בידוד של ענק Lampbrush כרומוזומים מחי ביציות של צפרדעי סלמנדרות

Summary

אנו מציגים טכניקות פשוטות לבידוד הכרומוזומים lampbrush פעיל תעתיק ענק לחיות ביציות של צפרדעים סלמנדרות. בהמשך נתאר כיצד להתבונן הכרומוזומים הללו "חי" על ידי בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת, וכיצד לתקן אותם ניאון הכלאה באתרו או מכתים immunofluorescent.

Abstract

אנו מתארים שיטות ללימוד הכרומוזומים lampbrush הפעילים הענקים תעתיק (LBCs) נמצאים הביצית, או ביצה תאבה מין, צפרדעים וסלמנדרות. LBCs פרט יכול להיות עד 1 מ"מ אורך והם מתגוררים גרעין ענק, עצמו עד 0.5 מ"מ קוטר. גודלו של הכרומוזומים מתיר תצפיות ללא תחרות של גנים פעילים ידי מיקרוסקופיה אופטית האור, אבל בעת ובעונה אחת טכניקות מיוחדות נדרשים לבידוד הגרעין, הסרת מעטפת הגרעין, והפצת הכרומוזומים בשקופית מיקרוסקופ. גרעין הביצית, הנקרא גם השלפוחית ​​הנבטיה (GV), מבודד מדיום המאפשר gelling החלקית של תקטין הגרעיני ושמר את המבנה העדין של LBCs. שלב זה מתבצע באופן ידני תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים של צורף. בשלב הבא, מעטפת הגרעין מוסר, שוב באופן ידני עם מלקחיים של צורף. תכני הגרעין מועברים במהירות מדיום disperses הג'ל יקטין ומאפשר LBCs הניזוק להתיישב לשקופית מיקרוסקופ. בשלב זה LBCs האברונים גרעיניים אחרים ניתן לצפות על ידי בניגוד שלב או מיקרוסקופיה התערבות הפרש לעומת זאת, אם כי פרטים עדינים מטושטשים על ידי תנועה בראונית. להסתכלות Microscopical ברזולוציה גבוהה או ניתוח מולקולרי, הכנת כולו centrifuged לצרף את LBCs עדין בתוקף לשקופית. קיבעון קצר paraformaldehyde לאחר מכן על ידי מכתים immunofluorescent או הכלאה באתרו. LBCs נמצא במצב תעתיק פעיל הגודל העצום שלהם מאפשר ניתוח מולקולרי ברמת הגן הבודדה באמצעות confocal או מיקרוסקופ ברזולוציה סופר.

Introduction

רוב בעלי החוליות, למעט, יש לציין של חיות כיס ויונקי שליה, לייצר ביציות yolky גדולות. למרות גודלם לפעמים עצום, ביצים אלה הם תאים בודדים שמגיעים מימד הסופי שלהם ועדיין בשחלה של הנקבה. ביצי השחלות נקראות ביציות וכל בדרך כלל בנוי מגרעין ענק יחיד, ידוע מאז 19 בתחילת המאה ^ה כמו השלפוחית הנבטיה או פשוט GV. ¹ ביציות צפרדעי המעבדה המשותפות, laevis Xenopus ו tropicalis Xenopus, להגיע בקוטר מקסימאלי של 1.2 מ"מ ו 0.8 מ"מ בהתאמה (איור 1). Gvs מ ביציות בוגרות של שתי צפרדעים אלה הם 0.3 - 0.4 מ"מ קוטר (איורים 2, 3). סלמנדרות בדרך כלל יש גם ביציות גדולות Gvs. מלא ביציות בוגרות של אקסולוטל המקסיקני, Ambystoma mexicanum, יותר מ -2 מ"מ קוטר ואת GV היא כ 0.5 מ"מ. לפיכך, גרעינים אלה גלויים בקלות בעין בלתי מזוינת פחיתלטפל בדרכים רבות כי הם בלתי אפשריים עם הגרעינים של תאי סומטיים טיפוסיים.

לא פחות מדהים הוא בגודל הענק של הכרומוזומים בתוך GV, עובדה המוכרת כבר בסוף המאה ^{ה -19.} כרומוזומים בודדים של Ambystoma וסלמנדרות אחרות יכולים להיות עד 1 מ"מ האורך (איורים 4, 5). אלה של Xenopus הם ניכרים קטנים, אם כי עם אורכים עד 100 מיקרומטר או יותר, הם מגמדים את הכרומוזומים סומטיים הטיפוסיים של רוב האורגניזמים. תכונה חשובה של כרומוזומים ביצית היא פעילות התעתיק יוצאת הדופן שלהם, מה שמוביל לאחת תכונות המורפולוגיות האופייניות להם - מאות לולאות לרוחב לזווג (איור 5). לולאה כל מורכב אחד או כמה יחידות שעתוק כי פעיל לסנתז RNA. הלולאות לתת ביצית הכרומוזומים מראה מטושטש, מה שהוביל את השם "lampbrush" כרומוזום לאחר השטחי שלהםדמיון המברשות בשימוש בתקופות קודמות לנקות ארובות מנורת נפט. ²

ההתמקדות של מאמר זה היא על השימוש Gvs מבודד ללמוד LBCs האברונים גרעיניים (nucleoli, גופי מוקד היסטון, ואת כתמים). שני די טכניקות שונות יתוארו. בחלק הראשון, הטכניקה הנפוצה יותר, Gvs מבודד בתוך תמיסת מלח באמצעות המלקחיים של צורף, שטוף בקצרה להסיר חלמון חסיד, ואת מעטפת הגרעין מוסרת, שוב עם המלקחיים של צורף. התכנים הדביקים, המכילים את LBCs האברונים גרעיניים, מותר להתיישב לשקופית מיקרוסקופ זכוכית או coverslip. הכנות כזה ניתן לבדוק באופן ישיר על ידי בניגוד שלב או מיקרוסקופיה DIC. לחלופין, ההכנות ניתן centrifuged לצרף את LBCs האברונים לשקופית או coverslip. הכנות כזה יכול להיות מעובד מכן לניתוח מולקולרי מפורט של חומצות גרעין וחלבונים, בעיקר על ידי immunofluorescence ו fluorescent הכלאה באתרו (FISH). ^3-7

טכניקה שנייה כרוכה בידוד של GV בשמן מינרלים. ⁸ Gvs-מבודד שמן נשאר פעיל תעתיק במשך שעות רבות מועיל פוטנציאלי עבור מחקרים שבם אחד לא רוצה את התוכן הגרעיני להיות מציאותי ככל האפשר. ^9,10 בגלל מקדם השבירה של "מוהל" הגרעין קרובה לזו של LBCs האברונים גרעיניים אחרים (איור 3), טכניקות Microscopical יכול להיות אתגר עם Gvs שמן-מבודד.

לבסוף, בגלל הגודל וקל מניפולציה שלהם, Gvs הוא חומר אידיאלי עבור מחקרים על מעטפת הגרעין. המתחם הנקבובי הגרעין תואר לראשונה ממחקרים מיקרוסקופים אלקטרונים על מעטפות GV דוחות ¹¹ ותצפיות superresolution אחרונות יותר השתמש באותו חומר. ^12,13

Protocol

מידע כללי על צפרדעים וסלמנדרות, וכן המקורות של בעלי חיים, ניתן למצוא באתרי האינטרנט הבאים: Xenbase (http://www.xenbase.org) וסאל באתר (http://www.ambystoma.org). פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות טיפול בבעלי חיים המחלקה ואמבריולוגיה ממכון קרנגי למדע.

1. פתרונות

1. הפוך 10 L "מים צפרדע": להוסיף 10 מ"ל של 1 M CaCl ₂ ו 10 מ"ל של 1 M NaHCO ₃ עד 10 L ללא יונים או dechlorinated H ₂ O עם ערבוב.
2. הפוך 1 L 20% paraformaldehyde: הפוך 1 ליטר של 4 מ"מ Na _{2 3} CO. במנדף כימי להוסיף 200 גרם של paraformaldehyde אבקה, וחום לכ -80 ^מעלות צלסיוס לפזר. מגניב, ולסנן דרך נייר סינון. זהירות: paraformaldehyde הוא רעיל ויש לטפל בו בזהירות. לחלופין, לרכוש פתרון paraformaldehyde מסחרי.
3. הפוך 1 L ההרדמה אמפיבי: להוסיף 1.5 גרם של אתיל 3-aminobenmethanesulfonate zoate למי צפרדע 1 L. חנות בטמפרטורת החדר.
4. הפוך בינוני תרבות 1 L הביצית OR2 ^14: 82.5 מ"מ NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 1 מ"מ ₂ CaCl, 1 מ"מ MgCl _2, 1 mM Na _{2 4} HPO, 5 HEPES מ"מ (מ -500 מ"מ המניות, pH 8.3). ה- pH הסופי יהיה כ 7.8 pH. הוספת 100 אמפיצילין מ"ג ו -100 מ"ג סטרפטומיצין כדי למנוע התפתחות חיידקים.
5. בצע פתרון בידוד GV 1 L: 83 מ"מ KCl, 17 mM NaCl, 6.5 מ"מ Na _{2 4} HPO, 3.5 מ"מ KH _{2 4} PO, 1 מ"מ MgCl _2, 1 מ"מ dithiothreitol (DTT). התאם ל -7.0 pH.
6. הפוך 100 פתרון פיזור מ"ל GV: 20.7 מ"מ KCl, 4.3 מ"מ NaCl, 1.6 מ"מ Na ₂ HPO _4, 0.9 מ"מ KH _{2 4} PO, 1 מ"מ MgCl _2, 1 מ"מ dithiothreitol (DTT), 0.1% paraformaldehyde. התאם ל -7.0 pH. כדי להקל על פיזור מהיר יותר של ג'ל הגרעיני, להוסיף 10-50 מיקרומטר CaCl _2.
7. הפוך 500 פתרון subbing מ"ל. 0.5 גרמו יופי של ג'לטין מסחרי 20 מ"ל H ₂ O עבור 5 - 10 דקות. הוסף 500 מ"ל רותחים H ₂ O ובזהירות מערבולת לפזר את הג'לטין. CRK מגניב להוסיף 50 מ"ג (SO _{4) 2 ·} 12 H ₂ O. מסנן עם יניקה ולאחסן ב 4 ^מעלות צלסיוס
8. הפוך 10 מ"ל הרכבה בינונית. ממיסים 10 מ"ג phenylenediamine ב 5 מ"ל PBS (135 mM NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 4.3 מ"מ Na ₂ HPO _4, 1.5 מ"מ KH ₂ PO _4, מותאם pH 9). הוסף 5 מ"ל גליצרול. חנות ב 250 aliquots μL ב -80 ^o C.

2. חומרים

1. עבור שקופיות לספסל, מיקרוסקופ זכוכית במקום 3 אינץ 'x 1 אינטש ומחליק בתמיסת דטרגנט מסחרית ולשפשף אותם כדי להסיר כל מזהמים. מניחים בתוך מתלה השקופית ולשטוף היטב במי ברז, אז מים ללא יונים. טובלים את השקופיות הפתרון subbing, לנקז בזווית, ואופים לילה בשעה 60 ^o C.
2. עבור ריבועי פלסטיק, לחתוך 25 ריבועי מ"מ מסדין של 1 מ"מ פולי העבים (methacrylate מתיל). לקדוח5 מ"מ עגול חור במרכז כל ריבוע. חול בשני פניה ואת הקצוות של הכיכר, כמו גם ההיקף של החור.
   הערה: כחלופת תוצרת בית ריבועי פלסטיק ומגלשות היטב, כפי שתואר בפסקה הבא, השתמש דבק מסחרי באתרו PCR ותאי הכלאה (25 μL). אפשר כנראה גם להשתמש המבודדים סיליקון מחדש שמיש עבור תרבית תאים, אם כי זה לא נבדק ביסודיות עד כה.
3. עבור שקופיות היטב, להמיס 20 - 30 גרם של שעוות פרפין (56 - 57 ^מעלות צלסיוס) בכוס זכוכית 50 מ"ל על פלטה חשמלית. עם טפטפת 20 μL, להפיץ טיפה אחת 5 μL של פרפין בכל צד של מרכז שקופית לספסל. קש על ריבוע פלסטיק לתוך פרפין במקום להחליק לתוך הצלחת הלוהטת. גם הנפט יתמוסס וצריך להתפשט באופן שווה מתחת לכיכר הפלסטיק.
   1. להסיר את השקופית מהצלחת החמה ומניח בצד לקירור. מניח תמיכה מתחת לכל מגלשה, כך שהגלישה לא לפנות tabletop במהלך תהליך הקירור. אם פרפין מתקרר מהר מדי, הוא עלול להתרחק מהחור המרכזי. כן 10 או יותר שקופית היטב: כל הכנת GV משתמשת שקופית באר חדשה.
4. במקרה של ספקים ולהחליק על צנטריפוגה, להשתמש נבנה ספקים במיוחד עבור הרוטור בשימוש. יצרנים אחדים לספק צנטריפוגות עם ספקים עבור 96 - גם צלחות פלסטיק. ספקים אלה ניתן להתאים בקלות להחזיק שקופיות מיקרוסקופ.

3. בידוד של ביציות

1. הוסף צפרדע נקבה בוגרת (laevis Xenopus או tropicalis Xenopus) או סלמנדרה (mexicanum Ambystoma) בתמיסת הרדמה מספיק כדי לכסות את החיה לחלוטין. כאשר החיה מפסיקה תנועה, למקם אותו בטן כלפי מעלה על גבי מצע של קרח סדוק במכל מתאים.
2. עם מספריים כירורגיות לבצע 2 - חתך ס"מ 3 בבטן התחתונה לרוחב קו האמצע. הזז את האיברים הפנימיים בעדינות הצידה כדי למצוא את והשחלה של החתך (there שתי השחלות, אחד בכל צד של הבטן). לגזור חלק של השחלה עם מספיק ביציות עבור הניסויים המתוכננים. מאז יש אלף ביציות בכל שחלה, פיסה קטנה יחסית של שחלה (1 - 3 סנטימטרים) בדרך כלל תספיק.
3. מקום אחד או כמה פיסות השחלה מלוחים OR2 בצלחת פטרי גדולה (100 מ"מ) בטמפרטורת החדר. ביציות ניתן לאחסן במצב טוב במשך כמה ימים, אם ביציות פגומות יוסרו פתרון OR2 מוחלף מדי יום.
4. לתפור את החתך עם משי כירורגית מוחזרים לבעליו קערת זכוכית בודדת להתאוששות. להוסיף מספיק "מי צפרדע" כדי לכסות את החיה עד שהוא חוזר להכרה (כ -15 דקות). אחרי החיה מראה תנועות רצוניות, למלא את הקערה עם מים. למרות אמורים לשמש מים מתוקים, עקרות אינן הכרחיות, כמו דו-חי כמעט אף פעם לא להידבק לאחר ניתוח. אם תרצה, neomycin ניתן ליישם את התפרים. הפצע בדרך כלל מרפא לחלוטין לאחר Feימי w ואותו בעל חיים יכולים לשמש שוב לאחר כ 2 חודשים.

בידוד 4. של רמינל שלפוחיות (GV)

1. מניח חלק שחלה (10 - 20 ביציות גדולות) בצלחת פטרי קטנה (35 x 10 מ"מימ) המכילה פתרון OR2.
2. סר ביצית מהשחלה באמצעות שני זוגות המלקחיים של צורף # 5 לקרוע את הגבעול הדק של רקמה שמחבר את הביצית אל קיר השחלה. מניח את הביצית אחרת בצלחת פטרי קטנה המכילה בינוני בידוד GV.
   הערה: מצב LBCs תלוי בגודל (בגרות) של הביצית. LBCs להגיע אורך מקסימאלי עם לולאות בולטות ביציות כי הם מעט פחות מאשר בגודל מלא. הביציות הבשלות לרוב מכילות כרומוזומים קצרים עם לולאות נדבקות.
3. בצע את השלבים הבאים בהגדלה נמוכה של מיקרוסקופ לנתח (קוטר שדה כ 10 - 20 מ"מ).
   1. אחוז הביצית עם שני זוגות מלקחיים ליד הקוטב בעלי חיים (אונה כהה) ולעשות SMכל דמעה. חפש ב חלמון משוחלים עבור גרעין הביצית שקוף, הנקרא גם שלפוחית ​​או GV נבטי.
   2. לחלופין, נקבו חור גדול ליד הקוטב חיה עם זוג אחד של מלקחיים בעדינות לסחוט את GV יחד עם חלמון (איור 2).
   3. בעדינות לגלגל את GV הרחק הארי של חלמון. בדרך כלל תהיה כמות קטנה של חלמון בחוזקה חסיד אל GV.

הסרת 5. של מעטפת הגרעין

1. לקבלת laevis X. ו tropicalis X., להעביר את GV ממדיום הבידוד למדיום מתפשט תוך 60 שעות של בידוד, אפילו אם עדיין יש חלמון חסיד קטן.
   הערה: Gvs של שני אלה מינים "להקשיח" בתוך כ -60 שניות אם נותר בטווח הבינוני הבידוד לא יתפשט בשלבים הבאים. לכן המהירות היא בעלת חשיבות עליונה כאשר בוחנים תוכן Xenopus GV.
   1. אחוז מעטפת הגרעין בסמוך לחלקו העליון של GV עם זוג אחדהמלקחיים של צורף, נזהר שלא ומהדק. אחוז את המעטפה עם זוג נוסף של מלקחיים כמו לסגור את הראשון ככל האפשר. משוך את שני זוגות מלקחיים אחד משני ואת תוך GV יהיו "פופ" מתוך חינם של המעטפה, הדוגלת בחוזקה מלקחיים אחד או שניהם.
   2. תרים את תוכן GV ב פיפטה מזכוכית או micropipette 20 μL מתכווננת. אם באמצעות פיפטה מתכווננת, להגדיר פיפטה עד 10 μL ו לחתוך את הקצה של קצה פלסטיק עם סכין גילוח. צייר ב 5 μL של נוזל, ואז הרים את GV ב 5 μL הנותרים.
   3. מעבירים את תכולת הגרעין עדיין בג'ל למרכז שקופית גם מילא בעבר עם הפצת פתרון. הפתרון מתפשט חייב להיות משטח קמור כך בועה אינה לכוד כאשר coverslip מתווסף.
   4. הוספת coverslip (18 מ"מ) במקום להחליק בתא לח. הג'ל הגרעיני יהיה לפזר לאט במהלך 10 הבאות - דקות 60, כך כרומוזוםים האברונים גרעיניים לבוא לשכב על פני השטח של שקופיות הזכוכית.
      הערה: Gvs של סלמנדרות א mexicanum ונ viridescens לא "להקשיח" יתר על המידה בטווח הבינוני בידוד. לכן אפשר להמשיך יותר נינוח עם הסרת מעטפת הגרעין מ פחית אחת עם Xenopus.
2. הסר את מעטפת הגרעין מתוך GV סלמנדרה כמפורט בסעיף 5.1.1, אבל לעשות זאת בטווח הבינוני בידוד.
   1. תרים את תוכן GV בג'ל מעט עם טפטפתי להעביר בצלחת פטרי המכילה פתרון מתפשט.
   2. במהירות לשטוף את קצה פיפטה בפתרון המתפשט, להרים את הג'ל הגרעיני, ולמקם אותו במרכז שקופית גם מלא בעבר עם הפצת פתרון. הוסף coverslip 18 מ"מ ומניחים את השקופית כולה בתא לח. השרף הגרעיני יהיה לפזר לאט מעל בא 10 - דקות 60 הכרומוזומים אברונים גרעיניים יגיעו לשכב על משטח הזכוכית.

   6. תצפית ראשונית של LBCs האברונים

   1. ראיית LBCs האברונים גרעיניים על ידי בניגוד שלב (מיקרוסקופ הזקוף הקונבנציונלי) בהגדלה נמוכה לאחר פיזורו של תוכן הגרעין בתא מתפשט. מכיוון החדר הוא כ 1 מ"מ עמוק ואת תוך הגרעיניים נמצאים בתחתית, להשתמש מטרה בהגדלה נמוכה עם מרחק עבודה ארוך (5X - 10X).
      הערה: הסיבה העיקרית לבחינת ההכנה בשלב זה לקבוע אם זה שווה נושאת דרך בשלבים הבאים. בשנת הכנת טובת הכרומוזומים הם רצופים התיישבו אל החלק התחתון של החדר. המשך לשלב צנטריפוגה תוך שעה של עשיית ההכנה, כמו זו תבטיח מצורפת אופטימלית של לולאות כרומוזום lampbrush לשקופית.

   7. צנטריפוגה של התוכן הגרעיני

   1. מניחים פיסת נייר פילטר על coverslip ומהדקיםכדי להסיר את נוזל עודף מהאולם.
   2. שים על 1 מ"מ ³ של וזלין על כל צד של coverslip. ממס את וזלין עם מוט מתכת מחומם על 70 - 80 ^מעלות צלסיוס לאטום את coverslip ריבוע הפלסטיק הבסיסי.
   3. מקום שקופית נושאי השקופיות עבור צנטריפוגה, ולוודא כי ספקים מול מאוזנים. צנטריפוגה השקופית בסביבות 4,800 XG במשך 30 דקות - 1 שעה. ב 4 ^o C. השתמש בתכונת ההתחלה האיטית על צנטריפוגות.

   8. תיקון התוכן הגרעיני

   1. עבור רוב ההליכים שלאחר מכן, לתקן את תוכן הגרעין עם paraformaldehyde.
   2. שם מתל שקופיות לתוך צלחת מכתים שקופיות מיקרוסקופ רגילה ולאחר מכן למקם את השקופיות בנפרד במעמד. הוסף מספיק מקבע כדי לכסות את השקופיות (2 - 4% paraformaldehyde ב OR2 או PBS).
   3. עם זוג מלקחיים בוטים, לדחוף את coverslip רוחבית, להרים אותו, וזורקים אותו לפח הזכוכית המתאים.השאר שקופיות מקבעים לפחות 15 - 30 דקות. עבור כלאה באתר ורוב כתמי נוגדן, תקופות ארוכות יותר של קיבעון (h או ד) מותרות.
   4. כדי להסיר את ריבוע הפלסטיק, במקום מחליק את אחד בכל פעם לתוך קרח הקר OR2 או PBS בצלחת מכתימה. הכנס סכין גילוח חד בקצה כיכר הפלסטיק לשחרר אותו.
      הערה: באופן אידיאלי הפלסטיק ירד בצורה נקיה, מה שמשאיר את כל שעוות פרפין בשקופית. השעווה משרתת מטרה מועילה: מאז הוא מקיף באזור המרכזי הקטן שבו התוכן הגרעיני מחובר לשקופית, הוא מתנהג כמו סכר אשר מאפשר לעבוד עם כמויות קטנות (5 - 10 μL) של ריאגנטים עבור immunostaining, וכו. שקופיות ניתן שנערך ללא הגבלת זמן בקור OR2 או PBS.

   9. Immunostaining של LBCs גרעינית אברונים

   1. סר כנה GV קבוע מאחסון OR2 או PBS. תמחק את נוזלי במקום עודפים על תומך בתא לח. Chamb נוחאה הוא צלחת פטרי 90 x 15 מ"מ המכיל מעגל 90 מ"מ של נייר סינון לח.
      הערה: בשלב זה את התוכן הגרעיני מחוברת היטב לשקופית באזור 5 מ"מ עגול ללא שעוות פרפין. בגלל השעווה הוא דוחה מים, אפשר לשנות את הפתרונות על ידי הוספה והסרה של כמויות קטנות של נוזלים אל קצה באזור המרכז עם טפטפת 20 μL. הזהירות העיקרית היא כדי להימנע ממגע באזור השעווה חינם עם קצה פיפטה.
   2. ביצוע immunostaining עם כמויות קטנות (10 - 20 μL) של חומרים כימיים. בגלל הכרומוזומים אברונים גרעיניים הם קטנים מאוד הנמצא במגע ישיר עם ריאגנטים הוסיף, פרוטוקולים מכתימים יכולים להיות קצרים. פעמים מכתימות נוגדן יסודית ובחטיבות ביניים יכולות להיות קצרות ככל 1 hr או פחות. אין לכלול חומר ניקוי בכל צעד, כמו זו גורמת נזק ההכנה. אם תרצה, להכתים את ההכנה עם DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 10 - 20 דקות כדי להדגיש את הצירים של LBCs.
   3. הר גליצרול או הר מסחריing בינוני מתאים immunofluorescence. כדי למנוע השמנת בועת אוויר במהלך שלב ההרכבה, פעל כמפורט להלן.
      1. משוך 15 μL של הרכבה בינונית לתוך קצה פיפטה 20 μL. להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מאזור מיד סביב התפשטות גרעינית על ידי "הפתילה" אותו עם פיסת נייר סינון (חתך בצורת משולש דק מאוד ממעגל 90 מ"מ של 1 # נייר הסינון).
      2. פיפטה ביותר של המדיום גובר על ההכנה, נזהרת שלא לגעת באזור של התפשטות הגרעין. מניח את 1 μL האחרון בערך של הרכבה בינונית במרכז של coverslip 22 מ"מ (עובי 1.5 #). הפוך את coverslip על ההכנה ושחרר בזהירות למקומו.
      3. לקבלת תושבות זמנית, עד כמה ימים, להשתמש 1 מ"ג / מ"ל ​​phenylenediamine גליצרול 50%. לקבלת תושבות קבעו, במיוחד ללימודי superresolution, להשתמש במדיום נמוך קרינה זה מקשה על מקדם שבירה של כ 1.46.

   10. פלורסנט הכלאה באתרו (FISH) של LBCs גרעינית אברונים

   1. בגלל פרוטוקולי FISH דורשים בדרך כלל צעד בטמפרטורה גבוהה, להסיר את פרפין מן ההכנה. בזהירות לגרד עם סכין גילוח, למרות ההליך הוא מייגע עלולה להביא לנזק תאונתי של התכשיר. כדאי וסמנו את השטח של התכשיר על הגב של השקופית עם נקודת יהלומים.
      1. לחלופין, לפזר את שעוות פרפין עם קסילן. הגדרת סדרה של צנצנות Coplin או מנות מכתים המכילות: 30%, 50%, 70%, 95% ו -100% אתנול; 3 מכולות של קסילן; 2 יותר מכולות של אתנול 100% ואצטון אחד.
      2. מניח שקופיות במנשא השקופית מייבש אותם בסדרת אתנול, עוזב מגלשות 3 - 5 דקות בכל ריכוז (זמנים קצרים יותר אם נסער).
      3. ממיסים את פרפין על ידי העברת שקופיות דרך 3 מכולות של קסילן, כ -5 דקות כל אחד אם נסער. הסר אתקסילן על ידי עובר דרך שני ethanols 100%, ולבסוף להסיר את אתנול עם אצטון. קח את השקופיות אצטון להטות להם להתייבש.
   2. לבצע הכלאה באתרו באמצעות כל פרוטוקול סטנדרטי. ^15,16

