטת ההפרדה צפיפות שיפוע מאפשר בידוד של נויטרופילים בתוך פרק זמן קצר. בתוך אותו שלב, תאים mononuclear גם מופרדים והחלים. זוהי טכניקה בסיסית שבה תשואה גבוהה של תאים טהורים מתקבלת על מנת להשיג שלמות תפקודית.

על מנת לחקות את הגידול microenvironment, ניסויי 3D בוצעו. בהינתן זמן מחצית החיים הקצר של נויטרופילים במבחנה, ניסויי 3D עם נויטרופילים אדם טריים אינם חד משמעיים. מסיבה זו, פרומיילוציטית (HL60) תאים מושרים להתמיין לתאי נויטרופילים דמוי באמצעות מעוררי הבידול sulfoxide דימתיל (DMSO) ו חומצה רטינואית (RA). שימוש בתאי HL60 בדיל (הבדל HL60) ימנע שיש תגובות שונות של נויטרופילים בשל בידוד מתורמים שונים.

ב 3D במבחנה מודלים תרבות מייצגים שלב ביניים בין מודלים 2D במבחנה במודלים vivo. בתרבות 2D, התאים להתפשט על פני פלסטיק ויוצרים מצורפים התא טבעי לחלבונים שהופקדו כי הם מפוגל על ​​משטח סינתטי זה. לעומת זאת, התאים מצורפים תאים תאים טבעי טופס תרבות 3D מאז התאים ואת תאי מטריקס הם לסנתז הם חומר טבעי אשר הם מחוברים.מסיבה זו, מודלי שיתוף תרבות 3D, במיוחד בין תאים סרטניים סוגי תאים אחרים, היו מאוד שימושיים המציין תרומתם צמיחת גידול, אנגיוגנזה, וגרורות. כתוצאה מכך, תרבויות 3D להפוך את תרבית תאים לחקות את התנאים הפיזיולוגיים הקיימים vivo 10.

Protocol

1. בידוד נויטרופילים ושיתוף תרבות עם תאים leukemic ראשוניים

הערה: פרוצדורות נערכו בכפוף לאישור של ועדת האתיקה ליון החולים עם כל החולים חתימת הסכמה מדעת.

  1. בידוד של תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים
    1. אסוף צינורות דם היקפי על EDTA (1.8 מ"ג EDTA למיליליטר דם) מן החולים שאובחנו עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL).
    2. הוסף כל 15 מ"ל של דם אל צינור 50 מ"ל סטרילי לדלל עם 15 מ"ל RPMI (דילול 1: 1), אז בזהירות ולאט לאט להוסיף 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לתחתית הצינור ללא ערבוב בשלבים. ודא כי פתרון שיפוע הצפיפות הוא ב RT לעריכה.
    3. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 35 דקות ב RT וללא בלמים. הדם צריך להפריד לארבעה שלבים ברורים כפי שמוצג באיור 1 א ', מלמעלה למטה: טסיות ופלסמה, תאים mononuclear (wהייט טבעת), פתרון שיפוע צפיפות, גרנולוציטים ו אריתרוציטים.
    4. אסוף את הטבעת לבן המייצג את התאים leukemic ראשוניים עם טפטפת פלסטיק פסטר והעברת צינור חדש 50 מ"ל.
      1. מלאו את הצינור עם PBS (מכיל סידן ומגנזיום) עד 50 מ"ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT.
      2. Resuspend גלולה עם 5 מ"ל PBS ולאחר מכן להוסיף PBS עד 50 מ"ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT.
      3. Resuspend גלולה עם המדיום RPMI שלם (RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ גלוטמין, 100 U / פניצילין מ"ל ו 100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין) לספירת באמצעות הדלפק כדאיות התא.
    5. לשאוב את השלבים העליונים עוזב את השלב גרנולוציטים ו אריתרוציטים ולהוסיף PBS עד 25 מ"ל ולאחר מכן להוסיף dextran 3% ב 0.9% NaClup 50 מיליליטר בסך הכל. מערבבים את צינורות 10 פעמים ולשמור אותם במשך 30 דקות ב RT ללא ערבוב.
    6. אסוף את שכבת נויטרופילים RBC-עניים העליוןd ולהכניס אותם לתוך צינור נקי סטרילי 50 מ"ל ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. Resuspend כל גלולה עם 5 מ"ל PBS ולאחר מכן להוסיף למאגר תמוגה התא אדום עד 50 מ"ל בסך הכל.
    7. שמור את הצינורות בחושך במשך 15 דקות ב RT אז צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS (להוסיף PBS עד 50 מיליליטר בסך הכל) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT.
    8. Resuspend את הכדורים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. שמור 3 x 10 5 של כל סוג תא ב 50 μl PBS-FBS (4%) צינורות פלסטיק 5 מ"ל כדי לקבוע את טוהר הבידוד שלהם באמצעות cytometry הזרימה.
  2. ניתוח ההופעות מורפולוגי של אוכלוסיות תאים המבודדות
    1. לשם כך, resuspend כל 3 x 10 4 נויטרופילים 3 x 10 4 תאים mononuclear ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי לאהוא צנטריפוגות מאוזן היטב.
    2. מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 750 XG במשך 10 דקות ב RT הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם.
    3. כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x.
  3. בדוק את הטוהר של תאים מבודדים על ידי FACS
    1. התווית תאי leukemic ראשוני המבודדים עם נוגדני CD19 אנטי אנושיים מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). לייבל נויטרופילים מטוהרים עם תערובת של נוגדנים אנטי אנושי המפורטים בטבלה 1 (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
    2. שוטפים את התאים עם 500 μl PBS-FBS (4%) בצנטריפוגה צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
    3. Resuspend כל גלולה ב 200 μl PBS-FBS (4%).
    4. לנתח על cytometer זרימה באמצעות התצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). ודא פיצוי הצבע.
  4. Coculture של תאים leukemic ראשוניים עם נויטרופילים עצמיים
    1. Seed 2 x 10 5 תאים / מ"ל של תאים leukemic ראשוניים לבד או עם נויטרופילים עצמיים בשעה 1:10 יחס במדיום RPMI להשלים. לשם כך, להתאים מספרים סלולריים על ידי המתלים תא דילול ולהוסיף 2 x 10 5 תאים / מ"ל של תאים leukemic ראשוניים עד 2 x 10 6 תאים / מ"ל נויטרופילים. מערבבים בזהירות.
    2. הוסף 25 מיקרומטר של טירוזין קינאז של ברוטון (BTK) מעכב (ibrutinib) אל התאים. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  5. קציר תא ניתוח FACS
    1. collect התאים צינורות פלסטיק 5 מ"ל לניתוח צנטריפוגות FACS צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשטוף את כדורי עם 1 מ"ל PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
    2. כדורי Resuspend ב Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית ו דגירת התאים בחושך במשך 10 דקות ב RT. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 2 א ו בתצורה האופטית הבאה: ליזר 488 ננומטר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). ודא פיצוי הצבע.

בידול 2. של תאים HL60 לאורך נתיב granulocytic ו Coculture שלהם עם תאים RL לימפומה B ב 3D דגם

  1. דיפרנציאציה של פרומיילוציטית האדם (HL60) תאים לתוך תאים נויטרופילים דמוי
    1. התאם מספר הסלולרי HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ"ל ולאחר מכן להוסיף 1 מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO להשרות התמיינות שלהם. כל זרע 3 x 10 5 תאי HL60 לכל היטב צלחת 48 היטב ואז דגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
    2. מאוחר יותר, לאסוף את התאים צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא.
    3. ואז לדלל ההשעיה תא בינוני RPMI מלאה, ומשנה את מספר הנייד HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ"ל ולגרום שוב הבידול שלהם על ידי הוספת 1 ​​מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO. כל זרע 3 x 10 5 HL60 תאים לכל היטב צלחת 48-היטב דגירה במשך 48 אחר שעה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  2. ניתוח של בידול HL60 (הבדל HL60)
    1. אוספים את התאים צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend גלול עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא.
    2. כדי לנתח את השינויים בביטוי סמנים על פני קרום התא על ידי cytometry הזרימה. מניחים כל 3 x 10 5 תאים שלא עברו התמיינות HL60 (מ תרבית תאים) ו -3 x 10 5 HL60 תאים diff צינורות פלסטיק 5 מ"ל לניתוח FACS ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
    3. Resuspend את הכדורים ב 50 μl PBS-FBS (4%). לייבל את התאים עם אנטי אנושי CD11b מצומדות כדי AF700 או CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
    4. לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend את הכדורים ב 200 μl PBS-FBS (4%).
    5. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגיה gating של איור 3A ואת התצורה האופטית הבאים: 488 ננומטר לייזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP); לייזר ננומטר 633: APC (660/20 BP), Alexa פלואוריד 700 (730/45 BP).
    6. כדי לבדוק את השינויים מורפולוגיים diff HL60, לשתק את התאים על גבי שקופיות זכוכית לבדיקה מיקרוסקופית.
      1. לשם כך, resuspend כל 3 x 10 4 תאים שלא עברו התמיינות HL60 (מ תרבית תאים) ו -3 x 10 4 diff HL60 ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי צנטריפוגות מאוזן.
      2. מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 1500 סל"ד במשך 10 דקות ב RT. הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם.
      3. כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x.
  3. 3-ממדי (3D) תרבות
    הערה: ודא כי החומרים המשמשים בניסוי זה הם קרים הניסוי מתקיים על קרח.
    1. Resuspend כל 5 x 10 4 תאים RL, לבד או מעורבב עם הבדל HL60 ב יחס RL: diff HL60 1:10, עם 300 μl מטריצה ​​קרום המרתף באמצעות 1 מ"ל קצה פיפטה לחתוך עם מספריים סטרילי כדי להרחיב את הפתח לכ 2 עד 3 מ"מ. הימנע בועות במהלך שלב זה.
    2. כל זרע 300 μl של השעית תא / גם בצלחת 24 גם. הימנע בועות במהלך שלב זה. דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל להשלים בינוני RPMI לכל היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. שנה את בינונית כל יומיים. הוסף 10 ננומטר vincristine ביום 5.
  4. ניתוח FACS
    1. לאחר 7 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום ולשטוף היטב עם כל 1 מ"ל קר כקרח PBS פעמיים. הוסף 3 מ"ל / היטב קר כקרח PBS-EDTA (5 מ"מ). לנתק את ג'ל מתחתית הבאר על ידי גירוד באמצעות בתחתית 200 קצה פיפטה μl. לנער את הצלחת בעדינות על קרח למשך 30 דקות.
    2. להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי ולנער את צינורות בעדינות על icדואר למשך 30 דקות אחרות. בדקו את המראה של השעית תא הומוגנית. (אם זה לא המקרה, אז לנער את התאים במשך זמן ארוך יותר או להוסיף עוד PBS-EDTA).
    3. בצנטריפוגה צינורות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS אז צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT.
    4. Resuspend עם PBS-FBS (4%) ו תווית עם נוגדנים CD19 אנטי אנושי מצומדות כדי PE-Cy7 ו נוגדן CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירה בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
    5. לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צינורות צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית.
    6. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 4 א ו בתצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP). ודא פיצוי הצבע.

תוצאות

שיטת צפיפות ההפרדה שיפוע המתואר כאן מספק תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים unstimulated מבודדים מהדם של חולי CLL איור 1A מייצג את שכבות הדם השונות שהתקבלו לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות (מלמעלה למטה:. טסיות ופלסמה, טבעת לבן מייצג את התאים mononuclear, צפיפות ש...

Discussion

המתוארת כאן, פרוטוקול יעיל, פשוט, מהיר וזול עבור הבידוד של נויטרופילים מדם אנושי עם טוהר גבוה שימוש בגישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות ובתוך אותם תאי mononuclear הצעד מופרדים גם וחלים. אוכלוסיות התאים הבודדות הן ≥90% טהורות.

שיטות קיימות מספ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 Gibco Invitrogen21875-034
Fetal bovine serum (FBS)Gibco Invitrogen10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)Gibco Invitrogen14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)Life technologies25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)Life technologies15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) CliniSciencesA3001
Vincristine EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix BD Biosciences354234Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer BD Biosciences555899
Ficoll (Pancoll)PAN BiotechP04-60500
Dextran Sigma-AldrichD8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Retinoic acidSigma-AldrichR2625
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Sodium chloride (NaCl)EuromedexS3014
Annexing V-FLOUS staining kit Roche11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kitCosmos BiomedicalCB361550-0000
LSRII flow cytometryBD Biosciences
CytocentrifugeThermo Scientific
Leica DMR-XA microscopeLeica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability CounterNexcelom  Bioscience

References

  1. Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
  4. DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
  6. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
  7. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
  8. Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
  9. Aynaud, M. -. M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
  10. Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
  11. Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
  12. Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
  13. Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
  14. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
  15. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
  16. Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
  17. Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
  18. Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
  19. Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
  20. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
  21. Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
  22. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
  23. Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
  24. Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
  25. Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
  26. Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

109HL60 diff3DCytometry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved