ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

Ashton D. Lesiak; Rabi A. Musah

doi:10.3791/54197

Summary

שיטה לזיהוי מינים של חומר בוטני על ידי ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוציה זמן-גבוה אמיתי ניתוח סטטיסטי רב משתני מוצג.

Abstract

אנו מראים כי ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה האמיתית יכול לשמש לייצור פרופילי ספקטרלי מסה של חומר בוטני, וכי טביעות אצבעות הכימיות אלה יכולים לשמש לזיהוי מיני צמחים. הנתונים ספקטרלי ההמוניים ניתן לרכוש במהירות ובאופן קצב העברת נתונים גבוה ללא צורך חילוץ מדגם, derivatization או התאמת pH צעדים. השימוש בטכניקה זו עוקף אתגרים שהוצגו על ידי טכניקות קונבנציונליות יותר לרבות זמני ניתוח כרומטוגרפיה ממושך ושיטות עתירות משאבים. יכולות העברת הנתונים הגבוהות של הניתוח הישיר בזמן אמת-גבוה פרוטוקול ספקטרומטריית מסת רזולוציה, בשילוב עם עיבוד ניתוח סטטיסטי רב משתנה של הנתונים, לספק לא אפיון בכיתה רק של צמחים, אלא גם להניב מינים ומידע זניים. כאן, הטכניקה מודגמת עם שני מוצרי צמחים פסיכואקטיביים, speciosa Mitragyna (Kratom) ו ב"דאטורה(Jimsonweed), אשר היו נתוני ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה האמיתית ואחריו עיבוד וניתוח סטטיסטי של הנתונים ספקטרליים ההמוניים. היישום של הכלים הללו בד בבד לאפשר החומרים צמחו להיות מזוהים במהירות ברמת מגוון מינים.

Introduction

במשך אלף שנים, מוצרים טבעיים פסיכואקטיביים שמשו בטקסים שמאני, התעללו עבור תכונות נפש שינוי שלהם, ויאכלו בתכונות המרפאות שלהם. הבליעה של צמחים אלה וחומרים על בסיס צמחי קשורים יכולה להיות משמעותית באזורים שבם הוא אנדמיים, ויש להם חשיבות חברתית וכלכלית. לאחרונה עם זאת, חלה עלייה דרמטית בשימוש של תרופות אלו "טבעיים" בשל ההקלות של נגישות באמצעות מסחר באינטרנט. התפייס כי חומרים אלו בטוחים לשימוש, בשילוב עם סנקציות גדלו על חזקה ושימוש בסמים מסורתיים יותר של התעללות וחומרים סינטטיים, תרם העלייה החדה שימוש בסמים על בסיס צמחי. קשה בדרך כלל על ידי הדמיה להבחין בין מוצרים אלה חומר צמחי מזיק, ולכן יש עניין בפיתוח שיטות שיכולות לשמש לזיהוי מוצרים אלה. עם זאת, שיטות אנליטיות קונבנציונליות עבור מפעלזיהוי מינים צורכים זמן ולא מעשי לבצע. יתר על כן, תהליך פיתוח שיטות זמן ומשאבים רבים. גורמים אלה הפכו את crafting של חקיקה כדי לרסן את השימוש בחומרים אלה הרחק מאחור שיעור הסלמת ההתעללות שלהם. לפיכך, יש כמה חוקים המסדירים את הייצור, ייצור, מכירה וצריכה של רבי החומרים פסיכואקטיביים הטבעיים האלה וככזה, יש מאה צמחים של התעללות זמינה למשתמשים באלף צורות שונות. ^1,2

שתי תרופות על בסיס צמחי כגון התעללות הם speciosa Mitragyna, הידוע בכינויו Kratom, וצמחים מן הסוג ב"דאטורה, כלומר ד stramonium, ד Ferox וד "אינוקסיה". Kratom ו ב"דאטורה הם לא מתוכננת בארצות הברית, אך הרשות למלחמה בסמים רשם הן כתרופות לדאגה. ^3,4 Kratom מתאפיין בנוכחות תרכובות פסיכואקטיביים mitragyninend 7-hydroxymitragynine, כמו גם אלקלואידים שאינם פסיכואקטיביים אחרים כולל mitraphylline, paynantheine, corynoxeine, ו rhynchophylline. ^4-8 המאפיינים פסיכואקטיביים של spp ה"דאטורה". מיוחסות אטרופין ו סקופולמין, אלא מגוון של אלקלואידים טרופאן אחרים זוהו הצמחים. ^9-12 שניהם Kratom ו ב"דאטורה היו מעורבים בהרעלות והרוגים, והזדהותם שהצורך בו הולך וגדל הן בקונטקסט המשפטי ו טוקסיקולוגית, כפי הניצול לרעה של מוצרים אלה נמצא במגמת העלייה. ^13-16

באופן כללי, שיטות מסורתיות, המשמשות לניתוח של חומר סמים משפטי, כגון בדיקות צבע, מיקרוסקופיה, ו רמן ספקטרוסקופיה אינפרא האדום, משמשים ככלל-in / שלטון-אאוט קיבולת משוערת. טכניקות למקף כגון GC-MS ו ספקטרומטריית נוזלי המוני כרומטוגרפיה (LC-MS), שיטות ניתוח מאשרות מבוססת על השוואה בין הפרופילים של analytes מזוההכדי קבוצת העבודה המדעית על ניתוח של סמים שנתפסו (SWGDRUG) סטנדרטים הספרייה. ¹⁷ הצעדים טיפול מדגם המבוצעות לפני הניתוח כולל אִבּוּק, חילוץ, derivatization ואידוי, יכול להוסיף שעות את זמן הריצה ואת למהול המדגם, ^{9,11 ,} ניתוח קבלת ^18,19 של תרופות בוטניות פחות פשוט בהשוואה לזו לתרופות מסורתיות אחרות של התעללות כמו קוק או הרואין. יתר על כן, תוכניות chromatographic פרט צריכות להיות שפותחו עבור כל מוצר של עניין, מה שהופך את יישום פרוטוקולי הפעלה סטנדרטיים עבור כל מין או מגוון של סמים על בסיס צמחי של התעללות מעשית מאוד עבור casework השגרתית.

ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה האמיתית הוא טכניקת spectrometric סביבת יינון ההמוני עוקפת חלק מהאתגרים הקשורים שיטות אנליטיות קונבנציונליות. גזים, נוזלים, מוצקים, אבקות, צלחות TLC ו מאטר צמחial כולם יכולים להיות מנותח באמצעות ניתוח ישיר ישירות בזמן אמת-גבוהה ספקטרומטריית מסה רזולוציה, ושניהם תרכובות הקוטב הלא קוטבי ניתן לאתר בקלות מטריצות מורכבות. ^20-22 יתר על כן, מחקרים הראו כי תרכובות פסיכואקטיביים ניתן לזהות במהירות חומר צמחי על ידי ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה האמיתית, ומידע מינים ספציפיים ניתן ללמוד מן העיבוד הסטטיסטי של הנתונים ספקטרליים ההמוניים. ^22-26

כאן, אנו מראים כי ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוציה זמן-גבוה אמיתי יכול לשמש כדי להעריך חומרים צמחיים שונים במהירות (כלומר, צמחים, אבקות, תמציות זרעי) עבור רכיבים פסיכואקטיביים שלהם, וכי מינים וזנים של plant- מוצרים שמקורם יכולים להיקבע בצורה מהירה תפוקה גבוהה. הניתוח של החומר הבוטני רלוונטי מבחינה משפטית ללא צורך צעדים הכנת המדגם או chromatographic ארוךלרוץ פעמי ניתוח, בנוסף זיהוי מינים במפעל מדווח.

Protocol

1. הכנת חומרי Plant

Kratom הטרי ליף חומר
1. השתמש ניקוב חורים בקוטר 6 מ"מ ליצור chads אחיד של חומר עלה Kratom מ M. צמח speciosa. חזור 5 פעמים.
Kratom אבקת הפקה
1. מערבבים 5 מ"ל של אתנול ו -5 מ"ל מים מזוקקים כדי ליצור 1: 1 תערובת ממס עבור החילוץ.
2. בתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, להשעות כמות קטנה (~ 5 מ"ג) של אבקת Kratom באלי ב 1 מ"ל של 1: EtOH 1: H ₂ O תערובת ממס. חזור 5 פעמים.
3. Sonicate הדגימות לחלץ אבקת Kratom באל באמבטיה קולית במשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה.
4. צנטריפוגה לחלץ דגימות אבקת Kratom באלי עבור 2 דקות ב 750 XG בטמפרטורת הסביבה.
5. למזוג ממס אבקת שיורית לניתוח שלאחר מכן.
הכנת זרע הדטורה
1. פורסים ד Stramזרע onium לשניים לרוחב המישור הרוחבי באמצעות סכין גילוח. חזור באמצעות 5 זרעים שונים.
2. חזור על הפעולה עבור ד "אינוקסיה" וד זרעי Ferox.

2. ניתוח ישיר בזמן אמת יון פרמטרי מקור

טמפרטורת תנור גז
1. הגדר את טמפרטורת תנור גז של מקור היון ל -350 מעלות צלזיוס.
מצב יון
1. לנהל את הניתוח במצב יון חיובי עם מתח רשת של 250 V.
קצב זרימת גז הליום
1. הגדר את קצב זרימת הליום גז 2.0 L / sec.

3. זמן של טיסת פרמטרים ספקטרומטר מסות

מתחי פתח
1. הגדר את המתח פתח 1 עד 20 V לבין המתח פתח 2 עד 5 V.
מתח עדשת טבעת Peak
1. התאם את מתח עדשת טבעת 5V ולשנות את מתח פסגות 600 V.
Mass Spectral רכישה
1. הגדר את קצב רכישת ספקטרלי מונית 1 ספקטרום לשנייה על פני טווח המוני של m / z 60-800.
Mass ספקטרומטר פתרון כוח
1. הגדר את כושר ההפרדה של ספקטרומטר מסה 6000 FWHM.

ניתוח 4. של חומרים צמחיים

ניתוח של Kratom ליף
1. לחצו על "התחל הפעלה" תוכנות שליטה ספקטרומטר מסה. להשעות את צ'אד של חומר צמחי בין מקור יון כניסת ספקטרומטר מסה (כ -2 ס"מ מכניסת) עם פינצטה עד ספקטרום מתקבל. חזור 5 פעמים עם chads הנפרד של חומר צמחי.
2. כייל את הספקטרום עם פוליאתילן גליקול 600 (PEG).
  1. טובלים את הסגור של צינור נימי נקודת התכה לתוך סטנדרטי PEG. להשעות את נימי מצופה between מקור היון ואת כניסת ספקטרומטר מסה.
3. לאחר ניתוח בתקן PEG, בחר בלחצן "עצור" כדי לסיים את הריצה אנליטי.
4. לחצו על "התחל הפעלה" תוכנות שליטה ספקטרומטר מסה. להשעות כמות קטנה של חומר עלים יבשים בין מקור יון כניסת ספקטרומטר מסה עם פינצטה עד ספקטרום מתקבל. חזור 5 פעמים, ניתוח חומר צמחי חדש בכל פעם.
5. כייל את הספקטרום עם PEG.
  1. טובל את הסגור של נימים לתוך סטנדרט PEG. להשעות את נימי מצופה בין מקור יון ואת כניסת ספקטרומטר מסה.
6. לאחר ניתוח בתקן PEG, בחר בלחצן "עצור" כדי לסיים את הריצה אנליטי.
ניתוח של Kratom אבקה
1. לחצו על "התחל הפעלה" תוכנות שליטה ספקטרומטר מסה. טובל את הסגור של נימי נקודת התכה לאבקת Kratom.
2. Suspenד נימי המצופה בין מקור יון כניסת ספקטרומטר מסה עד ספקטרום מתקבלות. חזור על הניתוח 5 פעמים עם נימים חדשים בכל פעם.
3. כייל את הספקטרום עם PEG.
  1. טובל את הסגור של נימים לתוך סטנדרט PEG. להשעות את נימי מצופה בין מקור יון ואת כניסת ספקטרומטר מסה.
4. לאחר ניתוח בתקן PEG, בחר בלחצן "עצור" כדי לסיים את הריצה אנליטי.
ניתוח של חלץ Kratom
1. לטבול את הקצה הסגור של צינור נימים לתוך לחלץ.
2. להשעות את צינור נימי במחזיק 12-מדגם על המעקה ליניארי המצורפת ספקטרומטר מסה. חזור 5 פעמים עם תמצית שונה בכל פעם.
3. לחצו על "התחל הפעלה" תוכנות שליטה ספקטרומטר מסה. שימוש בלוח הבקרה, בחר בלחצן ">" כדי לקדם את הרכבת ליניארי דרך זרם היונים בקצב של 1 מ"מ / sec כדילאסוף ספקטרה.
4. כייל את הספקטרום עם PEG.
  1. טובל את הסגור של נימים לתוך סטנדרט PEG. להשעות את נימי מצופה בין מקור יון ואת כניסת ספקטרומטר מסה.
5. לאחר ניתוח בתקן PEG, בחר בלחצן "עצור" כדי לסיים את הריצה אנליטי.
ניתוח של זרעים ב"דאטורה
1. לחצו על "התחל הפעלה" תוכנות שליטה ספקטרומטר מסה. להשעות במחצית זרע ב"דאטורה בין מקור יון כניסת ספקטרומטר מסה עם פינצטה עד ספקטרום נאסף. ודא כי הצד החתוך מכוון להתמודד עם מקור היון. חזור 5 פעמים, ניתוח זרע חדש וחצי בכל פעם.
2. כייל את הספקטרום עם PEG.
  1. טובל את הסגור של נימים לתוך סטנדרט PEG. להשעות את נימי מצופה בין מקור יון ואת כניסת ספקטרומטר מסה.
3. לאחר ניתוח בתקן PEG,בחר בלחצן "עצור" כדי לסיים את הריצה אנליטי.
4. חזור על שלבים 4.4.1-4.4.3 עבור כל מין ה"דאטורה".

5. עיבוד נתונים

קבצי נתונים תרגום
1. בשנת תוכנת עיבוד נתונים, בחר קובץ "תרגום קבצי DART" עם "כיול אוטומטי" מופעל כדי ליצור קבצי נתונים מכוילים.
2. שמאל לחץ וגרור תיבה מסביב השיא הראשון הכרומתוגרמה ובחר "ממוצע" כדי ליצור ספקטרום בממוצע.
3. קליק ימני לגרור תיבת סימון סביב תחום שבו אין המדגם נאסף ובחר "קופסא שלמה ממוצע כרקע" כדי לחסר רקע מהספקטרום בממוצע.
4. שמור את הספקטרום ההמוני כקובץ txt.
5. חזור על שלבים 5.1.1-5.1.4 לכל שיא הכרומתוגרמה ליצור ספקטרום בממוצע עבור כל לשכפל את הקובץ.
6. חזרו על שלבי 5.1.2-5.1.5 עבור כל קובץ שנאסף.

6. ניתוח סטטיסטי

ניתוח מרכיבים ראשיים
1. במקטע לסווג של תוכנת ניתוח ספקטרלי (ראה רשימת חומרים), תחת הלשונית "גדר", יצירת מחלקות לעיבוד נתונים על ידי בחירה "Add Class".
2. ייבא את קבצי טקסט של נתונים על ידי בחירת "הוסף קובץ (ים)".
3. הקצה קבצי הנתונים אל המעמד המתאים של המפעל על ידי בחירת קבצי טקסט "הגדר מחלקה עבור קבצים נבחרים".
4. המוני תכונה בחרו לאפלית מ- MS ממגרש אימונים וברירות% סף מוגדר ל -1%.
5. גדר סובלנות המונית (MMU) עד 10 ובחר "לבנות וקטורי מקובצי נתונים".
6. בקטע "מחשוב", לבצע ניתוח מרכיבים ראשיים ידי סימון התיבה גרף 3D PCA ובחר "חשב".
7. מבצע אימות קרוס יוצא-אחד-על ידי בחירת "אמת (איטי!)."
לייצר חום מפה
בלשונית מגרש תדר של תוכנת ניתוח ספקטרלי, ליצור מפה חומה של נתונים על ידי בחירה "מחמם מפה."
בחר "נתונים שמורים סף" להגדיר סף שפע ל -1%.
יצא את מפת החום לגיליון אלקטרוני על ידי בחירת "מפת חום שמור ל- Excel."
בתוכנית גיליון אלקטרוני, לשמור את מפת החום לייצא כקובץ txt.
ניתוח אשכולות היררכי
ייבא את מפת החום כקובץ .txt לתוך תוכנת 3.0 Cluster.
בלשונית ההיררכית של Cluster 3.0, תחת גני מערכים, תיבות סימון "אשכול" ו "משקולות חישוב". גדר הפסקה ברמה של 0.1 ו מעריך 1. בחר אשכולות הצמדה אחת לבצע ניתוח.
הצג את קובץ הנתונים .cdt שנוצר ב- Java TreeView.

תוצאות

יינון רך נציג ניתוח ישיר במצב חיובי יון בנתונים ספקטרומטריית מסת רזולוציה בזמן אמת-גבוהה של מוצרי Kratom וזרעים ב"דאטורה מוצג איורים 2 ו -3. תרכובות שונות מבודדות בעבר מ M. speciosa, כולל mitragynine (C ₂₃ H ₃₀ N ₂ O ₄ + H ^+, מ '/ z 399.2284) ו -7-hydroxymitragynine (C ₂₃ H ₃₀ N ₂ O ₅ + H ^+, מ' / z 415.2233), התגלו בכל ארבעת דגימות והנתונים מדידת מסת המקביל מוצגים בלוח 1. ^4-8 נציג נתונים ב"דאטורה מוצגים באיור 3 ו סמנים אופייניים, כולל אטרופין (C ₁₇ H ₂₃ NO ₃ + H ^+, מ '/ z 290.1756) ו סקופולמין (ג' ₁₇ H ₂₁ NO ₄ + H ⁺ , מ '/ z 304.1549) אותרו שלושה מינים. נתוני מדידה המוניים הקשורים איור 3 מוצגים בלוח 2. ^9-12 זהויות מתחמות אושרו'בנחישות רכב יסודות, איזוטופ התאמת, והשוואות דיווחים בספרות. ^23-24

הדמיות מפת חום של ניתוח ישיר בספקטרום ספקטרומטריית מסה ברזולוציה זמן השיא האמיתיות Kratom ו ב"דאטורה הם באיור 4. הנתונים המוצגים שימשו ניתוח מרכיבים ראשיים (PCA) להבדיל בין שני סוגים של תרופות על בסיס צמחי של התעללות (איור 5). עלילת PCA נבנתה באמצעות עשרה המוני תכונה (המפורטים בטבלה 3), עם עיגולים כחולים מייצגים נתוני Kratom וכיכרות אדומות המייצג נתונים ה"דאטורה". ההמונים לתכונה הנבחרים תואמי אלקלואידים שונים מציגSpp הדטורה או Mitragyna., כולל אטרופין תרכובות פסיכואקטיביים, סקופולמין, mitragynine ו -7-hydroxymitragynine. ^23-24 שלושה מרכיבים עיקריים היוו 75.26% מהשונות ולהשאיר ואחת תקינות של צלב (LOOCV) היה 100%. עלילת PCA עולה בבירור כי נתוני Kratom ונתונים ב"דאטורה נפתרים היטב זו מזו. גם ניתוח PCA גילה כי הזנים הבודדים של Kratom ואת המינים השונים של ב"דאטורה יכולים להיות מזוהים נבדלים זה מזה (איור 6). LOOCV היה 94.29% עם שלושה מרכיבים עיקריים המכסים 75.26% מהשונות. שני הסוגים של Kratom (באל עיגולים כחולים ריפעת בכיכרות אדומות) אשכול יחד, המעיד על כך שהם שייכים למין M. speciosa, אך נפתרות זו מזו, הוכחה כי הם מייצגים סוגים שונים. זאת ועוד, קבוצת מינים ב"דאטורה יחד ומופרד M. spנתוני eciosa, אבל כל אחד המינים הבודדים של ב"דאטורה (ד "אינוקסיה" במשולשים ירוקים, ד stramonium בכיכרות ורודות וד Ferox בחוגי טורקיז) הם מובחנים בבירור. למרות נקודת נתונים עבור ד stramonium להיראות נתון חריג, הזרע מסווג בצורה נכונה כפי ד stramonium ולא ד "אינוקסיה" באמצעות PCA. והחשוב מכל, את ההבדל בצבע זרע בין ד stramonium וד "אינוקסיה" מאשרת הם מינים שונים וכי נקודת נתוני שאלה לא יכולה להיות ד "אינוקסיה".

אשכולות היררכיים (איור 7) בוצעו ללא הבחירה מראש של המוני תכונה. במקום זאת, הקבוצה השלמה של ערכות נתונים ספקטרליים פורשות מגוון המוני של m / z 60-800 יובאה לתוך תוכנת קיבוץ באשכולות גנומי קוד פתוח וכן dendrogram הכולל הנתונים הזה הופק. תוצאות oHCA f חשף גם בכיתה, מינים והבחנה מגוונת מבוססים אך ורק על ניתוח ישיר בזמן אמת-ברזולוציה גבוהה נגזר נתונים ספקטרומטריית מסה ואשר לאלה של ניתוח PCA. שני סוגי תרופות על בסיס צמחי של התעללות, Kratom ו ב"דאטורה, הופרדו clades הפרט של dendrogram. יתר על כן, הזנים ריפעת ובאלי של Kratom היו כל מבודדים לתוך-clades משנה בודדות בתוך הכיתה Kratom. באופן דומה, ד "אינוקסיה", ד Ferox וד stramonium נפתרו לתוך clades שלהם על ידי מינים בתוך הכיתה ה"דאטורה".

figure-results-4042
איור 1. תמונות של M. speciosa (Kratom) מוצרים spp ב"דאטורה זרעי a: עלים יבשים באל Kratom; ב:.. אבקה באל Kratom; ג: צמח ריפעת Kratom חי; ד: ד זרעי stramonium; דואר: ד זרעים "אינוקסיה"; f: ד Ferox זרעים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. ניתוח ישיר בזמן-גבוה אמיתי ברזולוציה ספקטרומטריית מסה ספקטרה חיובית-יון של M. speciosa (Kratom) למוצרים: עלה טרי ריפעת; ב:. עלים יבשים באליי; ג: אבקה באליי; ד: תמצית אבקה באל. הנתונים מדידי מסה הקשורים ספקטרה אלה מוצגים בלוח 1. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. ניתוח ישיר בספקטרום חיוב יון ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן שיא אמיתיות spp ה"דאטורה". . זרעי a: ד Ferox; ב: ד "אינוקסיה"; ג: ד stramonium. הנתונים מדידי המסה הקשורים ספקטרה אלה מוצגים בלוח 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. הדמיות מפת החום של הניתוח הישיר בזמן-גבוהה אמיתי ברזולוציה ספקטרומטריית מסה ספקטרה של Kratom ו ב"דאטורה חומרים צמחיים. היי פסגות עוצמות GH מוצגות פסגות עוצמות אדומות ותחתונות כהות מסומנים בגוונים בהירים יותר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. ניתוח מרכיבים ראשי (PCA) עלילה של מוצרי Kratom ו ב"דאטורה נבנתה באמצעות ניתוח ישיר בנתונים המוני ברזולוציה גבוהה בזמן אמת נגזרות ספקטרומטריית. שלושה מרכיבים עיקריים (מחשבים) היוו 75.26% מהשונות, ואת חופשה ואחת תקינות של צלב (LOOCV) היה 100%. המוני התכונה המשמשים PCA מפורטים בטבלה 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

= "1">
איור 6. ניתוח מרכיבים ראשיים (PCA) העלילה של מוצרים Kratom ו ב"דאטורה באמצעות ניתוח ישיר בנתונים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה זמן-גבוה אמיתי. הקצאות מחלקה התבססו על מגוון (Kratom) או מינים (ב"דאטורה) של חומרים צמחיים. שלושה מרכיבים עיקריים (מחשבים) היוו 75.26% מהשונות ואת אימות קרוס יוצא-אחד-אאוט (LOOCV) היה 94.29%. המוני התכונה המשמשים PCA מפורטים בטבלה 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7. תוצאות אשכולות היררכיות שהושגו באמצעות הניתוח הישיר ב ti האמיתילי-ברזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה הנגזרות נתונים מניתוח של חומרים צמח Kratom ו ה"דאטורה". שני סוגי צמחים מופרדים באופן ברור לשני סניפים ברורים dendrogram (מוצג בסוגריים כחול ואדום Kratom ו ב"דאטורה, בהתאמה). המין זרע ב"דאטורה נפתר גם זו מזו (מוצגת ירוק, טורקיז ורוד מקווקו בוקסי "אינוקסיה" ד, ד Ferox, וד stramonium בהתאמה). החומרים צמח Kratom מופרדים מגוון (מוצג מקווקו תיבות אדומות וכחולות עבור ריפעת ובאלי, בהתאמה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נתוני מדידה בטבלה 1. המוניים הקשורים בספקטרום היינון הרך של produ KratomCTS המוצג באיור 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הטבלה.

טבלה 2. נתוני מדידה המונית הקשורים בספקטרום היינון הרך של זרעים ב"דאטורה מוצגים באיור 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

לוח 3. המוני תכונה המשמש עלילת ניתוח המרכיבים ראשית של מוצרי Kratom ו ב"דאטורה שמוצגים איורי 5 ו -6.

Discussion

היכולת לזהות תרופות על בסיס צמחי של התעללות הוא של הגדלת הכרח בשל האמרת בשיווק, מכירה וצריכה של חומרים פסיכואקטיביים לא מתוכננת. ² שיטות מסורתיות לזיהוי חומר בוטני כוללות בדרך כלל אפיון של מאפיינים פיזיים בשילוב עם ניתוח של מרכיבים כימיים בשיטות spectrometric chromatographic-מסה למקף. עם זאת, הן של גישות אלה אתגרים ניתוח יעיל. תכונות פיזיות של צמחים נהרסים לעתים קרובות כאשר הצמחים הם מיובשים, מרסקים או חילוץ במהלך תהליך הייצור וככזה, היא לעתים קרובות קשה להבחין סוג אחד של מוצר פסיכוטרופיות מהצומח מעוד מבוסס על מאפיינים פיזיים בלבד. ²³ ניתוח על פי chromatographic המוני שיטות spectrometric מאפשרת זיהוי של תרכובות פסיכואקטיביים מטריצות צמח, אבל הכנת המדגם ופיתוח השיטה היא זמןnd משאבים אינטנסיביים, ויצירת הפרוטוקולים חדשים עבור כל מח' או מינים של תרופה על בסיס צמחי של התעללות אינה מעשית במעבדות כימיה משפטיות רבות.

ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה האמיתית עוקף חלק מהאתגרים הללו, כמו מטריצות מורכבות כגון עלים, אבקות, תמציות זרעים ניתן לנתח עם הכנת מדגם קטנה. למרות מטריצות מורכבות מחומרי נדגמה, המרכיבים פסיכואקטיביים קל היה לזהות, גם בריכוזים ננוגרם, ²¹ בשל הרגישות הגבוהה של ספקטרומטר מסה. זרעים, עלים ואבקות הודגמו להיות מנותחים בקלות על ידי ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה האמיתית, וכן מגוון של סוגים אחרים של חומרים גם ניתן לדגום באותו אופן, כולל צלחות TLC, מטבע, טבליות, פרחים, שלב מוצק microextraction (SPME) סיבים תרמילי puparial חרקים אפילו. ^21-22 באמצעות ana המסה המדויקתתמס, התאמת נחישות איזוטופ רכב יסודות, ביומרקרים ותרכובות של עניין ניתן לזהות, בין אם התרכובות כלולות עלה, הבחינו על צלחת TLC או מצופים על צינור נימים.

ניתוח ישיר במתודולוגיה ספקטרומטריית מסה ברזולוציה זמן-גבוה אמיתי יכול לשמש לניתוח יעיל שכן ישנם כמה פרמטרים מאוד כי צריך להיות שונה מניסוי לניסוי. ניתוח יכול להתבצע-יון חיובי או מצב שלילי-יון, ומולקולות של עד 3,000 האמו ניתן להבחין בשני המקרים. יינון במצב חיובי יון מתרחש על ידי העברת פרוטון מאשכולות מים מופעלים, ²¹ וכל תרכובת בעלת זיקת פרוטון גבוהה מזו של מים יהיו מיוננת. הנה, חיובי-יון במצב שמש בגלל זיקת הפרוטון הגבוהה של אלקלואידים, מה שגורם להם להיות מיוננים בקלות על ידי protonation. ניתוח במצב שלילי-יון יכול לשמש לצורך זיהוי המוצלח של hydrocarbתוספות (כמו O ₂ adducts) ^21, חומרי נפץ ²⁷ וחומצות אורגניות כגון artesunate בתרופות מלריה. ²⁸ בשל שיטת יינון של-העברת הפרוטון וחוסר היכולת לייצר יונים טעונים להכפיל, ניתוח ישיר במסת רזולוציה בזמן אמת-גבוהה ספקטרומטריית מתמצה בעיקר בניתוח של מולקולות קטנות של עד 3,000 האמו.

מלבד מצב יינון, הטמפרטורה של מקור היון היא פרמטר חשוב בטמפרטורה המתאימה תלויה, במידה רבה על המדגם להיות מנותח. לדוגמא, חשוב להשתמש בטמפרטורות נמוכות יותר (~ 250 ° C) לצורך ניתוח סיבי SPME כדי למנוע הרס של חומר הציפוי על הסיבים, בעוד בטמפרטורות גבוהות (~ 500 ° C) אמורות לשמש לניתוח חומצת אמינו desorption ו יינון עוקב. הנה, ניתוחי חומר צמחיים נערכו 350 מעלות צלזיוס, כמו זה מאפשר יינון של אלקלואידים ותרכובות אחרות בעלי עניין עםמתוך גרימת פירוליזה של תרכובות במטריצת הצמח.

ניתוח ישיר בניתוח ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה אמיתי לא רק מאפשר זיהוי של המרכיבים פסיכואקטיביים של החומר הצמחי מבוססים על המונים מדויקים, נחישות רכב יסודות התאמת איזוטופ, אבל זה גם מייצר טביעות אצבעות כימיות ייחודיות שניתן לנצל לצורך זיהוי מינים באמצעות ניתוח סטטיסטי רב משתנה עם תוצאות מאוד לשחזור, אפילו עם מערכי נתונים קטנים יותר. ניתוח סטטיסטי רב משתני יושם למגוון רחב של ניתוח ישיר בנתונים ספקטרומטריית מסה רזולוציה בזמן אמת גבוהה, ובכלל זה נגזר עץ, תרמילי puparial, זרעים, חומר עלה, fuelstocks ביודיזל, לראווה את הרבגוניות שחזור של השיטה. ^22-26 יכול התפוקה הגבוהה של ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה האמיתית לאפשר רכישת כמויות גדולות של spectr ההמוניתנתונים אל בפרק זמן קצר, ומספר רב של חזרות צורך לניתוח סטטיסטי נרכשים בקלות באמצעות שיטה זו. הניתוח הישיר ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה אמיתי מסת נתוני רפאים של ב"דאטורה ו Kratom היה מורכב מ -100 ספקטרה בודדים שנגבו עם פחות משעה של זמן השקעה כוללת. כדי להשיג את אותו מספר של ספקטרום באמצעות GC-MS עם תוכנית טמפרטורת התנור 30 דקות ייקח כ 50 שעות, ללא התחשבות בזמן הוסיף לצעדים הכנת המדגם, כגון מיצוי או derivatization.

ניתוח מרכיבים עיקריים שניתן להשתמש בהם כדי להדגיש וריאציות בין קבוצות של חומרים צמח מבוסס על נוכחות ועוצמה של ההמונים לתכונה הנבחרת. העיבוד והניתוח הסטטיסטי מספק זיהוי מינים, וכן מידע זניים. שיטות אחרות של ניתוח סטטיסטי, כגון ניתוח אשכולות היררכי (HCA), יכול גם להיותליישם אותו ללא בחירה מראש של ההמונים תכונה. תוצאות HCA של טביעות אצבעות כימיות מקיפות עולות כי ניתוח סטטיסט השגחה יכול להיות מיושם בהצלחה לזיהוי מינים של תרופות על בסיס צמחי של התעללות. ²⁵

אפלית המינים של חומר בוטני משפטי על ידי ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוצית זמן-גבוה האמיתית הודגמה באמצעות זיהוי של תרכובות פסיכוטרופיות ביומרקרים אחרים ספקטרה ההמונית הרך-יינון, ואת היישום של ניתוח סטטיסטי רב משתנה. היישום של שני סוגים של ניתוחים סטטיסטיים חשף לא רק שהמעמד של תרופה צמחית של התעללות ניתן לזהות, אלא גם כי מגוון מינים של אמר סמים יכולים להיקבע על בסיס טביעות האצבע הכימית הייחודיות שנצפו על ידי ניתוח ישיר זמן-גבוה אמיתי ספקטרומטריית מסה רזולוציה. השיטה המוצגת כאן מאפשרת זיהוי מהיר, תפוקה גבוהה של מילnd-שינוי חומרים באופן עוקף אתגרים נתקלו בשיטות מקובלות אנליטיים, ומספק מעבדות זיהוי פליליות עם אמצעי לאפיין ולזהות חומר צמחי פסיכואקטיביים ללא זמן ומשאבים בפיתוח שיטה אינטנסיבי. פרוטוקול זה יכול להתארך עד בידול מינים של מגוון חומרים צמחיים שמקורם אחרים. ^22-26

Disclosures

The authors have no disclosures.

Acknowledgements

המחברים בתודה להכיר אונ' אלבנית-SUNY לנשיאות יוזמות קרן למחקר מלגות במדעים משפטיים ומענק Cybersecurity, מענק קרן הלאומית למדע (מענק # 1,310,350) ומענק המכון לאומי לצדק (גרנט # 2015-DN-BX- K057) ל- RAM. אנחנו גם מכירים ג'סטין E. Giffen שהקדישו צילומי החומרים הצמחיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL USA, Inc.
DART-SVP Ion Source	IonSense, Inc.	DART-SVP
Linear Rail System	IonSense, Inc.	HW-10029
Hole puncher (6 mm)	Swingline	A7074005
One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner	Cole-Palmer	EQ-08849-00
1.5 ml Eppendorf Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-682-550
AccuSpin Micro 17R Centrifuge	Fisher Scientific	13-100676
#9 Stainless Steel Razor blade	Stanley	11-515
Dip-it Tip Holder	IonSense, Inc.	SCT-70003
Dip-it Tips	IonSense, Inc.	DPT-110
Melting Point Capillary	Krackeler Scientific	1-9530-3
Polyethylene glycol (600)	Sigma Aldrich	81180
Rifat Kratom Live Plant	World Seed Supply Kratom Collection	LIVEKRATOMPLANT
Bali Kratom Dried Leaf	The Kratom King	OZKRAPCOM
Bali Kratom Powder	The Kratom King	OZKRAPCOMPOW
Datura stramonium seeds	Horizon Herbs LLC	PDATUJ
Datura inoxia seeds	Horizon Herbs LLC	PDATUM
Datura ferox seeds	Georgia Vines	255/737
Ethanol, anhydrous	Krackeler Scientific	1328-E402-4L
Mass Mountaineer Spectral Analysis Software	mass-spec-software.com	MM-20030-PCA-DVD
TSSPro3 Data Processing/Data Reduction Software	Shrader Labs
Cluster 3.0	http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm	Open Source Software
Java Treeview	http://jtreeview.sourceforge.net/		Open Source Software

References

Authority, E.F.S. EFSA Compendium of botanicals that have been reported to contain toxic, addictive, psychotropic or other substances of concern onrequest of EFSA. EFSA Journal. 7, 1-100 (2009).
. . The challenge of new psychoactive substances: list of plant-based substances (20 Substances). , 101-102 (2013).
Jansen, K., Prast, C. Ehtnopharmacology of Kratom and the Mitragyna alkaloids. J. Ethnopharmacol. 23, 115-119 (1988).
Matsumoto, K. . Pharmacological Studies on 7-Hydroxymitragynine, Isolated from the Thai Herbal Medicine Mitragyna speciosa: Discovery of an Orally Active Opioid Analgesic. , (2006).
Matsumoto, K., et al. Involvement of µ-opioid receptors in antinociception and inhibition of gastrointestinal transit induced by 7-hydroxymitragynine, isolated from Thai herbal medicine Mitragyna speciosa. Eur. J. Pharmacol. 549, (2006).
Matsumoto, K., et al. Antinociceptive effect of 7-hydroxymitragynine in mice: Discovery of an orally active opioid analgesic from the Thai medicinal herb Mitragyna speciosa. Life Sciences. 74, 2143-2155 (2004).
El Bazaoui, A., Stambouli, H., Bellimam, M. A., Soulaymani, A. Determination of tropane alkaloids in seeds of Datura stramonium L. by GC/MS and LC/MS. Ann. Toxicol. Anal. 21, 183-188 (2009).
Friedman, M., Levin, C. E. Composition of Jimson Weed (Datura stramonium) seeds. J. Agr. Food Chem. 37, 998-1005 (1989).
Philipof, S., Berkhov, S. GC-MS Investigation of tropane alkaloids in Datura stramonium. Z Naturforsch. 57, 559-561 (2002).
Preissel, U., Preissel, H. -. G. . Brugmansia and Datura: Angel's Trumpets and Thorn Apples. , (2002).
Boumba, V. A., Mitselou, A., Vougiouklakis, T. Fatal poisoning from ingestion of Datura stramonium seeds. Vet. Hum. Toxicol. 46, 81-82 (2004).
Kronstrand, R., Roman, M., Thelander, G., Eriksson, A. Unintentional Fatal Intoxications with Mitragynine and O-Desmethyltramadol from the Herbal Blend Krypton. J. Anal. Toxicol. 35, 242-247 (2011).
Neerman, M., Frost, R., Deking, J. A drug fatality involving Kratom. J. Forensic Sci. 58, 278-279 (2013).
Steenkamp, P. A., Harding, N. M., Van Heerden, F. R., Van Wyk, B. -. E. Fatal Datura poisoning: Identification of atropine and scopolamine by high performance liquid chromatography / photodiode array / mass spectrometry. Forensic Sci. Int. 145, 31-39 (2004).
. . Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drug Recommendations. , (2014).
Kikura-Hanajiri, R., et al. Simultaneous analysis of mitragynine, 7-hydroxymitragynine, and other alkaloids in the psychotropic plant "Kratom" (Mitragyna speciosa) by LC-ESI-MS. Forensic Toxicol. 27, 67-74 (2009).
Wang, M., et al. Comparison of three chromatographic techniques for the detection of mitragynine and other indole and oxindole alkaloids in Mitragyna speciosa (Kratom) plants. J. Separation Sci. , (2014).
Cody, R. Observation of molecular ions and analysis of nonpolar compounds with the Direct Analysis in Real Time ion source. Anal. Chem. 81, 1101-1107 (2009).
Cody, R., Laramee, J., Durst, H. D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions. Anal. Chem. 77, 2297-2302 (2005).
Musah, R. A., et al. A High Throughput Ambient Mass Spectrometric Approach to Species Identification and Classification from Chemical Fingerprint Signatures. Sci. Rep. 5, (2015).
Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Rapid detection by direct analysis in real time-mass spectrometry (DART-MS) of psychoactive plant drugs of abuse: The case of Mitragyna speciosa aka "Kratom". Forensic Sci. Int. 242, 210-218 (2014).
Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Plant Seed Species Identification from Chemical Fingerprints: A High-Throughput Application of Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry. Anal. Chem. , (2015).
Espinoza, E. O., et al. Distinguishing wild from cultivated agarwood (Aquilaria spp.) using direct analysis in real time and time of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28, 281-289 (2014).
Lancaster, C., Espinoza, E. Evaluating agarwood products for 2-(2-phenylethyl)chromones using direct analysis in real time time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 26, 2649-2656 (2012).
Sisco, E., Dake, J., Bridge, C. "Screening for trace explosives by AccuTOF™-DART®: An in-depth validation study.". Forensic Sci. Int. 232, 160-168 (2013).
Fernandez, F. M., et al. Characterizatoin of solid counterfeit drug samples by desorption electrospray ionization and direct analysis in real time coupld to time-of-flight mass spectrometry. Chem. Med. Chem. 1, 702-705 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116 Kratom Mitragyna speciosa Jimsonweed

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: