משטר phenotyping עבור עכברים מהונדסים גנטית בשימוש ללמוד גנים מעורבים מחלות אנושיות של הזדקנות

Summary

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

Abstract

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

Introduction

גיל הקשורים במחלות הופכות נפוצות יותר ויותר בחברה מודרנית. ככל שמדע הרפואה משפר שתוחלת החיים, האוכלוסייה ממשיכה גיל והנטל של מחלות אלה גדל. טיפולים יעילים נחוצים כדי להפחית את ההשפעה של תנאים מתישים אבל להישאר חמקמקים במקרים רבים. רק על ידי הבנת הגורמים ופתולוגיה של מחלות הקשורות להזדקנות מדענים יכולים להתחיל לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאל ולפתח אסטרטגיות להתערבות. מצבים שכיחים כתוצאה מהזדקנות כוללים הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון (PD) וניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD). PD הוא הפרעת תנועה הנפוצה ביותר הנגרמת על ידי ניוון מוחיה בבני אדם. רוב חולי פרקינסון להראות תסמינים כגון נח רעד, bradykinesia ונוקשות אחרי 50 שנים של גיל. התחלה מוקדמת גם נצפתה כ -10% מהמקרים.

AMD הוא הגורם המוביל לעיוורוןקולטני האור קשישים, נזק בהדרגה אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) בעיניים. הראייה המרכזית נפגעת אבל חזון הפריפריה היא בדרך כלל לא מעושה. ישנן שתי צורות של AMD. בטופס "יבש", פיקדונות חלבון תאי המכונה טופס דרוזן בין הרשתית ואת הממברנה של ברוך (BM), מה שמוביל אטרופיה גיאוגרפית וטשטוש ראייה מרכזית. החמור יותר "רטוב" תוצאות טופס מ נאווסקולריזציה מן דמית פני BM לתוך שכבות הרשתית ואת קולטי האור ויכול להוביל hamorrhaging מתחת הרשתית הגורמת נזק בלתי הפיך רקמת הרשתית. הגנום במחקרי קשר רחב זיהו בעבר לוקוסים המשויכים רגישות מוגברת למחלות הזה, והתייחס לשני אזורים של עניין: H גורם המשלים (CFH) על כרומוזום 1 ואת מוקד 10q26, שבו הרגישות Maculopathy הקשורות לגיל 2 (ARMS2) ו A1 גורם הדרישה בטמפרטורה גבוהה (HtrA1) הגנים ממוקמים ^1-5 . שילובים של אללים אלה מעלים את סבירות AMD באופן מינון תלוי SNPs הספציפי ניתן לשייך מעדיף עם או הצורות הרטובות או יבשות של AMD ^3-6.

CFH פועלת כרגולטור שלילי של הנתיב החלופי (AP) של המערכה המשלים על ידי עיכוב ההפעלה של C3. פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNP) נקשר לסיכון מוגבר AMD, גרימת חילופי טירוזין 402 אקסון 9 עם היסטידין עקב T ל- C החלפה ^1. ב AMD הוא האמין כי AP הוא misregulated בגלל אובדן התפקוד של CFH אבל אם SNP ממלא תפקיד סיבתי ברור. אחת ההשערות היא כי היסטידין בעלי מטען חשמלי חיובי הוא חשב לשלול את היכולת של CFH להיקשר אינטראקציה חלבונים C-reactive ^1,7 חלבון הפרין סולפט. במחקרים במבחנה של CFH Y402H לספק תוצאות סותרות על ההבדלים הפונקציונליים בין גרסאות, וב vivo עבודה CFH ^{- / -} בעכברים המבטאים CFH אנושי הוא ⁸ מתמשך. ARMS2 ממוקם במעלה הזרם של HtrA1 בגנום הפרימטים, למרות הגן התאור בעכברים. HtrA1 הוא פרוטאז סרין אבל ARMS2 מאופיין גרוע. לחוסר-היציבות ההצמדה בין SNPs שעבר על המקורות הקשורים AMD עשו את זה קשה לקבוע את התרומה לסיכון של מוטציות בודדות של הגנים באזור זה, אולם מחקר חדש הציע שזה ביטוי יתר של HtrA1 ולא ARMS2 שמוביל נאווסקולריזציה ו פיקדונות חלבון subretinal ^9-11. עם זאת, קרבתה של גני מוקד זה עשויה לאפשר אינטראקציות כי לא ניתן ללמוד באמצעות transgenes מוכנס באופן אקראי.

בנוסף AMD, משפחת HtrA של סרין פרוטאז נקשרה עם מחלות אנושיות רבות. כל חלבוני HtrA להכיל דומיין פרוטאז סרין ואחריו לפחות תחום אחד PDZ C- מסוף. HtrA1, HtrA3 ו HtrA4 חולקים את גרהומולוגיה eatest, המורכב פפטיד האות, גורם גדילה דמוי אינסולין תחום מחייב, תחום מעכב פרוטאז Kazal, התחום פרוטאז סרין ואת תחום PDZ. יש HtrA2 חנקן הסופית- שונה, מורכב תחום רצף לוקליזציה המיטוכונדריה, הטרנסממברני מעכב של תחום מחייב אפופטוזיס ואחריו תחומי פרוטאז ו PDZ ^12-16. HtrA1 היונק מוסדר על ידי שיפוץ הנגרמת מצע האתר הפעיל של תחום פרוטאז שלה ^17-20, ו HtrA2 יכול גם להיות מווסת על ידי אינטראקציה בין פרוטאז סרין ותחומי PDZ מדכא פעילות הפרוטאז ^21. מעניין לציין, כי תחום PDZ אינו מופיע להעניק רגולציה דומה HtrA3 ^16. פרוטאזות HtrA ניתן לווסת גם על ידי גורמים חיצוניים: זה הודגם לאחרונה כי קיימת אינטראקציה בין הרגולציה HtrA1 ו protoporphyrins ²² ו HtrA2 יכול להיות מוסדר על ידי זרחון באקטיבציה של קינאז MAP p38מסלול באופן PINK1 תלוי ^23. המחיקות של חברים בודדים של משפחת HtrA בעכברים תועד, אולם תופעות מכניסטית בעיקר אינם ברורים בין היתר בשל חוסר פנוטיפים גלוי.

HtrA1 ממלא תפקיד חשוב בבקרת איכות חלבון ויסות לא תקין או מוטציה שלו נמצא קשור למחלות רבות אנושיים שונים כולל דלקת פרקים, סרטן וסיכון מוגבר של AMD ^3,4,24-32. אובדן תפקוד HtrA2 ברקמות עצביות נקשר עם פנוטיפים PD בבני אדם ועכברים, בעוד ההפסד שלה מתוצאות רקמות שאינן עצביות ההזדקנות מואצת ^33-37. Dysregulation HtrA3 נקשרה עם מחלות כולל רעלת הריון וסוגים מסוימים של סרטן ^38,39. Up-רגולציה של HtrA4 נצפתה השליות של חולי רעלת הריון אבל עכברי בנוקאאוט אינו מציגה פנוטיפ גלוי ^40,41. חוסר פנוטיפים שנצפה כמה עכברים בנוקאאוט כברהניחו להיות תוצאה של פיצוי בין בן משפחה HtrA: הוא חשב כי הן HtrA4 ו HtrA1 אינטראקציה עם משפחת TGF-B של חלבונים, המאפשר פיצוי ידי HtrA1 על מחיקת HtrA4 ^41. בדומה לכך, הוא חשב כי מאז HtrA1 ו HtrA3 יש רמה גבוהה של homologies תחום שיצטרכו פונקציות משלימות ^42. עם זאת, הוצע כי חלבוני HtrA ייתכן תפקידים אנטגוניסטית חלקית, מתחרים להסדיר מטרות משותפות ^43.

כדי להמשיך לחקור סיכון אלו שלושה גורמי קווי עכבר נוק-ב מואנשים נוצרו. בשנת CFH ^{TM1 (CFH * 9) jhoh} ו CFH ^{TM2 (CFH * 9) jhoh,} אקסון 9 של הגן CFH מוחלף אקסון 9 של homologue האדם. CFH ^{TM1 (CFH * 9) jhoh} המקודד את טירוזין הקשורים שאינם המחלה שאריות במיקום 402, ואילו CFH ^{TM2 (CFH * 9) jhoh} נושא את Y402H, SNP הקשורים בסיכון. בARMS2 ^tm1jhoh רצף ARMS2 אדם היה ממוקד לאזור במעלה הזרם של HtrA1. רצף STOP-ולצדו loxP להציב במעלה זרם של רצף הגן אבל במורד הזרם של אמרגן UbiC הכלול היה נכרת על ידי חצייה לעכברי OzCre, מבטאי Cre recombinase תחת השליטה של אמרגן Rosa26, כפי שתוארו לעיל ^34. נוסף על אלה עקום בתורים, אללים בנוקאאוט מותנה עבור CFH ו HtrA1 (CFH ^tm1jhoh ו ^tm1jhoh HtrA1), כמו גם את בני המשפחה HtrA ידועים אחרים נוצרו: HtrA2 (HtrA2 ^tm1jhoh), HtrA3 ^(tm1jhoh HtrA3) ו HtrA4 ( HtrA4 ^tm1jhoh). Knockouts ניבט אונליין נוצר על ידי חציית עכברי OzCre לבעלי החיים המהונדסים כדי לאגף אקסונים ספציפית עם אתרי loxP, כך מחיקה גורמת לשינוי מסגרת ו / או מחיקה של התחום הפעיל (CFH; אקסון 3, HtrA1; אקסונים 2-3, HtrA2: אקסונים 2-4, HtrA3; אקסון 3, HtrA4; אקסונים 4-6) ^34,41. מחיקה עצבית של HtrA2, שנמחקה באמצעות Cre recombinase תחת השליטה של אמרגן Nestin (HtrA2 ^flox; Tg (נוס-cre) 1Kln / J), אף תואר ^34. עכברים רק חסרי HtrA2, או מערכתי או ברקמות עצביות, מוצגים פנוטיפים ברורים, עם הצגת פנוטיפים פרקינסון.

מכיוון שחלק מהגנים הללו אינטרסים הניחו להיות מקומי כדי המיטוכונדריה ^11,44-47, ומחיקה של HtrA2 שנוצר פנוטיפים פרקינסון, משטר phenotyping עם דגש המיטוכונדריה ונוירולוגיות מתואר כאן לתוצאות נציג בדיקות עניין מסופקים . על מנת לבחון עכברים מהונדסים גנטי מיוצרים לחקור אדם, מחלות הקשורות לגיל ביסודיות ואת לוח זמני phenotyping ראשוני שיטתי הוקם, מורכב מסדרה של בדיקות קשורות השני הראשימחלות של עניין: AMD ופרקינסון.

Protocol

אתיקה הצהרה: מחקרים שכללו חיות נערכו בהתאם המכונים הלאומיים המלצות הבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת ייל.

בדיקות התנהגותיות 1. של עכברים מהונדסים גנטית

הערה: כל העכברים צריכים להיות כפופים לאותה משטר הבדיקות להגביל הבדלי התרגלות טיפול. בדיקות יש לבצע בו זמנית של יום בכל פעם.

1. Neonatal הינד לימב מבחן
   הערה: מבחן הגפיים האחורי מתנהל יומי מיום הלידה (P) 4 עד P10 להעריך את כוח שרירי גפיים האחוריים הפרוקסימלי, חולשה ועייפות.
   1. עכברי תחבורה לאזור בדיקות ולאפשר לנוח למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
   2. הכן מנגנון בדיקה על ידי ניקוי צינור חרוטי 50 מ"ל עם 70% אתנול, דוחפת שני (P4-P8) או אחד (P10-P9) כדורי צמר גפן לתחתית של tUbe ואבטחת במצב אנכי.
   3. הסר גור אחד מן המשקל כלוב ולהקליט. שמור גור להחזיק מגש על משטח חום בכל פעם לא בודק.
   4. בעדינות להשעות את הגפיים האחוריים של הילוד מעל השולי של צינור החרוטים, כך הוא פונה כלפי מטה לעבר כדורי צמר גפן. ספירת ניסיונות למשוך עשה חביון מידה ליפול באמצעות סטופר.
   5. חזור פעם נוספת עליו מדבקה את הגור בטוש. לאחר מכן, לזהות גורים P6 ידי גזיר הבוהן. לשפשף בעדינות את גורים עם מצעים מכלוב הביתה לפני ההחלפה.
   6. נגב צינור חרוטים עם 70% אתנול.
   7. חזור על בדיקות על הגור הבא עד ההמלטה כולו נבדקה.
   8. השלך כדור צמר גפן צינור חרוטים. ציוד כל נקי עם אתנול 70%.
2. יַנוּקָא תצפית מבחן
   הערה: מבחן תצפית יַנוּקָא מנוהל מדי יום בין P19 ל P21 להבקיע רמות תנועה ופעילות כללית.
   1. עכברי תחבורה לאזור בדיקותnd מניח לנוח למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
   2. כן תיבת בדיקות פרספקס המסומנות רשת 6x6 של 2 ריבועי אינץ על הבסיס ידי ניקוי עם אתנול 70%. הגדרת ציוד וידאו לצד כאלה שהתיבה כולו בתחום הצפייה. שמור את להגדיר הסביבה אותו כל יום כדי למנוע החדרת חידוש.
   3. הסר יַנוּקָא אחד מהכלוב ומכניס כוס החזקה נקיה. משקל שיא.
   4. בגין הקלטת וידאו על ידי לצלם את תעודת זהות הבדיקה, עם מספר זיהוי עכבר, גיל ותאריך הבדיקה. עבר עכבר מהחזקת כוס לכיכר במרכז. זמן במשך שלוש דקות, סופר את מספר השורות נחצות על ידי שני כפותיה הקדמיות של העכבר במהלך הבדיקה.
   5. חזור עכבר כדי הקלטת וידאו כלוב קצה נקיה.
   6. נקה את מנגנון הבדיקה עם אתנול 70%.
   7. חזור על הפעולה עד כל המלטה נבחנת, ואז להחזיר את כל הגורים לכלוב בבית.
   8. הציוד יש לנקות את כל הבדיקות עם אתנול 70%.
   9. שימוש בסרטונים, לכמת את מספר גידול אירועים על ידי ספירה לאחר תצפית ויזואלית, שם עכבר עומד בשתי רגליו הקדמיות הברורות של תמיכה, טיפוח אירועים, בם שני רגליו הקדמיות עוסקות בניקוי.
3. בדיקה של עוצמת גריפ קווים
   הערה: מבחן כוח האחיזה מתנהל לסירוגין בין P22 ו- P26, להעריך כוח התוקפת.
   1. עכברי תחבורה לאזור בדיקות ולאפשר לנוח בכלוב בבית למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
   2. כן מנגנון על ידי ניקוי רשת קופסא רשת פרספקס עם 70% אתנול. מניח באריזת בועות בתחתית התיבה ומכסים בנייר.
   3. עכברים נפרדים לקבוצות של שלוש, צבת בכוסות החזקת פרט.
   4. יש לשים את הסמן ראשון במרכז של רשת התיל ולאט לאט להפוך 10-20 סנטימטר מעל המשטח הרך בחלקו התחתון של תיבת פרספקס. מדוד את חביון ליפול באמצעות סטופר. סיימתי בדיקה לאחר 60 שניות חלפו אם העכבר לאנפילה, ליפול.
   5. חזור עכבר כדי כוס מחזיקה, לנגב רשת עם אתנול 70% ולהחליף נייר על נייר הבועות. לבצע את הבדיקה על שני עכברים הנותרים בקבוצה לפני החזרה הראשונה. חזור על הפעולה עד כל עכבר נבדק בסך הכל שלוש פעמים.
   6. מחזיר את הקבוצה לכלוב נקי ולהמשיך עם שאר קבוצות. אם יש פחות משלושה עכברים בכל קבוצה, להבטיח כי מרווח התאוששות 5 דקות בין משפט מותר.
   7. להחזיר את כל העכברים לכלוב בבית, להשליך נייר וציוד בדיקה נקי עם אתנול 70%.

בחינת 2. מבנה רשתית

1. לטשטש בעלי חיים שנמצאים P30-35 בזריקה intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). הערכת עומק ההרדמה על ידי צובט את שודד הדרכים והמשך רק בהעדר תגובה, עולים בקנה אחד עם הנחיות IACUC. Perfuse עם 4% PFA / PBS ^48.
2. כדי להסיר את העיניים, לנקות את העור סי החתךte עם 70% אתנול, לפני שהם חותכים דרך העור בבסיס הגולגולת. לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת ונקיה עם 70% אתנול. שימוש בכלים לנקות, לחתוך בזהירות דרך הגולגולת להגיע ארובות עיניים ולחשוף את העיניים. לנתק את עצב הראייה, מסיר את העין בעדינות מהשקע ולשטוף ב PBS.
3. תקן שעיניו 4% PFA / PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הניח עיניים בצלחת פטרי קטנה המכילה PBS. לעשות חתך קטן במרכז הקרני באמצעות מספרי הסרת תפר. הסר את הקרנית על ידי חיתוך הקצה בין הקרנית בלובן העין. שימוש במלקחיים כדי להסיר את איריס. לבסוף, לקלף את שכבות הרשתית, עוזב את שלמי רשתית העדשה במקום.
   הערה: קיבוע 4% PFA / PBS יגרום ניתוק רשתית המאפשר הרשתית עליו לקלף בקלות מהחלק החיצוני של הרשתית.
5. Re-fix ב 4% PFA / 30% סוכרוז / PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני החזרת עין אל צלחת פטרי המכילה PBS. משוך את lens באמצעות מלקחיים, להביא את הגוף הזגוגי יחד עם זה.
6. Cryoprotect ב סוכרוז 30% בין לילה ב 4 ° C..
7. עיניים מעיילות במתחם טמפרטורת חיתוך אופטימום (OCT) והעברת עובש הטבעה המכיל אוקטובר הטרי. אוריינט העין כך במישור sagittal מקביל עם הפנים חיתוך, באמצעות תנועות מעטות ככל האפשר והימנעות כניסתה של בועות אוויר. פלאש להקפיא ידי טבילת העובש באמבט קרח / אתנול יבש. בלוקי חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
8. באמצעות cryostat, לחתוך 20 מיקרומטר חלקים sagittal ולאסוף בשקופיות precleaned.
9. הכתם בסעיפים עם hematoxylin ו eosin פי פרוטוקולים סטנדרטיים ^49. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד מיקרוסקופ שדה בהיר.

3. histochemical מכתים

1. לדוגמא הכנה
   1. להרדים בעלי חיים שנמצאים P30-35 באמצעות מנת יתר isoflurane (30% ב פרופילן גליקול) באמצעות שאיפת טיפה פתוחה. להעריך המתת חסד על ידי ההפסקהשל נשימה, דופק חוסר בתגובה צובט את שודד הדרכים. אשר למוות על ידי נקע בצוואר הרחם כריתת איברים, עולה בקנה אחד עם הנחיות IACUC.
   2. כדי להסיר את המוח, לנקות את העור במקום החתך עם 70% אתנול, לפני שהם חותכים דרך העור בבסיס הגולגולת. לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת ונקיה עם 70% אתנול. שימוש בכלים לנקות, לחתוך בזהירות דרך הגולגולת ולהסיר כדי לחשוף את המוח. הסר את הקרומים, בעדינות להסיר את המוח מחלל הגולגולת. יש לשטוף ב- PBS.
   3. מעיל המוח ב אוקטובר ולהעביר עובש הטבעה המכיל אוקטובר טריים. אוריינט המוח כך במישור sagittal מקביל עם הפנים חיתוך, באמצעות תנועות מעטות ככל האפשר והימנעות כניסתה של בועות אוויר. פלאש להקפיא ידי טבילת העובש באמבט ולאחסן יבש קרח / אתנול ב -80 מעלות צלזיוס.
   4. באמצעות cryostat, לקצץ 10 מיקרומטר חלקים sagittal ולאסוף בשקופיות precleaned.
2. NADH Diaphorase מכתים
   1. הכן 0.05 חיץ M טריס, pH 7.6 ידי המסת 5.72 גרם טריס-HCl ובסיס 1.66 גרם טריס במים 1L-יונים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה שבועות.
   2. כן פתרון NADH (2.25 NADH מ"מ 0.05 חיץ M טריס). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
   3. הכן פתרון NBT (2.5 מ"מ ניטרו-כחול tetrazolium 0.05 חיץ M טריס). חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה שבועות בבקבוק זכוכית.
   4. מערבבים כמויות שוות של הפתרון NADH פתרון NBT לעשות פתרון מכתים ולהוסיף 1 מ"ל לכל שקופית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified למשך 30 דקות.
   5. פתרון מכתים לשאוב ולשטוף שלוש פעמים עם DH ₂ O.
   6. לשטוף שלוש פעמים כל אחד עולה וריכוזי יורד של אצטון / DH ₂ 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. לשטוף שלוש פעמים ב DH ₂ O ו הר קטעים עם בתווך מימי. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצוידת f הבהירמיקרוסקופיה ield. מכתים הכחולים מתאים הפעילות האנזימטית.
3. Succinate dehydrogenase histochemical מכתים
   1. הכן 0.2 M פוספט monobasic נתרן / DH ₂ O ו 0.2 M פוספט dibasic נתרן / DH ₂ O.
   2. הפוך 0.2 M חיץ פוספט, pH 7.6 ידי שילוב 3 חלקים פוספט monobasic עם 20 פוספט dibasic חלקים נתרן.
   3. הכן פתרון מכתים (0.1 M succinate נתרן, 1.25 M NBT ב 0.2 M חיץ פוספט) ולהוסיף 1 מ"ל לכל שקופית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified למשך 60 דקות.
   4. פתרון מכתים לשאוב ולשטוף שלוש פעמים ב DH ₂ O.
   5. לשטוף שלוש פעמים כל אחד עולים ויורדים ריכוזים של אצטון / DH ₂ O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. לשטוף שלוש פעמים ב DH ₂ O ו הר קטעים עם בתווך מימי. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד מיקרוסקופ שדה בהיר. מכתים הכחולים מתאים enפעילות zymatic.

תוצאות

סעיף זה מתאר דוגמאות של תוצאות השגה באמצעות שיטות אלה. במבחן-הגפיים האחוריות, מספר ניסיונות למשוך עשה ואת חביון ליפול מסוכמים על שתי בדיקות רצופות עבור כל יום. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להשוות קבוצות שונות גנטית להבחין עכברים עם כוח התוקפת מופחת ^t...

Discussion

טיפולים חזקים נדרשים להגביל את שפעת תנאים מתישים הקשורות להזדקנות אדם, אבל הם נשארים חמקמקים עבור מחלות אלו. כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאל ולפתח אסטרטגיות להתערבות, הגורמים ופתולוגיה של מחלות הקשורות להזדקנות יש להבין תחילה. לא כל העכברים המהונדסים גנטי מייד נו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Decon (Fisher Scientific)	435541
50 ml conical tube	Fisher Scientific	1443222
cotton balls	Walmart
heat mat	Sunbeam	0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray)	Walmart
Electronic stopwatch	GOGO	PC396
Plexiglass box	constructed in workshop		12" by 12"
Vixia HF R400 Camcorder	Canon	8155B004
9 oz Clear Cups	Walmart
1/4 inch wire mesh	Home Depot	204331884 (online) / 554219 (in store)	12" by 12"
Bubble wrap	VWR	470092-416
Straight specimen forceps	VWR	82027-438
Fine-tip dissecting forceps	VWR	82027-408
Fine scissors	VWR	82027-578
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4	American Bioanalytical	AB11072-04000
Sucrose	JT Baker	4072-01
superfrost slides	Fisher Scientific	12-550-15
Hematoxylin Stain Solution	Fisher Scientific (Ricca)	353016
Eosin Y Stain Solution	Fisher Scientific (Ricca)	2845-32
Tris hydrochloride	Sigma	T3253
Tris	American Bioanalytical	AB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate	Sigma	N8129
Nitrotetrazolium Blue chloride	Sigma	N6876
Acetone	JT Baker	9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma	S9390
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Sigma	S2378
VectaMount aqueous mounting medium	Vector Labs	H-5501-60
Cover glass	Fisher Scientific	12-545-M	60 mm x 24 mm
AxioImager A1 microscope	Zeiss
Video camera tripod	Amazon
Optimal Cutting Temperature (OCT)	Fischer Scientific	23730571
Cryostat Sectioning  Machine	Leica	CM1900	Discontinued but since replaced by CM1950