וריד ביון דגם: מודל מתאים ללמוד patency מעקף

Summary

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Abstract

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Introduction

מחלת לב כלילית והסיבוכים שלהם הם בין הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם. אסטרטגיות טיפוליות נוכחי להתמקד לבסס מחדש את זרימת הדם, בין אם על ידי מתרחבים כלי הצטמצמו או על ידי יצירת מעקף. השתלת מעקפים (CABG) באמצעות autografts וריד תוארה לראשונה בשנת 1968 שוכללה במרוצת השנים. מלבד וסקולריזציה של הקדמי השמאלי היורד לב כלילית, תעלות וריד saphenous הם נפוצות ביותר ^1. עם זאת, patency השתל נותר העקב אכילס של שתלי וריד saphenous (SVG). שנה לאחר הניתוח, patency השתל הוא 85%, יורד ל -61% לאחר עשר שנים ^2,3. חשיפת המנגנונים והגורמים pathophysiological של אובדן patency SVG לכן משימה חשובה.

וידאו זה מדגים מודל ביון וריד עכברוש לחקור אובדן שתל הווריד. מטרות העל של שיטה זו הן לחקור את pathobiological שבבסיסותהליכי -physiological במהלך התקדמות מחלה ואת לפתח מודל מתאים תרופה או בדיקת אופציה טיפולית. על ידי השתלת הווריד ברום הבטן השטחית לתוך מערכת העורקים, מודל זה יחקה את ההגדרה הקלינית של השתלת מעקפים. טראומה ניתוחית, איסכמיה, ומתח קיר הם גורמים חשובים של שינויים בכלי דם הפתולוגיים מחקות במודל המתואר.

דגמים ומינים שונים זמינים לחקור אובדן patency וריד שתל. במודלים של בעלי חיים גדולים, כגון חזירים ^4, כבשים ^5, כלבים ^6, וקופי ^7, להידמות כלי אנושי מבנים אנטומיים ובכך לאפשר אסטרטגיות טיפוליות מורכבות, כגון סטנט מעקפים או טכניקות ניתוחיות חדשות, להיבדק ^8. עם זאת, דיור מיוחד, ציוד, וצוות נדרש. בנוסף, מחיר גבוה והן בשל צורך מרדים נוסף במהלך הניתוח לעכב היישום הרחב יותר שלהם. Smהחיות כל, כוללים חולדות, קלות לטפל, אינו דורש דיור מיוחד, ויש להם עלויות לניהול. לעומת דגמי עכבר ^9,10, במודלים של עכברים יש את היתרון של אפשרות לשוב ולבצע טוב יותר ולכן השתנות פחות בתוצאה. חולדות הן מבחינה פיזיולוגית וגנטית יותר דומים לבני אדם מאשר עכברים ^11,12. בנוסף, עכברי-בר ביותר רק לפתח myointima המוגבל ^13, ההופך במודלים של עכברים נוטים שגיאות מסוג ב'. היסטולוגיה של ורידי העכבר העיקריים, כגון נחות הווריד הנבוב, מורכב רק של כמה שכבות תא הופכת ¹³ קשה הערכה המוקדמת. חסרון נוסף הוא הכמות הקטנה של רקמה זמינה לניתוח שלאחר מכן לאחר החלמת שתל.

המודל המתואר בסרט הזה ניתן לשחזור, זול, וקל לביצוע, והוא ניתן להקים במהירות ובאופן אמין. זה מתאים במיוחד בהערכת סוכנים טיפוליים ניסיוני יקרים, כגון וקטורים ויראלייםעבור ריפוי גנטי, באופן חסכוני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

בעלי החיים קבלו טיפול הומאני באמות מורה העקרונות בחיות מעבדה, שהוכן על ידי מכון משאבים בחיות מעבדה ופורסם על ידי ה- National Institutes of Health. כל הפרוטוקולים החיים אושרו על ידי הרשות המקומית האחראית ( "für Amt Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (משרד בריאות הגנת הצרכן) המבורג").

1. טיפול בבעלי חיים

1. השג חולדות לואיס (Lew / CRL) חולדות וחולדות מהונדסות ROSA / בלוציפראז- Lew במשקל 300-350 גרם מהמכון בחיות מעבדה.
2. שמור על החולדות בתנאים קונבנציונליים בארונות מאווררים ולהאכיל אותם צ'או עכברוש סטנדרטי כרצונך מי autoclaved.
3. בצע השתלת שתל באמצעות החולדות המהונדסות ROSA / Lew-בלוציפראז תורמי חולדות Lew / CRL syngenic כמו הנמענים.

2. הכנת העכברוש התורם

1. השתמש ולהכשרהתא יון לטשטש עכברוש עם isoflurane (2.5-3%).
2. מניחים את החולדה על הגב שלה ולשמור על הרדמה עם facemask כיסוי הפה והאף. בדוק עומק מספיק של הרדמה על ידי צובט את הרגליים האחוריות ואימות בהעדר רפלקסים. החל משח וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
3. מורחים את הרגליים האחוריות ולתקן את עמדתם באמצעות קלטת.
4. לגלח את השיער מפשעתי עם גוזם שיער ולחטא את האזור כולו באמצעות יוד povidone ואחריו 80% אתנול. חזור על שלב החיטוי פעמים.
   הערה: אזור הניתוח, גזה, ומכשירי ניתוח צריכה להיות מעוקרות. יש לשמור על שדה סטרילי לאורך כל ההליך וללבוש-ליחד, כפפות כירורגי סטרילי, מסכות, וכובעים.
5. תחת מיקרוסקופ, לבצע חתך אנכי לאורך inguinalis המנחה. השתמש בשני מלקחיים כדי להפריד את הרקמות התת עורית בעדינות ולחשוף את הווריד ברום הבטן השטחי מן האורים שלוג'ין על וריד הירך. בזהירות לבודד את הווריד ברום הבטן השטחי מן הרקמות הסובבות.
6. תפסיק את זרימת דם בווריד ברום הבטן השטחי באמצעות שני מלחציים מיקרו.
7. קציר פלח 0.5 עד 1 ס"מ כ הווריד ידי הרמת וריד מבודד בזהירות עם מלקחיים חיתוך דרך כלי עם microscissors. השאירו את מהדק מיקרו על גדם כלי כדי למנוע אובדן דם. מניחים את פיסת הסיר של וריד על גזה סטרילי. בזהירות במקום מחט 30 G בתוך קצה אחד של הווריד שנקטף ולשטוף את הכלי עם הפרין (50 יחידות / מיליליטר).
   הערה: ידית הווריד בזהירות ולהימנע נזק במהלך הרמת, חיתוך, ו הסמקה. הקפד לשטוף את השתל עם הכמות הנכונה של הפרין.
8. שמור במגזר כלי ב לידוקאין 1% על הקרח עד להשתלה לתוך עכברוש הנמען למנוע התכווצות כלי.
9. להרדים את העכברוש התורם על ידי הגדלת ההרדמה עד 5% isoflurane. לאחר 2-3 דקות, open הבטן לאורך alba Linea, לחתוך דרך הסרעפת, ולהסיר את הלב לעצור את זרימת הדם.

3. הכנת עכברוש הנמען

1. להרדים ולתקן החולדה הנמען באותה צורה כמו עכברוש התורם.
2. לגלח את הצד המדיאלי של הרגליים עם גוזם שיער ולחטא שלוש פעמים באמצעות יוד povidone ו -80% אתנול.
3. צג את עומק ההרדמה ולהבטיח שזה מספיק ידי אימות בהעדר רפלקסים כאשר צובט את הרגליים האחוריות.
4. בצע חתך הירך החציוני מהברך אל חיק מפשעתי. תחת מיקרוסקופ, השתמש 2 מלקחיים כדי להפריד את עורק הירך מסביבתה.
5. השתמש מלחציים מיקרו לעצור את זרימת הדם. מניחים את מהדק הפרוקסימלית הראשון, ואחריו מהדק דיסטלי.
6. לגזור קטע קצר של עורק הירך הדק עם microscissors וזורק אותו. לקצר את גדם עורקי נותרים עם microscissors, יצירת פער זה1-2 מ"מ גדול יותר שתל הווריד. שטוף את הגדם עורקי עם הפרין באמצעות מחט 30 G.
   הערה: אם adventitia שבולט מעט מעבר גדם הכלי, להשתמש במלקחיים כדי למשוך אותו מעט מעל הקצה של הכלי ולהסיר חלק.
7. מניח את הווריד שנקטף מן הצעד 2.8 בין גדמי העורקים ולהתאים את האורך כך שהוא נכנס כראוי לתוך הפער. הערה לכיוון הווריד.
8. בצע השקת הפרוקסימלי הראשון באמצעות תפר 10-0 prolene. לנהל תפרים יחידים לפי הסדר המוצג (1D איור). התחל עם תפר בכל צד לרוחב לפני הוספת שלושה תפרים יותר בצד הגחון. לאחר מכן, למקם שלושה תפרים בצד הגבי של הכלי להשלמת ההשקה.
9. חבר את כלי דיסטלי עם שתל תוך שימוש באותה טכניקה כמו השקה הפרוקסימלי כמתואר בשלב 3.8. שוב, להתחיל עם תפר בכל צד לרוחב, ולאחר מכן למקם שלושה תפרים על sid הגחוןדואר ואת הצד הגבה.
10. טען שני מזרקים 1 מ"ל עם רכיב דבק הפיברין 1 ו -2 הרם בזהירות את השתל עם מלקחיים ושחרר כ 100 μl של רכיב דבק הפיברין 1 תחת השתל, ואחריו רכיב 2.
    הערה: ודא כי רכיבים 1 ו -2 מיושמים ביחס של 1: 1.
11. מניחים את השתל ן למקומו ושחרר 100 μl נוסף של רכיבים 1 ו -2 על גבי השתל. הקפד כי הדבק מכסה גם את השתל ואת השקה כדי למנוע אי ספיקה anastomotic ושוב-התנפחות של השתל הווריד.
12. בזהירות לפתוח את מהדק דיסטלי, ואחריו הפרוקסימלי.
13. אשר ניתוח מוצלח על ידי בדיקת דופק גלוי בווריד המושתל ועורקים הדיסטלי של השתל.
14. הסר דבק מופרז, אשר מעכבת סגירת עור. שימוש במלקחיים כדי להרים את הדבק לרפא ולהסיר את העודפים עם microscissors. סגור את שכבות העור עם 5-0 תפרים prolene.
15. להזריק 4-5 מ 'g / ק"ג Carprofen תת עורי לפני המאפשר החולדה להתעורר. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. שמור את החיה בכלוב אחד עד שהוא התאושש לחלוטין.
16. להוסיף דיפירון למי השתייה (50 מ"ג דיפירון ל -100 מ"ל) כמו משככי כאבים במשך 3 הימים הבאים ולפקח החיה יומי.

4. דופלקס sonography

הערה: sonography השתמש duxplex לדמיין את זרימת הדם הלא פולשני בחולדות ^14.

1. לטשטש חולדה בתא אינדוקציה (2% isoflurane). מניחים את החולדה על הגב שלה ולשמור הרדמה עם facemask המכסה את האף.
2. השתמש קוצץ שיער הסרת שיער קרם להסרת שיער סביב האזור של הירך.
3. החל ג'ל אולטרסאונד לירך. ודא שאין בועות אוויר. לרכוש תמונות sonography דופלקס באמצעות מתמר 400 MS (התדר המרכזי: 30 Mרץ) עם קצב פריימים של 230-400 מסגרות / sec.

5. Histopathology

הערה: קציר להכתים את הכלי עם trichrome המכתים של מסון לניתוח morphometric ^15.

1. תקן את כלי שנקטפו 4% paraformaldehyde לילה ליבש אותו ריכוז גדל והולך של אתנול. שבץ מדגם פרפין ופצע אותו לתוך 5 מיקרומטר פרוסות עבות באמצעות microtome.
   הערה: Paraformaldehyde רעיל צריך להיות מטופלים עם טיפול מיוחד.
2. Deparaffinize השקופיות לפני השארתם trichrome פתרון מכתים. מייבשים את השקופיות מוכתמים, לנקות אותם עם קסילן, ולעגן אותם הרכבה בינונית. לאחר ייבוש שקופיות, להציג את הדוגמאות עם מיקרוסקופ.

6. הדמיה פליטת אור (BLI)

הערה: שתל לאחר הניתוח הייתה במעקב לאורך זמן in vivo על ידי מדידת אות bioluminescent ¹6.

1. ממיסים 1 גרם של מלח אשלגן D-Luciferin ב 22 מ"ל של PBS ו להזריק אותו intraperitoneally לתוך חולדה (375 מ"ג / ק"ג משקל גוף). חכה 15 דקות עבור luciferin להסתובב החיה.
2. מניח את החולדה לתוך מערכת כימות bioluminescent בזמן אמת ולגשת אות פליטת האור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

המודל ביון עכברוש וריד מתאים ללמוד את הפיתוח של היפרפלזיה myointima ו לכישלון השתל הווריד. בעלי חיים לשחזר היטב מהניתוח ולהראות אחרי הניתוח בכושר גופני מצוין. איור 1 מציג את השלבים כירורגית המפתח. לאחר החתך בעור לאורך Linea inguinalis, וריד שטחי ברום הבטן ואת עורק הירך מ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

וידאו זה מדגים מודל ביון וריד עכברוש לחקור אובדן שתל וריד כדי לאפשר חקירה של תהליכים פתולוגיים הבסיס לבין בדיקות של תרופות חדשות או אופציות טיפוליות.

הרדמה היא היבט חיוני של הליכים כירורגיים. מערכת ההרדמה inhalative רציפה מומלצת, שכן ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment