לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

microinjection cytoplasmic של עוברי 1 תאים היא טכניקה רבת עוצמה. זה יכול לשמש להעברת כל פתרון לתוך העובר, למשל, לייצר הגן לדפוק-outs ללמוד תפקוד הגן או כדי ליצור חיות הגן בעריכה. רוב חקלאי-רלוונטי zygotes חוות חיות יש רכב חומצות שומן מאוד גבוה שגורם הציטופלסמה שלהם אטום וחשוך ^1. יש להם גם קרום פלזמה אלסטי למדי (PM). תכונות אלו הופכות את microinjection באמצעות pronuclear קונבנציונלי / הזרקת ציטופלסמית כפי שמוצגת במינים מכרסמים מאתגרים ולעתים קרובות לא מדויקים.

יש microinjection cytoplasmic יתרונות על פני microinjection pronuclear שכן הוא קל יותר לבצע וגם גורם פחות נזק את העוברים מוזרק, וכתוצאה מכך כדאיות גבוהה ^2. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים שיטה מוצלחת לאספקת פתרונות לתוך הציטופלסמה של zygotes חיות משק. כדי להיות מסוגל לבצעmicroinjection cytoplasmic עם יעילות גבוהה על עוברי בעלי חיים, לייזר משמש כדי ליצור חור המעטפת השקופה (ZP) ולאחר מכן מחט זכוכית קהה-end משמש microinjection. אסטרטגיה זו שואפת להקטין את נזק מכני המוטבע על העובר במהלך ההזרקה. לאחר מכן, שאיפה של תוכן ציטופלסמית בתוך המזרק מאפשרת שבירה יעילה ובטוחה של ראש הממשלה להבטיח כי הפתרון מועבר לתוך הציטופלסמה של העובר.

טכניקה זו כבר נוצלה בהצלחה בעוברי שור לספק siRNA לתוך הציטופלסמה zygotic ^3,4 וליצור מוטציות באמצעות חזרות palindromic קצרות interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / קשור CRISPR מערכת 9 (Cas9) מערכה ^5. זה גם מתאים (עם שינויים קלים) להזרקת ביציות קומולוס סגורה שור ^6. כאן אנו מתארים פרוטוקול ההזרקה שלנו ומספק צבע, שיכול לחול על הזרקת כל desפתרון IRED לתוך הזיגוטה, ולהראות כי באמצעות טכניקה זו גורמת תמוגה מינימלי ואינו להשפיע על התפתחות העובר המוקדם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ייצור Micropipette

1. micropipette הזרקה
   1. מניח זכוכית נימי בורוסיליקט (קוטר חיצוני (OD): 1.0 מ"מ, קוטר פנימי (ID): 0.75 מ"מ) ב חולץ micropipette (במרכז מחזיקי ימין ושמאל נימים) ונעל אותו.
   2. השתמש בתוכנית המתאימה למשוך את נימי זכוכית כך התוצאה היא קצה דק עם טאפר ארוך. (דוגמה: חום: 825; משוך: 30; מהירות: 120; זמן: 200; לחץ: 500).
   3. מוציאים בזהירות את טפטפות משך מהמכשיר והנח אותו על microforge במצב מאוזן.
   4. תביא פיפטה משכה נימת דוד microforge עם חרוז הזכוכית שלה אל מוקד. השתמש reticle העינית כדי למדוד את העובי הרצוי ולעבור פיפטה אופקית עד נימת הדוד מגיעה הקוטר הפנימי היעד (5 מיקרומטר).
   5. התאם את החום לכ -45% ובעדינות להביא את פיפטה למטה כך הוא בא במגע עם הנימה. הפעל את החימום בקצרה. w זהחולה מעט להמס את פיפטה כך שומר על הנימה ו בקירור, פיפטה תשבור בנקודת מגע יצירת חתך ישר.
      הערה: הגדרת הטמפרטורה המתאימה היא המפתח בשלב זה מאז בטמפרטורות גבוהות מדי יגרום העיקול פיפטה ובכך חתך ישר לא ניתן יהיה וטמפרטורות נמוכות מדי לא יספיקו כדי להמיס את פיפטה (איור 1 א).
   6. תן זווית משוערת 30 ° ליד קץ פיפטה ידי מיקומה על 10 מיקרומטר הרחק נימת הדוד. כוונו את הטמפרטורה ל -60% ולהפעיל את החימום.
      הערה: זה יהיה לכופף את פיפטה על הנימה. זווית זו היא רצויה כך קצה המחט הוא במקביל לפני השטח של צלחת ההזרקה כאשר רכובים לתוך המזרק (האיור 1B).
   7. טפל טפטפות microinjection בזהירות כפי שהם מאוד חדים ושבריר.
2. micropipette החזקה
   1. מניחים borosilicזכוכית נימי אכלו (OD: 1.0 מ"מ, מזהה: 0.75 מ"מ) ב חולץ micropipette (במרכז מחזיקי נימי ימין ושמאל) ונעל אותו.
   2. השתמש בתוכנית המתאימה למשוך את נימי זכוכית כך התוצאה היא קצה דק עם ארוך אפילו להתחדד ו קירות מקבילים (דוגמה: חום: 815; משוך: 20; מהירות: 140; זמן: 175; לחץ: 200).
   3. מוציאים בזהירות את פיפטה משך מהמכשיר חולץ ומניחים אותו על בעל microforge במצב מאוזן. התאם את המיקוד על נימת חימום פיפטה.
   4. השתמש reticle העינית כדי למדוד את קוטר פיפטה ולהעביר את פיפטה עד קוטרו מעל הנימה מגיע 180 מיקרומטר.
   5. באותו הגודל המצוין, לסמן את נימי זכוכית עם עט בעל חוד יהלום, ולאחר מכן לחץ בעדינות על קצה המשך לשבור את הכוס. זה אמור לגרום חתך ישר (איור 1 ג).
   6. הזז את פיפטה לתנוחה אנכית עם קצו קרוב הנימה. הגדר את הטמפרטורה של microforge ל -60%.
   7. אש-פולני קצה פיפטה באמצעות טכניקות סטנדרטיות ⁷ עד שהוא מגיע מזהה של 40 מיקרומטר. השתמש reticle העינית יבדוק את התעודה (1D איור).
   8. תן זווית על פיפטה.
      1. תביאו פיפטה בחזרה למצב אופקי על 10 מיקרומטר הרחק נימה ו -5 מ"מ הרחק קצהו. הגדר את הטמפרטורה לכ 60% ולהפעיל את החימום כדי לכופף את פיפטה על הנימה. המשך חימום עד לזווית רצויה (של כ -30 ^o) הוא הגיע. בדוק את זווית ראייה (1E איור).
         הערה: פיפטה בדרך כלל רכובה על microinjector בזווית של כ -60 ^o ביחס לחלק התחתון של מנת ההזרקה. הטיפ של פיפטה מכופף כך שהוא מקביל התחתון של המנה, אשר הוא הכרחי עבור הזריקה הנכונה של העובר מטוס באמצע שלה.

le "> 2. הגדרת Micromanipulator

1. בדוק כי microinjectors נטענים באופן מלא עם שמן וכי אין בועות אוויר במערכת (בועות microinjector למנוע בקרה טובה של הזרקה).
2. בדוק כי micromanipulators נמצא בעמדת המרכז. זה יאפשר מגוון רחב של תנועה של טפטפות.
3. הכנס פיפטה מחזיק לתוך מחזיק micromanipulator השמאל פיפטה הזריקה לתוך מחזיק המיקרומניפולציה התקין.
4. אפשר שמן להיכנס טפטפות ידי קפילריות ולבדוק כי המערכת פועלת כראוי על ידי העברת הנפט מעלה ומטה בתוך פיפטה באמצעות הפקדים microinjector.
   הערה: אם אין תנועה של שמן בתוך המחטים, ייתכן שיש לסתום. במקרה זה, השתמש מחט חדשה.
5. השתמש בפקדים micromanipulator להביא את טפטפות למרכז השדה של מיקרוסקופ מבט. באמצעות הגדלה 4X, לבדוק כי טיפים micropipette נמצאים בזווית הנכונה (עמ 'arallel אל החלק התחתון של המנה).
   הערה: התקנה נכונה של המחטים היא מפתח עבור זריקה מוצלחת ועל עקביות תוצאות.
6. כייל את מערכת הלייזר הבאים במדריך כיול של היצרן.

3. הכנת צלחת הזרקה (איור 2)

1. מניחים ירידה 50 μl של התחמם (37 ° C) SOF-HEPES (הרכב המפורטים בסעיף חומרים) בתוספת 20% עוברי בסרום שור (FBS) על במרכז המכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ. מניחים 1 - ירידה μl 2 של הפתרון להיות מוזרק קרוב עד טיפת ההזרקה. ודא כי עוברי לא להתקרר מתחת RT.
   הערה: בפרוטוקול זה נוסיף את צבען אדום-Dextran לפתרון ההזרקה כדי להיות מסוגל לדמיין באתר ההזרקה ולעקוב אחר זה מאוחר יותר.
2. מכסים את טיפות בצלחת ההזרקה באמצעות כ 10 מ"ל של שמן מינרלי.
3. מניח את צלחת ההזרקה על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה ולהביא החרצןettes לתוך ירידת ההזרקה. בדוק כי המחטים הן בפוקוס בתוך הטיפה. וכוון את גובהם לפי הצורך באמצעות הפקדים micromanipulator.
4. באמצעות microdispenser, לטעון על 20 - 30 zygotes (17 - 20 שעות לאחר ההפריה (hpf)) בצד העליון של ירידה ההזרקה. בצע הזרקה בטמפרטורת חדר כך את מספר העוברים בירידת ההזרקה נקבע לפי המהירות שבה האדם יכול להזריק אותם. אל תטען יותר עוברים יותר מאלה שיכולים להיות מוזרק 30 דקות.
   1. כדי לטעון את העוברים לתוך microdispenser, לוחץ על המתג לחלוטין לטבול את הקצה לתוך התמיסה המכילה את העוברים. געו העוברים שיאספו אותו עם הקצה של נימי הזכוכית (אחד בכל הפעם) ולאט לאט לשחרר את הבוכנה כך כל עובר נכנסה לתוך הנימים. חזור על פעולה זו עד שכל העוברים נאספים או יכולת microdispenser מלאה.
   2. כדי לשחרר את העוברים הטעונים, לוחץ על המתג בעדינות עד שיתוף כל הנפחntaining עובר הוא שוחרר מן הנימים.

4. Microinjection

1. באמצעות מטרת 4X, טען את הפתרון להיות מוזרק לתוך פיפטה ההזרקה ידי הפעלת לחץ שלילי (aspirating). טען פתרון מספיק להזריק 2 - 3 zygotes. לאחר מכן להעביר עד טיפת ההזרקה.
2. בתוך טיפת ההזרקה, להזיז את פיפטה מחזיק כך שהקצה מתקרב קרוב זיגוטה. החל לחץ שלילי (לשאוב) עם microinjector ההחזקה כך הזיגוטה מקבל קבוע פיפטה מחזיקה ותיקונים לבוא מטרה 20X.
3. לאחר הזיגוטה מחוברת פיפטה מחזיקה, לבדוק את איכותו בעזרת פיפטה ההזרקה כדי להזיז את העובר בעדינות ממקום למקום מבלי לנתק אותו. זיגוטה באיכות טובה צריכה שני גופים הקוטביים (אם כי לפעמים רק אחד נתפס) ו הציטופלסמה הומוגנית. אין להזריק zygotes נורמלי (איור 3 א).
4. במידת הצורך, לשנות את מיקום העובר עבור זריקה נכונהמקום. מיצוב טוב יהיה זה שבו יש קצת מקום בין ZP וראש הממשלה, כך ראש הממשלה אינו ולהינזק ידי לייזר.
5. בדוק כי פיפטה ההזרקה ממוקמת על-המטוס באמצע של העובר על ידי נגיעת הזיגוטה בעדינות באתר הזרקה. אם זה לא על אמצע המטוס שלה, המחט תהיה נוטה להפוך את העובר לסובב במקום לנקב. התאם את הגובה של פיפטה הזריק לפי צורך.
6. הפוך חור ZP באמצעות לייזר (איור 3 ב).
   1. תוך שימוש במקום התוכנה של לייזר צלב הכיוון לייזר ZP איפה החור ייעשה (בצד הנגדי למקום שבו העובר מחוברת פיפטה מחזיקה). באמצעות קליק חלון בקרת לייזר על כפתור האש. ודא כי גודלו של החור הוא גדול מספיק כדי ליצור פתח ZP עבור המחט לעבור מבלי לפגוע PM (דוגמה: 0.662 רוחב פולס msec / 6.9 מיקרומטר גודל חור).
7. להעביר את מחט הזריקהדרך חור ZP וליצור קשר עם ראש הממשלה. המשך לדחוף פיפטה קדימה עד שהמחט נמצאת ¾ של הדרך אל העובר (איור 3 ג).
8. שים את המיקום של המניסקוס על שלבי פתרון-שמן, כמו זה ישמש לשלוט נפח הזרקה בעקביות.
9. החל לחץ שלילי (לשאוב) על פיפטה ההזרקה, אשר תגרום PM ו הציטופלסמה להיות aspirated לתוך מחט הזריקה. המשך עד שהתנועה של הציטופלסמה לתוך המחט מאיצה או כאשר תוכן הציטופלסמה ערבוב עם פתרון הזרקה ניתן לראות. אלה יציינו שבירה של ראש הממשלה (איור 3D).
10. להזריק בחזרה התוכן ציטופלסמית ואחריו הפתרון לתוך הציטופלסמה של הביצית המופרית על ידי הפעלת לחץ חיובי (הזרקה), עד המניסקוס על שלבי פתרון-שמן התקדם מקביל בקוטר של הזיגוטה אחד בעבר לנקודת ההתחלה.
    הערה: בתנאים שלנו, repre זהsents כ 7 pl של פתרון מוזרק (איור 3E).
11. שינוי מטרת 4X להזיז את העובר / הים המוזרק אל הצד התחתון של ירידת ההזרקה. שחרר את העובר על ידי הפעלת לחץ חיובי על microinjector ההחזקה. שמור את העוברים הלא מוזרק בצד העליון ואת אלה מוזרקים בצד התחתון של הירידה כדי לסייע במעקב אחר של עוברים המוזרקים / הלא מוזרק ולעבוד ביעילות.

5. שחזור העובר תוצאות הזרקה

1. הפוך 3 טיפות של כ 200 μl בצלחת חדשה עם טרום חימם SOF-HEPES. אסוף את העוברים מוזרק באמצעות microdispenser (כמתואר לעיל). לשטוף את העוברים מוזרק על ידי העברתם דרך 3 SOF-HEPES טיפות.
2. לספור את העוברים lysed במהלך microinjection וזורקים אותן.
   הערה: זיגוטה lysed ניתן להבחין בקלות מתוך אחד שלם מאז הראשון מופיע שקוף, מלא את כל ZP, וזה בדרך כלל יש cytoplasmicתוכן דולף החוצה של העובר.
3. לחלופין, סמן את יעילות microinjection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עליך להיות מודע לכך חשיפה לאור UV יכול לגרום נזק לעובר שיכולים להשפיע על התפתחות שלאחר מכן.
4. קבוצות התרבות של 25 עוברים מוזרק 50 טיפות μl של המדיום אופטימיזציה סימפלקס אשלגן (KSOM) השלימו עם 4 מ"ג / אלבומין בסרום שור מ"ל (BSA) תחת שמן מינרלי על 38.5 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באוויר, והלחות לרוויה.
5. להשלים את תרבות התקשורת עם 5% FBS יומיים לאחר ההזרקה.
6. בדוק הבלסטוציסט (BL) מחירים 7 ימים לאחר ההזרקה. חישוב שיעורי BL כמו מספר כולל של עוברי הבלסטוציסט / מספר כולל של עוברים בתרבית הטיפה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ליזר בסיוע microinjection cytoplasmic הוא פרוטוקול חזק ואמין כדי לספק פתרונות לתוך הציטופלסמה של zygotes בעלי החיים. איור 3 מראה בקווים כלליים את zygotes לפני ואחרי ההזרקה כמו גם את קווי המתאר הכלליים של הטכניקה. Dextran-אדום משמש הזרקת פתרון ולאפשר לאתר מעקב של י...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Microinjection של zygotes הוא שיטה מבוססת היטב מציגים פתרונות לעוברי יונקים. עם כמה וריאציות תלויות המין ואת מטרת הניסוי, טכניקה זו יכולה להיות בשימוש נרחב. אנו מראים כיצד לבצע microinjection intracytoplasmic באמצעות לייזר כדי לסייע בכניסה של micropipette בוטה לקצה. Zygotes של כמה מיני בעלי חיים (כמו ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Inverted microscope	Nikon	TE2000-U	Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
100 x 15 mm culture dish	Falcon	351029	Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.
35 mm culture dish	Corning	430165	These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800	Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage	Minitube	12055/0003	Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil	sigma	M8410	Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes			Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl	Sigma	S5886	Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate	Sigma	L4263	Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate	Sigma	P4562	Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin	Sigma	G-1397	Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer	Sigma	W1503	Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Made in the lab		pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.