JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול לסינתזה של guanidines-modified אלקיל מבוסס על השימוש המבשר המתאימים הוצג.

Abstract

קבוצת guanidine היא אחת קבוצות pharmacophoric החשובות ביותר כימיה רפואית. חומצת האמינו רק נושאת קבוצת guanidine הוא ארגינין. במאמר זה, שיטה קלה השינוי של קבוצת guanidine ב הליגנדים peptidic מסופקת, עם דוגמא של הליגנדים integrin מחייב RGD. זה הודגם לאחרונה כי השינוי המובהק של קבוצת guanidine ב הליגנדים אלה מאפשר אפנון סלקטיבית של תת (למשל, בין תתי הסוגים αv ו α5). יתר על כן, אסטרטגיה ידועה בעבר עבור functionalization דרך קבוצת guanidine הודגמה, ואת הגישה הסינטתית נסקרה במסמך זה. השינויים המתוארים כאן לערב סופני (ω N) קבוצות guanidine alkylated ו acetylated. לסינתזה, מולקולות מבשרות תפורים מסונתזות, אשר לאחר מכן חשופים תגובה עם אמין deprotected orthogonally להעביר את הקדםקבוצת guanidine -modified. לסינתזה של guanidines alkylated, מבשרי מבוסס על N, H -pyrazole-1-carboxamidine -DI-בוק-1 'N משמשים לסנתז תרכובות acylated, מבשר הבחירה להיות נגזרת acylated בהתאמה של N -Boc- S - methylisothiourea, אשר ניתן להשיג ב תגובות אחד ושני צעד.

Introduction

בין קבוצות pharmacophoric בשכיחותו הליגנדים טבעיים היא קבוצת guanidine, אשר מעורבים באינטראקציות מרובות 1, 2. לדוגמא, היא משמשת תורם מממן פי ארבעה פוטנציאל באינטראקציות אג"ח מימן מעורב אינטראקציות אלקטרוסטטיות, כגון גשרי מלח או אינטראקציות π קטיון. בשנת כימיה רפואית, בקבוצה זו נמצאת לעתים קרובות סמים לתרופות 4, למרות שפעמים רבות מאוד כמו mimetics guanidine 5, 6. הסיבה לפיתוח mimetics guanidine היא הסרה של הקבוצה guanidine בכל מקום, בעלי מטען חשמלי חיובי, כמו גם את ההתאמה של lipophilicity של ליגנד. בשנת הליגנדים peptidic, חומצת אמינו הקבוצה המכילה guanidine היחידה היא ארגינין, אשר על כן מופיעה בדרך כלל באזור ביו של הליגנדים peptidic.

יחסי ציבור מאודלדוגמה ominent עבור משפחה ליגנד-המכיל ארגינין היא תת-המשפחה של integrins מחייב RGD. באופן כללי, integrins הם מחלקה של קולטנים הידבקות התא, אשר להשתלט הפונקציות החשובות בכל אורגניזמים גבוה. חלק מהפעולות הללו כרוכים הידבקות התא, הגירה, והישרדות התא. לפיכך, הם מעורבים גם באינדיקציות פתולוגיים, כגון סרטן סיסטיק. Integrins הם חלבונים heterodimeric transmembrane המורכבת α- ו β-למקטע היוצרות 24 תת integrin ידוע כיום; 8 מהם מכירים את רצף tripeptide Arg-גלאי-ASP (= RGD) ב הליגנדים שלהם 7. האזור מחייב ממוקם במפגש בין שני תתי סוגים אלה בחלק התאי, קבוצת ראש integrin שנקראה 8. RGD מוכרת על ידי שתי אינטראקציות נפוצות: באזור מתכת-יון-תלות באתר הדבקה (מידאס), הנמצא למקטע בטא ואשר נקשר החומצה קרבוקסילית של הליגנדים (Cha לוואיב של ASP); וקבוצת guanidine של הליגנדים, הנמצאת למקטע אלפא. רוב תת integrin הם מופקרים ולשתף לפחות חלק מטריקס הטבעי שלהם (ECM) הליגנדים 9. לפיכך, לפיתוח הליגנדים integrin מלאכותיים, המוקד העיקרי הוא, מלבד זיקה מחייבת גבוהה, את הסלקטיביות תת. לאחרונה, הצלחנו לחשוף מרכיב מפתח עבור הדור של הליגנדים-סלקטיבית תת: קבוצת guanidine. באמצעות שינויים ברורים, הליגנדים biselective עבור αv- ו α5 המכילים תת integrin ניתן להפוך תרכובות סלקטיבית על ידי שינויים פשוטים על הקבוצה guanidine, אשר לאחר מכן ניתן להפלות את 10 α-יחידות משנה שונות.

בכיס αv, קבוצת guanidine אינטראקצית צד-על באמצעות גשר מלח bidentate עם Asp218 11, 12. ג אינטראקציה זולהיות גם ציין α5β1 (כאן, עם Asp227 ב α5), אך בנוסף, קץ-על האינטראקציה של הקבוצה guanidine עם שאריות GLN (Gln221) הוא ציין שיש 13. לפיכך, שינינו את קבוצת guanidine בשני אופנים מנוגדים: במקרה אחד, על ידי חסימת הצד-על אינטראקציה עם מתילציה של δ N של קבוצת guanidine, ובמקרה השני, עם מתילציה של ω N guanidine, חסימת האינטראקציה סוף-על. באופן מפתיע, שינוי קטן זה הוביל לשינוי סלקטיביות מוחלט של הליגנדים. בנוסף אלקילציה, שיטת functionalization חדשה הוצגה בפרסום זה. שיטת functionalization הקלסית לסוג זה של ליגנד pentapeptidic היא דרך נטיית שרשרת הצד של חומצת אמינו לא מעורבת מחייב (למשל, K ב ג (RGDfK)) 14, 15. כאן,אנו מראים כי functionalization הוא גם אפשרי על ידי שינוי guanidine - שהוא חיוני עבור מחייב - עם acyl או מקשר alkylated. המטען החיובי כי הוא חיוני מחייב נשמר, ומודלים מראים כי נקודות השרשרת הארוכות מכייס המחייב, ובכך מתן אפשרות אידיאלית עבור הקובץ המצורף של linkers נוסף תיוג יחידות (למשל, תווית פלורסנט או chelator עבור מולקולרי הַדמָיָה).

בעבודה זו, אנו מתרכזים בצעדי ההכנה עבור השינוי של קבוצת guanidine ב הליגנדים המכיל ארגינין. זה כרוך הסינתזה של מיני -methylated ω N, כמו גם guanidines עם יחידות ומקשרות יותר. השינויים השונים מהווים קבוצות acyl ו אלקיל.

Protocol

הערה: כל ריאגנטים הממסים התקבלו מהספקים מסחריים ששמשו ללא טיהור נוספת.

זהירות: יש להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. אנא להשתמש בכל ציוד הבטיחות המתאים בעת ביצוע סינתזות כימיות (למשל, במנדף, משקפי בטיחות, כפפות, חלוק מעבדה, מכנסיים באורך מלא, ונעליים סגורות).

1. סינתזה של מבשרי Guanidinylation

  1. מיני alkylated
    1. מינים מפוגל
      1. ממיסים 1.0 גרם של N, N '-DI-בוק-1 H -pyrazole-1-carboxamidine (3.2 מילימול, 1 EQ.) ו 1.0 גרם של triphenylphosphine (PPH 3, 3.8 מילימול, 1.2 EQ.) ב 10 מ"ל של יבשה tetrahydrofuran (THF) בבקבוק 50 מ"ל מסביב לתחתית באווירה אינרטי באמצעות מחצה גומי בטמפרטורת החדר (RT). הוספת 194 μL של מתנול יבש באמצעות מזרק (4.8 מילימול, 1.5 EQ.) ואניet אותו ומערבבים ב RT.
      2. בנפרד, להכין פתרון עם 747 μL של diisopropyl azodicarboxylate (DIAD, 3.8 מילימול, 1.2 EQ.) ב 2 מ"ל של THF יבש בקבוקון זכוכית קטן. תוך ערבוב, מוסיפים את הפתרון של DIAD ב THF dropwise לפתרון של N, -DI-בוק-1 'N H -pyrazole-1-carboxamidine, 3 PPH, מתנול באמצעות מזרק (מעל 15 דקות). תנו ומערבבים פתרון עבור 2 שעות ב RT.
      3. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ו לפזר את המוצר הגולמי ב 1 מיליליטר של dichloromethane (DCM). טען בטור פלאש (2.5 ס"מ X 20 ס"מ) עם 100 גרם של הסיליקה אתיל אצטט 10% (EtOAc) בתמיסה פנטן. טען את המוצר הגולמי מומס על העמודה ולהוסיף את הממס בלחץ (1.5 בר).
      4. אסוף את השברים (מערכת ממס: isocratic 10% EtOAc ב פנטן), לזהות את המקום למתחם הרצוי על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC), ולאסוף אותו (ו R = 0.4, EtOAc / פנטן 1: 9, UV). מערבבים את הרצוישברים להתאדות הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי להשיג 0.85 גרם של מתחם הכותרת כמו שמן צהוב, דביק (2.6 מילימול, 81% תשואה). אחסן את מתחם הניב ב RT לשימוש נוסף.
    2. מיני Hexylamine-modified
      1. ממיסים 1.0 גרם של N, H -pyrazole-1-carboxamidine -DI-BOC-1 'N (3.2 מילימול, 1.0 EQ.), 0.9 גרם של DDE-6-aminohexanol (3.8 מילימול, 1.2 EQ.), ו 1.0 גרם 3 של PPH (3.8 מילימול, 1.2 EQ.) ב 10 מ"ל של THF יבש בבקבוק 50 מ"ל מסביב לתחתית באווירה אינרטי באמצעות מחצה גומי ב RT.
      2. בנפרד, להכין פתרון עם 747 μL של DIAD (3.8 מילימול, 1.2 EQ.) ב 2 מ"ל של THF יבש בקבוקון זכוכית קטן. תוך ערבוב, מוסיפים את הפתרון של DIAD ב THF dropwise לפתרון של N, H -pyrazole-1-carboxamidine -DI-בוק-1 'N, 3 PPH, ו DDE-6-aminohexanol באמצעות מזרק (מעל 15 דקות) . תנו ומערבבים פתרון עבור 2 שעות ב RT.
      3. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ולקחת את מעלה המוצר הגולמי ב 1 מיליליטר של DCM. טען בטור פלאש (2.5 ס"מ X 20 ס"מ) עם 100 גרם של סיליקה בתמיסה של פנטן / EtOAc (2: 1). החל את המוצר הגולמי מומס על העמודה ולהוסיף הממס בלחץ (1.5 בר).
      4. אסוף את השברים (מערכת ממס: isocratic 2: 1 פנטן / EtOAc), לזהות את השברים הרצוי עם TLC, ולאסוף אותם (R f = 0.66, 2: 1 פנטן / EtOAc, UV). מערבב את השברים הרצויים להתאדות הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי לקבל 1.6 גרם של מתחם הכותרת כמו שמן צהוב, דביק (2.8 מילימול, 88% תשואה). אחסן את מתחם הניב ב RT לשימוש נוסף.
  2. מיני Acylated (2 צעדי תגובה)
    1. ממיסים 1.4 גרם של hemisulfate S -methylisothiuronium (10 מילימול, 1.0 EQ.) ו 2.2 גרם של di (-butyl טרט) dicarbonate (10 מילימול, 1.0 EQ.) בתוך במרץ ומערבביםלצלצל פתרון בי-פאזית DCM / ישב. AQ. NaHCO 3 ולתת לו ומערבבים במשך 24 שעות ב RT.
    2. הפרד את השכבות בתוך משפך separatory ולחלץ השלב מהימי שלוש פעמים עם DCM. מערבב את השלבים האורגניים, לייבש אותם עם Na 2 SO 4, ולהסיר את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי. קח את את המוצר הגולמי ב 1 מ"ל של הקסאן.
    3. טען בטור פלאש (2.5 ס"מ X 20 ס"מ) עם 100 גרם של סיליקה בתמיסה של 4: 1 הקסאן / EtOAc. טען את המוצר הגולמי מומס על הטור. הוספת ממס בלחץ. זהה את השברים הרצוי עם TLC (מערכת ממס: 4: 1 הקסאן isocratic / EtOAc (UV זיהוי: 254 ננומטר), ולאסוף אותם (ו R = 0.30).
    4. מערבב את השברים הרצויים להתאדות הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי לקבל 1.1 גרם של מתחם הכותרת כמו שמן צהוב, דביק (5.8 מילימול, 58% תשואה). אחסן את ריאגנט, N - (טרט -butoxycarbonyl) - S -methylisothiourea, ב RT לשימוש נוסף.
    5. ממיסים 250 מ"ג של N - (-butoxycarbonyl טרט) - S -methylisothiourea (1.3 מילימול, 1.0 EQ.) ב 10 מ"ל של יבש N, N -dimethylformamide (DMF) בבקבוק 50 מ"ל מסביב לתחתית באווירה אינרטי ב RT. הוספת 440 μL של N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) (2.6 מילימול, 2 EQ.) באמצעות מזרק. תוך ערבוב, מוסיפים 245 μL של Ac 2 O (5.2 מילימול, 4.0 EQ.) Dropwise באמצעות מזרק ולתת לו ומערבבים במשך 1 שעות ב RT.
    6. הוספת עודף מתנול (2 מ"ל) לתערובת באמצעות מזרק ולתת לו ומערבבים במשך 15 דקות ב RT. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי. קח את את המוצר הגולמי ב 1 מ"ל של DCM.
    7. טען בטור פלאש (2.5 ס"מ X 20 ס"מ) עם 60 גרם של סיליקה בתמיסה של 3: 1 הקסאן / EtOAc 3: 1. החל את המוצר הגולמי מומס לעמודה. הוספת ממס (3: 1 הקסאן / EtOAc) ולחץ (1.5 בר). זהה את השברים הרצויים עם TLC (3: 1 הקסאן / EtOAc, UV: 220 ננומטר), ו colבחר במסע אותם (ו R = 0.62).
    8. מערבב את השברים הרצויים להתאדות הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי לקבל 210 מ"ג של מתחם הכותרת בתור לבן מוצק (0.9 מילימול, 70% תשואה). אחסן את המתחם ב RT לשימוש נוסף.

סינתזת 2. מחזורי פפטיד מבשרים

  1. טוען וסגירת שרף TCP
    1. מוסיפים 1.00 גרם של כלוריד 2-chlortriyl (CTC) שרף (0.9 מילימול / g) ו- 320 מ"ג של Fmoc-גלאי-OH (1.2 EQ.) לתוך מזרק 20 מ"ל פלסטיק עם frit. הכן תמיסה של 313 μL של DIPEA (2 EQ.) ב 5 מ"ל של יבש DCM ולהוסיף אותו המזרק. תן לו לסובב עבור 1 ש 'ב RT באמצעות יחידה סיבובית.
    2. בינתיים, להכין פתרון 2-מיליליטר של 5: 1 מתנול / DIPEA (נ / נ; פתרון מכסה). מוסיף את פתרון המכסה אל המזרק ולתת לו להסתובב במשך 15 דקות אחרות. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ו DMF (3x).
  2. על-שרף Fmoc deprotection
    1. פנק את Fmoc-הגלאים נכנסים שרפו עם 20% piperidine ב DMF עבור 10 דקות ולאחר מכן עבור 5 דקות. לשטוף את שרף עם DMF (3x).
  3. על-שרף צימוד של Fmoc-Orn (DDE) -OH
    1. הוספת 934 מ"ג של Fmoc-L-Orn (DDE) -OH (2 EQ.), 684 מ"ג של 1 [BIS (dimethylamino) מתילן] -1 H -1,2,3-triazolo [4,5-b] פירידיניום hexafluorophosphate 3-oxid (HATU) (2 EQ.), ו 245 מ"ג של 1-הידרוקסי-7-azabenzotriazole (HOAt) (2 EQ.) בקבוקון זכוכית קטן לפזר אותו 5 מ"ל של DMF. הוספת 814 μL של DIPEA.
    2. הוספת פתרון זה Fmoc-deprotected, התרחצתי, שרף הנכנס גלאי ולתת לו לסובב עבור 1 h. לשטוף את שרף עם DMF (3x).
  4. על-שרף Fmoc deprotection
    1. פנקו את Fmoc-Orn הנכנס שרף (DDE) -Gly עם 20% piperidine ב DMF עבור 10 דקות ולאחר מכן עבור 5 דקות. לשטוף את שרף עם DMF (3x).
  5. על-שרף צימוד של Fmoc-Val-OH
    1. הוספת 610 מ"ג של Fmoc-Val-OH (2 EQ.), 684 מ"ג של HATU (2 EQ.), ו 245 מ"ג של HOAt (2 EQ.) בקבוקון זכוכית קטן לפזר אותו 5 מ"ל של DMF. הוספת 814 μL של DIPEA.
    2. הוספת פתרון זה Fmoc-deprotected, התרחצתי, Orn הנכנס שרף (DDE) -Gly ולתת לו לסובב עבור 1 h.
  6. על-שרף Fmoc deprotection
    1. פנקו את שרף הנכנס Fmoc-Val-Orn (DDE) -Gly עם 20% piperidine ב DMF עבור 10 דקות ולאחר מכן עבור 5 דקות. לשטוף את שרף עם DMF (3x).
  7. על-שרף מתילציה N-
    1. לשטוף את שרף עם DCM (3x). ממיסים 887 מ"ג של 2-nitrobenzenesulfonylchloride (o -NBS-Cl, 4 EQ.) ב DCM ולהוסיף 1.2 מ"ל של 2,4,6-collidine (10 EQ.).
    2. מוסיפים את פתרון הפפטיד הנכנס שרף ולתת לו דגירה של 20 דקות ב RT.
    3. לשטוף את שרף עם CH 2 Cl 2 (3x) ועם THF (5x). כן פתרון עם 1.18 גרם של 3 PPH (5 EQ.) ו 365 μL של מתנול ב THF. הוספת פתרון זהמַזרֵק.
    4. הכן פתרון עם 883 μL של DIAD ב 2 מ"ל של THF ולהוסיף אותו המזרק. תן לזה דגירה של 15 דק '. לשטוף את שרף עם THF (5x) ועם DMF (5x).
  8. o -Ns deprotection
    1. הכן פתרון עם 570 μL של mercaptoethanol (10.0 EQ.) ו 672 μL של diazabicycloundecen (DBU) ב 2 מ"ל של DMF. הוספת פתרון זה המזרק ולתת לו דגירה של 5 דק '.
    2. חזור על שלב deprotection ולאחר מכן לשטוף את השרף עם DMF (5x).
  9. על-שרף צימוד של Fmoc- ד-Phe-OH
    1. הוספת 697 מ"ג של Fmoc-D-Phe-OH (2 EQ.), 684 מ"ג של HATU (2 EQ.), ו 245 מ"ג של HOAt (2 EQ.) בקבוקון זכוכית קטן לפזר אותו 5 מ"ל של DMF . הוספת 814 μL של DIPEA.
    2. הוספת פתרון זה Fmoc-deprotected, התרחצתי, פפטיד הנכנס שרף ולתת לו לסובב עבור 1 h.
  10. על-שרף Fmoc deprotection
    1. פנקו את b שרףound הפפטיד עם 20% piperidine ב DMF עבור 10 דקות ולאחר מכן עבור 5 דקות. לשטוף את שרף עם DMF (3x).
  11. על-שרף צימוד של Fmoc-ASP (אות Bu) -OH
    1. הוספת 741 מ"ג של Fmoc- ASP (אות Bu) -OH (2 EQ.), 684 מ"ג של HATU (2 EQ.), ו 245 מ"ג של HOAt (2 EQ.) בקבוקון זכוכית קטן לפזר אותו 5 מ"ל של DMF. הוספת 814 μL של DIPEA.
    2. הוספת פתרון זה Fmoc-deprotected, התרחצתי, פפטיד הנכנס שרף ולתת לו לסובב עבור 1 h.
  12. מחשוף של הפפטיד ליניארי מן השרף
    1. לשטוף את שרף עם DCM (3x) ובהמשך להכין 10 מ"ל של תמיסה של hexafluoroisopropanol (HFIP) ב DCM (1: 4; נ / V).
    2. מוסיפים את פתרון שרף ולתת לו להסתובב במשך 15 דקות. אסוף הפתרון בבקבוק מסביב לתחתית. חזור על מחשוף להתאדות הממסה באמצעות מאייד סיבובי.
  13. Cyclization של הפפטיד ליניארי
    1. dissolve 384 מ"ג של NaHCO 3 (5.0 EQ.) ו 582 μL של אזיד diphenylphosphoryl (DPPA) (3.0 EQ.) ב 50 מ"ל של DMF ולהוסיף אותו המוצר הגולמי. תן לזה ומערבבים לילה או עד שלא פפטיד ליניארי הוא ציין עם ESI-MS (10 ח) 17.
    2. בלחץ מופחת, להפחית את הממס לנפח קטן באמצעות מאייד סיבובי. הכן תמיסה מימית רוויה של NaCl (מלח). בעזרת פיפטה פסטר, להוסיף את dropwise פפטיד cyclized כדי 40 מ"ל של תמיסה מימית רוויה של NaCl ב צינור צנטריפוגות.
    3. צנטריפוגה ההשעיה (5000 XG, 5 דק ') ולשטוף את המשקע עם מי HPLC כיתה (2x). Lyophilize המוצר.

3. Guanidinylation ו Deprotection ב Solution

  1. Guanidinylation עם המבשרים התפורים
    1. ממסי כמות קטנה (למשל, 25 מ"ג) של הפפטיד המחזורית deprotected orthogonally בנפח קטן של DMF (למשל, 2 מ 'L). להוסיף 2 EQ. של מבשר guanidinylation ו 2 EQ. של DIPEA לפתרון ולתת לו ומערבבים במשך 2 שעות ב RT.
    2. מעקב אחר ההתקדמות של התגובה עם HPLC-MS. לאחר התגובה הושלמה, להסיר את הממס, מחדש לפרק את הפפטיד מחזורית guanidinylated ב acetonitrile, ולבצע טיהור HPLC semipreparative 16.
  2. הסרת קבוצות להגנת שרשרת צד רָפִיף חומצה
    1. הכן 2 מ"ל של תמיסה המכילה חומצה trifluoroacetic (TFA), מים, ו triisopropylsilane (TIPS) (95 / 2.5 / 2.5; נ / V / V). הוספת פתרון זה על המוצר המטוהר בקבוקון זכוכית קטן ולתת לו לעורר ב RT לפחות h 1. שימו לב deprotection להשלים עם ESI-MS 17.
    2. לאדות את הממס בלחץ מופחת נפח קטן. הכן אתר קר כקרח ולהוסיף 10 מ"ל ב צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. לזרז את הפפטיד deprotected ב אתר קרים כקרח בעזרת פיפטה פסטר ידי הוספתוdropwise. צנטריפוגה ההשעיה (5000 XG, 5 דק ') כדי להשיג גלולה.
    3. שטפו את המשקע עם אתר קר כקרח צנטריפוגות זה (5000 XG, 5 דקות, 2x). ממיסים את המוצר ב 2 מ"ל מים HPLC כיתה ולטהר אותו עם semipreparative HPLC 16.

4. נתונים אנליטיים ופרמטרים לטיהור

  1. אנליטית HPLC-ESI-MS
    1. בצע HPLC-ESI-MS אנליטי עם ספקטרומטר מסת LCQ באמצעות טור C18 (גודל נקבובי 12 ננומטר, גודל חלקיקים 3-מיקרומטר, 125 מ"מ × 2.1 מ"מ) או עמודת C8 (גודל נקבובי 20 ננומטר, חלקיק-מיקרומטר 5 גודל, 250 מ"מ × 2.1 מ"מ), עם H 2 O (0.1% v / v חומצה פורמית) / אצטוניטריל (0.1% v / v חומצה פורמית) כמו eluents.
  2. HPLC חצי הכנה
    1. בצעו למחצה ההכנה HPLC באמצעות מכשיר HPLC ההכנה עם טור ODS-A (20 x 250 מ"מ, 5 מיקרומטר), קצב זרימה של 8 מ"ל / דקה, והדרגות ליניארישל H 2 O (v 0.1% / v TFA) ו אצטוניטריל (v 0.1% / v TFA).

תוצאות

מבשר פפטיד המחזורי היה מסונתז כמו פפטיד ליניארי, cyclized, ו orthogonally DDE-deprotected. לאחר המשקעים, הטוהר של המתחם נותח עם HPLC-MS (איור 1). כדי לעקוב אחר ההתקדמות של התגובה, ניתוח HPLC בוצע לאחר זמן תגובת 2-h (איור 2).

Discussion

מפלסת הדרך guanidinylation הינה נגזרת פפטיד מחזורית orthogonally deprotected, (ג (OrnD (OT Bu) GF (N Me) V)), אשר מסונתז על ידי פרוטוקול Fmoc רמת סינתזה פפטיד מוצק שלב (SPPS). Ornithin שימש הנגזר מוגן orthogonally, (Fmoc-Orn (DDE) -OH), אשר ניתן deprotected עם הידרזין ב DMF לאחר cyclization של הפיגום פפטיד. מבשר פפטיד מטוה...

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgements

TGK מודה והמדרשה הבינלאומית למדע והנדסה (IGGSE) של מינכן Technische Universität עבור התמיכה הכספית שלהם. HK מודה המרכז חלבון משולב המדע במינכן (CIPSM) על תמיכתם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
N,N′-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98% Sigma Aldrich434167 ALDRICH
Triphenylphosphine, 99%Sigma AldrichT84409 SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5%Carl Roth4745
Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8%Carl Roth5182
Methanol anhydrous, 99.8%Sigma Aldrich322415 SIGMA-ALDRICH
Diisopropyl azodicarboxylate, 98%Sigma Aldrich225541 ALDRICH
Dichlormethan, for synthesis, 99.5%Carl Roth8424
Silica gel for flash chromtaographySigma Aldrich60738 SIGMA-ALDRICH
n-Pentane, 99%Carl Roth8720
n-Hexane, 99%Carl RothCP47
Ethylacetate, 99.5%Carl Roth7338
Aminohexanol, 95%Sigma AldrichA56353 ALDRICH
S-Methylisothiourea hemisulfate, 98%Sigma AldrichM84445 ALDRICH
Di-tert-butyl dicarbonate, 99%Sigma Aldrich205249 ALDRICH
N,N-Dimethylformamid, 99.8%Carl RothA529
N,N-Diisopropylethylamin, 99.5%Carl Roth2474
Acetic anhydrid, 99%Carl Roth4483
Chlortrityl resinCarbolutionCC11006
Fmoc-Gly-OH, 98%CarbolutionCC05014
Piperidin, 99%Sigma Aldrich104094 SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OHIris-BiotechFAA1502
HATU, 99%CarbolutionCC01011
HOAt, 99%CarbolutionCC01004
Fmoc-Val-OHCarbolutionCC05028
2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97%Sigma AldrichN11507 ALDRICH
2,4,6-Collidine, 99%Sigma Aldrich27690 SIGMA-ALDRICH
Mercaptoethanol, 99% Sigma AldrichM6250 ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98%Sigma Aldrich139009 ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98%Sigma Aldrich47378 ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98%CarbolutionCC05008
HexafluoroisopropanolCarbolutionCC03056
Diphenylphosphoryl azide, 97%Sigma Aldrich178756 ALDRICH
TFA, 99.9%Carl RothP088
Triisopropylsilan, 98%Sigma Aldrich233781 ALDRICH
Acetonitrile, HPLC gradeCarl RothHN44

References

  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. . Handbook of HPLC. , (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. . Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122guanidineguanidinylationmitsunobu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved