בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Summary

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Abstract

תאי האנדותל המרפדים את הדופן הפנימי של כלי דם יש תפקיד חשוב בוויסות של טון וסקולרית, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה. תפקוד לקוי של תא האנדותל הוא מעורב בהתפתחות והתקדמות של מחלות לב וכלי דם רבים, כולל מחלת לב איסכמית. כדי לבחון את הפונקציה ואפיון של תאי אנדותל כליליים, בידוד תא הוא הצעד הראשון וזה דורש טוהר וכמות גבוהים לערוך ניסויים הבאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לבודד תאי אנדותל כלילית עכבר בוגר. לב העכבר הוא גזור טחון לחתיכות קטנות. לאחר העיכול של הלב באמצעות dispase ו collagenase השנייה, התאים נשטפים וטופחו עם חרוזים מגנטיים אשר מצומדות עם נוגדנים נגד CD31. החרוזים עם תאי אנדותל נשטפים מספר פעמים והם מוכנים להשתמש ביישומים שונים, כולל הדמיה experime ביולוגית מולקולריתnts. בידוד יעיל בתשואה של כ 10 ⁴ תאים לכל לב אחד עם מעל 90 טוהר%.

Introduction

מודלי עכבר של מחלות לב וכלי דם שונות והפרעות מטבוליות לשאת שינויים פיסיולוגיים ומולקולריים דומים לאלה שנמצאו בחולים. יתר על כן, שינוי גנטי של עכברים הוא כלי רב עוצמה המאפשר לנו לחקור את תפקיד פתוגניים של גנים ספציפיים בהתפתחות והתקדמות של מחלות. כיום, תאים מסוג הגן ספציפי-עקום או עכברים אאוט נוצרים בקלות במעבדות רבות ומדידת mRNA ורמות חלבון סוגי תאים מסוימים הוא הצעד הראשון בקביעה אם העכברים היו באמת מהונדסים גנטיים.

האנדותל היא שכבה דקה אחת של תאי האנדותל (EC) המרפד את קיר כלי הדם הפנימי. תאי האנדותל ממלאים תפקיד קריטי בויסות מתח כלי דם, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה ^1,2. תפקוד לקוי של האנדותל היא סימן ההיכר של מצבים פתולוגיים רבים ושינויים בתפקוד האנדותל יכול להוביל רכב שונים^3,4 מחלות diovascular. זהו אפוא משמעותיים ללמוד את הפונקציה של תאי אנדותל בתנאים פיסיולוגיים pathophysiological.

ישנן מספר דרכים כדי לבודד ECS ^5-8 ואת שיטת הבידוד צריכה להיות מותאמת תלוי באיזה רקמות ומינים ישמשו. הסיבה לכך היא כי ECS מרקמות שונות להציג רמה גבוהה של ההטרוגניות ביחס סמני המשטח וביטוי חלבון שלהם ^9. בידוד מוצלח של תאי אנדותל לעתים קרובות יכול להיות מאתגר ומחייבת מידה מסוימת של אימון ותרגול. לאחר שהושגה, שיטת הבידוד הציע בפרוטוקול זה מוכיח להיות יציב ויעיל.

המטרה הכללית של שיטה זו היא להשיג עכבר הכליליים ECS (MCECs) באיכות גבוהה ובכמות. למרות כמות התאים שנאספה לב היא פחות תאים שנאספו מרקמות אחרות תוך שימוש בטכניקות אחרות, שיטה זו עדיין מספקת הימוראיכות ter. טוהר תאי אנדותל באוכלוסייה שתתקבל יהיה גדול מ -90%. לפיכך, טכניקה זו תהיה אידיאלית עבור יישומים המסתמכים על תאי האנדותל מבודדים גרידא כגון הדמית תא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

המחקר על העכברים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) מאוניברסיטת אריזונה בוצעה על פי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH) הנחיות.

הערה: סעיפים 1, 2 ו -3 צריכות להתבצע היום לפני הניסוי כפי התקנה.

1. פתרונות הכנה

1. חיץ CD31 (50 מ"ל)
   1. הוסף 50 מ"ל 1 × חיץ מלוחים פוספט (PBS) כדי שפופרת 50 מ"ל. לשקול 0.05 גרם שור סרום אלבומין (BSA) ו 0.037 גרם חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ולהוסיף הצינור 50 מ"ל ולשים את הצינור כדי לסובב במשך כ 1 ח עד להמסת האבקה. התאם ל- pH 7.4, מסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ"ל, ולאחסן ב 4 C עד השימוש.
2. תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) עם HEPES (500 מ"ל)
   1. להוסיף 1.1915 גרם של HEPES לעשות 10 מ"מ HEPES בתמיסה HBSS ומערבבים היטב. מדוד את pH ולהתאים ל -7.4. סנן ולאחסן ב 4ג.
3. הפתרון של 1x Kreb (1 ליטר)
   1. הוספת 100 מ"ל של 10 × פתרון של Kreb [טבלה 1] להכפיל מים מזוקקים בבקבוק 1 ליטר. לשקול 2.1 גרם נתרן ביקרבונט ו -2 גרם D- גלוקוז ומוסיפים את הבקבוק. מערבבים ולהתאים את הנפח הכולל עד 1 ל
   2. פתרון בועה עם 95% O _2/5% CO ₂ גז במשך 30 דקות פתרון ולסנן בתוך מכסה המנוע. חנות ב 4 C ולשמור על הקרח במהלך הניסוי.

2. הכנת החרוזים המגנטיים

1. הוסף 1 מ"ל חיץ CD31 לתוך כל צינור 1.5 מ"ל (צינור אחד לדגימה). מערבבים את החרוזים IgG אנטי עכברוש כבשים ולהוסיף את הכמות המתאימה מדגם [טבלה 1]. לנער את הצינורות במרץ 30 פעמים ומניחים אותם בצלחת מגנטי דקות 1 של טלטול. פתח את הצינורות בעוד על הצלחת ולזרוק פתרונות לדליים.
2. הוסף חוצץ CD31 1 מ"ל לתוך צינור אחד. מוסיפים 2 עכברוש μl אנטי עכבר אנטי CD31הגוף על צינור אחד ולסובב צינורות O / N ב 4 ºC.

3. מעוקר

1. החיטוי כל כלי ניתוח וטיפים פיפטה. חותכים את הקצוות של טיפים פיפטה כך יש עצות עם 4 קטרים ​​שונים, מן הרחב אל הצר. בקטרים ​​משוערים על העצות הם 3 מ"מ, 2.5 מ"מ, 2 מ"מ, ו -1.5 מ"מ בהתאמה. חותך את טיפי חיטוי היום קודם לכן עם 30 דקות של עיקור בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס.
   הערה: סעיפים 4 - 11 צריך להתבצע ביום של הניסוי.

4. פתרונות הכנה

1. הכן חיץ כביסה המכיל 2% משורינת עגל סרום (IFCS) ב M199. עבור הדמיה, להכין 30 מ"ל / עכבר.
2. הכן פתרון אנזים (10 מ"ל / לדוגמה). לשקול 0.6 יחידה / מ"ל ​​של Dispase ו 1 מ"ג / מ"ל ​​של Collagenase Type II לתוך צינור 50 מ"ל. להוסיף M199 לסובב את הצינור ב 4 ºC במשך 15 דקות. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ"ל insidדואר למכסה המנוע ולשמור על 4 C עד השימוש.
3. כן HBSS / HEPES עם הפרין. הוסף 10 מ"ל של HBSS עם 10 HEPES מ"מ ב 15 מ"ל צינור. הוספת 100 μl של הפרין אל הצינור ולשמור על 4 C עד השימוש.

5. שטיפת חרוזים

1. להוציא את הצינורות עם החרוזים מן הכתף ב 4 ºC ומביאים את מכסה המנוע. מניח את הצינורות בצלחת המגנטית ולנער דקות 1. דאמפ הפתרון ולהוסיף חיץ CD31 1 מ"ל לתוך צינור אחד.
2. קח את הצינורות מתוך הצלחת המגנטית לנער במרץ 30 פעמים. שים את הצינורות בחזרה בצלחת המגנטית וחזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. לאחר השלמת, לשים את הצינורות בחזרה 4C ולשמור מסתובבת עד השימוש.

6. Dissection

1. להזריק את העכברים intraperitoneally עם 0.1 מ"ל של הפרין כדי למנוע קרישת דם. המתן 10 דקות, ואז להרדים את העכברים באמצעות זריקה intraperitoneal של 0.01 מ"ל של Pentobarbital. בדוק אם העכבר הוא מרגיש כאב על ידי צובט את הרגל.
2. מניח את העכבר על לוח קלקר עם ראש כלפי מעלה וחזק זרועות עם סיכות. שימוש במלקחיים ו-לגזור במספריים קשים לחתוך את העור באזור החזה העליון עד הגרון.
3. ביצוע חתך במרכז כלוב הצלעות רק מעל הסרעפת. חותכים את העצם הצידה ולמעלה לכיוון הגרון כדי להפוך משולש לחשוף את הלב והריאות. חותכים את אבי העורקים בדיוק מעל הסרעפת.
4. החזק את התימוס עם מלקחיים ללא משייכת ולהשתמש מספריים לחתוך את כל רקמת חיבור בקפידה כדי לסלק ריאות ולב יחד. רקמות מקום בכוס עם 1 × Kreb של, לנער עם מלקחיים ולהעביר עד 6 צלחת ס"מ עם 1 × Kreb של.
5. הסר את האונה של הריאות באמצעות מספרי מלקחיים. הכנס קטטר סטרילי 20 G לתוך אבי העורקים. שטוף את הדם במערכת הדם הכליליים עם HBSS / הפרין. ביצוע חתך קטן החדר, לנער את הלב ולהעביר לצינור מדגם של M199. שמור צינורות על הקרח.

class = "jove_title"> 7. עיכול רקמות

1. מעבירים את הלב אל צלחת 6 ס"מ מלא 10 מ"ל של תמיסת אנזים ופשטי- אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים. מניחים את הכלים בחממה 37 ºC במשך 15 דקות. להתסיס חומרים מתעכל על ידי pipetting למעלה ולמטה 30 פעמים באמצעות טיפ עם הקצוות כדי לאפשר לרקמות לעבור קל.
2. שים את זה בחזרה בחממת 37 ºC עבור 15 דקות אחרות. חזרו על תסיסה שלוש פעמים, בכל פעם באמצעות טיפים פיפטה מהפתחים גדולים ביותר צרה ביותר ו -15 דגירה דקה בין כל אחד.
3. לאחר דגירה 15 דקות האחרונות, לקחת דגימות החוצה לתוך מכסה המנוע. פתרון עד Pipet ולמטה 30 פעמים באמצעות טיפ pipet עם פתיחת הצרה ביותר ולהעביר דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור חדש 50 מ"ל.
4. לשטוף את המנה עם כביסה חיץ 10 מ"ל בעזרת פיפטה 10 מ"ל ולהעביר על מסננת התא. שים את 50 מ"ל צינורות בצנטריפוגה ספין ב 400 גרם במשך 10 דקות ב RT.

itle "> 8. כביסה הצמדתי עם חרוזים

1. הסר supernatant מבלי לשבש את הגלולה. שטפו תאים עם חיץ כביסה 5 מ"ל פעמיים.
2. קבל אחד בעבר הכינו צינורות 1.5 מ"ל עם חרוזים ולעבוד על צינור אחד בכל פעם. שים צינור 1.5 מיליליטר אחד בצלחת המגנטית, לנער 3 פעמים ולפתוח אותו.
3. לאחר צנטריפוגה האחרון, להסיר supernatant ככל האפשר מבלי לשבש את הגלולה. לנתק את גושי תאים על ידי מצליף במרץ.
4. הוסף חוצץ כביסה 1 מ"ל צינור 50 מ"ל ו לערבב את התאים עם טפטפת 1 מ"ל. דאמפ הפתרון מהצינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של תרחיף תאים מהצינור 50 מ"ל של חרוזים. פליק הצינורות 30 פעמים ואז לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

9. הכנות לקראת תרבית תאים / דימות

1. כן תאי עבור תאי ציפוי. הוסף פתרון ג'לטין (5% w / v, 300 μl) לתא היטב כדי לצפות את משטח דגירה במשך 30 דקות ב 37 ºC. לאחר דגירה, remג'לטין אובה ויבש לפני השטח.
2. להוציא את הצינורות עם חרוזים / תאים לאחר 30 דקות של סיבוב ולשים בצלחת המגנטית בתוך מכסה המנוע. Shake למשך 2 דקות, מזבלה ולהוסיף חיץ כביסה 1 מ"ל.
3. קחו צינורות מתוך הצלחת, לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. שים אותם בחזרה צלחת מגנטית ולנער דקות 1. חזור 4 פעמים עבור סכום כולל של 5 שטיפות, אבל עם 1 דקות רועדות על הצלחת.
4. לאחר לשטוף האחרון, להוציא צינור אחד ולעבוד על כל אחד צינור בכל פעם. Shake 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. שים את זה על הצלחת המגנטית ולנער דקות 1. דאמפ ולהוסיף 1 מ"ל 20% התקשורת IFCS EC (מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס).
5. לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. התאם pipet 500 μl ו pipet למעלה ולמטה 10 פעמים. העבר 500 μl לכל תא.
6. שים בבית חממה 37 ºC ולהשאיר O / N. למחרת, לשטוף תאים עם 10% תקשורת FBS EC.

10. הכנות לקראת דוגמאות כתם המערבי (WB)

1. טאקדואר את הצינורות עם חרוזים / תאים לאחר 1 hr סיבוב. שים אותם בצלחת המגנטית ולנער למשך 2 דקות. דאמפ supernatant ולהוסיף 1 מ"ל HBSS קר. לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. חזור פעמים עבור 3 שוטף, אבל עם 1 דקות רועדות על הצלחת.
2. לאחר לשטוף האחרון, לשים צינורות בצלחת מגנטית ולנער דקות 1. הסר חוצץ באמצעות פיפטה lyse התאים עבור WB באמצעות שיטה שתוארה לעיל ^11,12. lysate המצטבר בדרך כלל מכיל כ -30 מיקרוגרם של חלבון.

הדמיה 11.

1. שוטפים את התאים 3 פעמים עם התקשורת, עם נפח סופי של 250 μl עבור תא. הוסף 1.5 μl של דיל-acLDL אל התאים. מנקודה זו, לשמור על התאים בחושך.
2. דגירה של 3.5 שעות ב 37 ג. הוסף 1.5 μl של Hoechst, מערבבים היטב דגירה במשך 30 דקות ב 37 תאים ˚C.Wash עם PBS ולתקן עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות ב RT.
3. שטפו פעמיים עם PBS ולחסום עם 5% BSA-PBS עבור 30 מילn ב RT. שטפו פעמיים עם 1% BSA-PBS. לדלל BS-לקטינים-FITC באמצעות 1% BSA-PBS לריכוז של 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​ולהוסיף 300 μl לכל תא.
4. שים את התא על שייקר מסלולית ב RT במשך 30 דקות. לשטוף עם 3 פעמים PBS.
5. דמיינו התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זמן חשיפה של 200 מילי-שניות עבור FITC (מכתים לקטינים, סמן EC, עירור / פליטה 488 ננומטר / 519 ננומטר), 30 msec עבור DAPI (Hoechst, עירור, מכתים גרעיני / פליטה ב 358 ננומטר / 461 ננומטר), ו -300 msec עבור TRITC (מכתים acLDL, סמן EC, עירור / פליטה ב 557 ננומטר / 576 ננומטר). לרכוש תמונות באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הבידוד המוצלח של תאי אנדותל כליליים מלב עכבר בדרך כלל מניב כ -10 ⁴ תאים עם מעל 90 טוהר% עם צורה מרוצפת. עבור אוכלוסייה טהורה של תאי אנדותל, יש לנקוט זהירות בכל הפרוטוקול כדי להבטיח סביבת סטרילית חופשית מכל זיהום. הופעת תאים מוארכים או תאים מוגדלים ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לתאי אנדותל ביותר בשימוש נרחב במחקר הם לתאי אנדותל אנושיים הטבור וריד (HUVECs) בגלל הנוחות וקלות culturing שלהם. עם זאת, הרבה מחקר דורש הזמינות של מודל פיסיולוגי שהשיג הבידוד של בתאי האנדותל מאיברים ספציפיים אחרים ^10. תאי האנדותל לפצות אוכלוסיית קטין מאוד של תאים ברקמת ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Sigma	A3311-10G
EDTA	Fisher	BP120-500
HBSS	Fisher	SH3026801
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
DynaBeads pan mouse IgG beads	Thermo Fisher Scientific	11035
Rat anti-mouse CD31 Antibody	BD Biosciences	550274
IFCS	Fisher	SH30072.04
M199	Fisher	MT10060-CV
Dispase (Neutral Protease)	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS02109
Collagenase Type II	Worthington Biochemical Corp./Fisher	LS004176
Glycerol	Fisher	BP381-1
Igepal	Sigma	I3021-50 ml
Phosphatase inhibitor cocktail	Sigma	P0044-1ml
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340-1 ml
Heparin	Sigma	H3149-100KU
FBS	Fisher/Mediatech	MT35010CV
D-Valine	Sigma	V1255-5G
EGS	Corning	356006
Penicillin/Streptomycin	Fisher/Mediatech	MT-30-002-CI