   בידוד 11. של GV תחת שמן

   1. תרים ביצית מפתרון OR2 עם המלקחיים של צורף, כולל רקמה שמסביב כמה שפחות. מניחים את הביצית על חתיכה קטנה של נייר סינון # 1. עודף פתרון OR2 יעביר את נייר הסינון, עוזב את הביצית כמעט ללא נוזל. תרימי את הביצית "יבש" ולמקם אותו מתחת לפני השטח של שמן מינרלי קל משקל (שמן פרפין) בצלחת פטרי קטנה (35 x 10 מ"מ).
      1. עם מחט טונגסטן בסדר או שן אחת המלקחיים, לתקוע חור קטן הביצית ליד קוטב החיה הכהה. תרים את הביצית עם זוג אחד של מלקחיים (הימנעות הטיפים) וסוחט בעדינות. GV יהיה extrude יחד עם קטן או lסכום arger של חלמון על פני השטח שלו (איור 3).
      2. סר כמו חלמון ככל האפשר על ידי גורף בעדינות GV עם הצד של המלקחיים. ברוב המקרים זה יהיה קשה להסיר את כל החלמון. עם זאת, לרוב מטרות כמות קטנה של חלמון היא לא בעיה.
   2. כדי לבחון את תוכנו GV, לשטח את GV במידה כזו או אחרת.
      1. הסר ריבוע הפלסטיק של שקופית היטב ולהשתמש שעוות פרפין הנותרים ככלי קיבול רדוד עבור שמן פרפין. ¹⁰ הרם את GV יחד עם שמן פרפין ב פיפטה 20 μL ולהעביר למרכז באזור פרפין. הוספת coverslip ולבחון את התוכן של GV בברוטליות חלקית. טכניקה זו אינו גורם נזק LBCs.
   3. לחלופין, לשטח את GV לכ -10 מיקרומטר עובי להסתכלות של אברונים גרעיניים.
      1. חותכים את 1 מ"מ הסופי של קצה פיפטה פלסטיק עם סכין גילוח חד. למצוץ את GV לתוךלהטות לצד בדיוק 5 μL של שמן מינרלי. Extrude את GV וכל שמן על גבי במרכז coverslip זכוכית 22 מ"מ.
      2. מנמיכים זכוכית שקופית 3 "x 1" תקן לאט עד שהוא נוגע רק טיפת שמן. הירידה ו coverslip יוסר על ידי קפילריות והשמן יתפשט אל הקצוות של coverslip. כאשר הירידה התפשטה לחלוטין, השמן יהיה כ 10 מיקרומטר עבים. LBCs יינזק ו nucleoli הגדול יידחס מעט, אבל רוב האברונים הגרעיניים הקטנים יופיעו פחות או יותר כפי שהם מתקיימים הטובה והשלמה GV (איור 3).

תוצאות

כדי לבחון הכרומוזומים lampbrush ענק אחד מתחיל על ידי בידוד ביציות מתוך צפרדע או סלמנדרה. איור 1 מציג קבוצה של ביציות בוגרות בתמיסה בופר לאחר הסרה מההשחלה של הצפרדע, Xenopus. ביציות כזה להישאר במצב טוב במשך ימים בטמפרטורת החדר. הגרעין (או השלפוח?...

Discussion

התצפית הראשונה של LBCs "החיים" מתוך Gvs מבודדים יד של צפרדעים וסלמנדרות נעשו לפני כמעט 80 שנה על ידי הביולוג האמריקני ויליאם Duryee, ¹⁹ לפני כניסתה של בניגוד שלב מיקרוסקופיה DIC, לפני immunostaining פלורסנט, ולפני FISH. היתרונות של LBCs לחקירת פרטים של מבנה הכרומוזום שעתוק על הפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline)	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich	A5040-100G	Sometimes referred to as MS-222
Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures	VWR	95057-000
Paraplast (paraffin wax)	Sigma-Aldrich	P3558-1KG
p-Phenylenediamine	Sigma-Aldrich	P6001
Gelatin	Grocery Store		Commercial Knox gelatin works fine
ProLong Gold antifade mountant	ThermoFisher Scientific	P10144
Gold Seal cover glass  22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick)	Electron Microscopy Sciences	63786-01	These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy
Dumont forceps #5	Electron Microscopy Sciences	72700-D	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx
Paraffin oil (light)	EMD Chemicals	PX0047-1	For isolating GVs in oil
Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL)	BioRad	Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201	http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers
Silicone isolators	Grace-Biolabs	select from catalog link	http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html
Coplin jars and staining dishes	Electron Microscopy Sciences	select from catalog link	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx