In vivo חקירת טיפול באור כחול אנטימיקרוביים multidrug עמידים baumannii Acinetobacter צרוב דלקות באמצעות הדמיה פליטת אור

Summary

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Abstract

צרוב זיהומים ממשיכים להיות גורם חשוב לתחלואה ותמותה. הופיע גדלו וההולך של עמידים multidrug (MDR) חיידקים הובילו לכישלון התכוף של טיפולים אנטיביוטיים מסורתיים. תרופות אלטרנטיביות נדרשות בדחיפות כדי להתמודד עם חיידקי MDR.

גישה חדשנית הלא אנטיביוטי, אור כחול מיקרוביאלית (ABL), הוכיח יעילות מבטיחה נגד זיהומים MDR. מנגנון הפעולה של ABL עדיין לא הבין היטב. ההשערה היא כי בדרך כלל טבעי chromophores photosensitizing אנדוגני חיידקים (למשל, פורפירינים חופשי-ברזל, flavins, וכו ') הם נרגשים ABL, אשר בתורו מייצר מינים חמצן תגובתי ציטוטוקסיות (ROS) באמצעות תהליך פוטו.

בניגוד מבוסס אור אחר גישה מיקרוביאלית, טיפול פוטודינמי מיקרוביאלית (aPDT), טיפול ABL אינו מחייב המעורבות של photosensitiz אקסוגנייםאה. כל מה שהיא צריכה להיכנס לתוקף הוא הקרנה של אור כחול; ולכן, זה פשוט וזול. הקולטנים ABL הם הפוטוסנסיטייזרים הסלולר אנדוגני חיידקים, ולא את ה- DNA. לפיכך, הוא האמין ABL להיות הרבה פחות genotoxic לארח תאים מ אולטרה סגול-C (UVC) הקרנה, אשר באופן ישיר גורמת נזק לדנ"א בתאים המארח.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול להעריך את האפקטיביות של הטיפול ABL עבור זיהומים baumannii Acinetobacter MDR במודל של עכברים של פגיעה כוויה. באמצעות זן bioluminescent מהונדס, הצלחנו לעקוב אחר מידת הזיהום פולשנית בזמן אמת בחיות חיים. טכניקה זו היא גם כלי יעיל עבור ניטור הפריסה המרחבית של זיהומים אצל בעלי חיים.

Introduction

זיהומים צרובים, אשר מדווחים לעתים קרובות בגלל פציעות תרמית עורית, ממשיכים להיות גורם חשוב לתחלואה והתמותה ^1. הנהלת זיהומי כוויית נפרץ נוספת על ידי הופעתה הגדלה וההולך של עמידים multidrug (MDR) זני חיידקי ² עקב השימוש המסיבי של אנטיביוטיקה. MDR אחד חשוב גראם שליליים חיידקים הוא baumannii Acinetobacter, אשר ידוע להיות מזוהה עם פצעי הקרב האחרונות והוא עמיד כמעט לכל זמין אנטיביוטיקה ^3. הנוכחות של biofilms במוקדי הפצוע דווחה ^{4, 5,} והוא האמין להחריף את הסובלנות לאנטיביוטיקה ומארח הגנה ^{6, 7,} גרימת זיהומים מתמשכים ^{8, 9.} לכן, קיים pressing צריך לפיתוח טיפולים אלטרנטיביים. באסטרטגיה הלאומית הודיעה לאחרונה למאבק עמידים לאנטיביוטיקה חיידקים, פיתוח תרופות חלופיות לאנטיביוטיקה כבר ציין כפעולה על ידי ממשלת ארצות הברית ^10.

אור מבוסס גישות אנטי-מיקרוביאלית, כפי שמלמדות השם, דורשות הקרנת אור עם או בלי סוכנים אחרים. גישות אלה כוללים טיפול פוטודינמי מיקרוביאלית (aPDT), סגול-C (UVC) הקרנה, ואור כחול מיקרוביאלית (ABL). במחקרים קודמים, הם הראו יעילים מבטיחים הרג זני MDR חיידקי ^{11, 12, 13.} בין גישות אור מבוסס השלוש, ABL משך תשומת לב גוברת בשנים האחרונות עקב תכונות אנטיבקטריאליות הפנימיות שלה ללא שימוש הפוטוסנסיטייזרים ^14. בשנת comparison כדי aPDT, ABL רק כרוך בשימוש באור, בעוד aPDT דורש שילוב של אור פוטוסנסיטייזר. לכן, ABL היא פשוטה וזולה ^14. בהשוואה UVC, ABL הוא האמין להיות הרבה פחות ציטוטוקסיות genotoxic לארח תאים ^15.

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את האפקטיביות של ABL לטיפול בזיהומים הנגרמים על ידי כוויה baumannii א MDR במודל של עכברים. אנו משתמשים חיידקים פתוגניים bioluminescent לפתח מודלים העכבר החדש של זיהומים כוויה המאפשרים ניטור פולשני של הנטל חיידקי בזמן אמת. לעומת השיטה המסורתית של דגימת גוף נוזלת / רקמות ציפוי עתידי מושבה לספור ^16, טכניקה זו מספקת תוצאות מדויקות. תהליך דגימת רקמות יכול להציג מקור נוסף של שגיאה ניסיונית. מאז עוצמת הארת החיידקים היא מידתית באופן ליניארי corresponding חיידקי CFU ^17, אנו יכולים למדוד את ההישרדות של החיידקים ישירות אחרי מנה מסוימת של הקרנת אור. על ידי ניטור ניטל חיידקי חיים וחיות קבלת טיפול האור בזמן אמת, קינטיקה של הרג חיידקים ניתן לאפיין באמצעות מספר מופחת משמעותי של עכברים.

Protocol

1. הכנת תרבית חיידקים

1. להוסיף 7.5 מ"ל של המוח הלב עירוי (BHI) בינוני צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. א זרע תאי baumannii במדיום BHI ואז דגירת תרבות א baumannii באינקובטור מסלולית (37 מעלות צלזיוס) במשך 18 שעות.
2. צנטריפוגה התרבות של תאים ב 3500 × g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant, ולשטוף את הכדורים ב-בופר פוספט (PBS).
3. Re- להשעות את כדורי חיידקי PBS טרי ביסודיות פיפטה ההשעיה.
4. אסוף 100 μL של השעית החיידקים ולבצע דילול 01:10 באמצעות PBS הטרי.
5. מעבירים את דילול קובט 1.5 מ"ל למחצה ומיקרו ולמדוד את צפיפות אופטית (OD) באורך גל של 600 ננומטר (OD _{600 ננומטר).}
6. חשב את _{600 ננומטר} OD של ההשעיה המקורית (לא מהול) ב PBS בהתאם לערך _ננומטר OD ₆₀₀ נמדד של דילול לבין גורם לדילול (10).
7. התאם הדואר ההשעיה המקורית ב PBS OD _{600 ננומטר} = 0.6 (המקביל ל צפיפות התאים של 10 ⁸ CFU / mL).

2. עכבר דגם של Burn זיהום הנגרם על ידי Bioluminescent A. baumannii

1. השתמש מבוגר נקבה BALB / c עכברים בגילאי 7-8 שבועות ומשקלו 17-19 גרם. אפשר העכברים כדי להתאקלם לתנאי מעבדה עבור 3 ימים לפחות לפני תחילת הניסוי. שמרו על העכברים במחזור 12 h בהיר / כהה מתחת לטמפרטורת החדר של 21 ℃ ולתת להם כרצונך מזון ומים.
2. להרדים את העכברים עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל קטמין-xylazine (100 מ"ג / ק"ג - 20 מ"ג / ק"ג). בעדינות לגעת palpebra של כל עכבר עם מקלון צמר גפן; בהעדר של רפלקס palpebral מרמז עומק ההרדמה המתאים. מכסה את עיני עכבר עם משחת וטרינר כדי למנוע את העיניים מפני יובש במהלך הרדמה.
3. לגלח את העכברים על הגב לחשוף עור ככל האפשר באמצעות 50-להב גוזז שיער.
4. מניחים את המכסה של צלחת 35 מ"מ פטרי מתחת הבטן של עכברים כדי לשמור גבם במצב מאוזן יחסית.
5. מרתיחים מים בכוס מ"ל 250 (80% מלא) באמצעות 10" x 10" , 220 חמום VAC. לטבול בלוק פליז (1 ס"מ x 1 ס"מ חתך) לתוך הכוס עד איזון תרמי עם המים הגיעו. איזון תרמי בדרך כלל לוקח <5 דקות והוא מסומן על ידי מחדש רתיחת המים בכוס.
6. לפני יצירת שפצע הכווייה, לנהל משככי כאבים מנע (הזרקה תת עורית של עצירות 0.1mg / kg) לשיכוך כאבים.
7. עשר דקות לאחר משככי הכאבים מנעו, לחץ בעדינות על בלוק פליז מחומם לאזור המגולח בצד האחורי של העכברים עבור 7 ים לגרום פצעי כווייה.
   הערה: כדי למנוע פגיעת תרמית על אנשי העבודה, ללבוש כפפות תרמית עמידה בעת ביצוע הליך השריפה.
8. נהל 0.5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית דרך subcutaneouהזרקת הים כדי למנוע התייבשות.
9. חמש דקות לאחר האינדוקציה של פציעה התרמית, לחסן 50 μL של השעית חיידקים המכילה 5 x 10 ⁶ CFU ב PBS על כוויות העכבר בעזרת פיפטה. מאת נעה מקלון צמר גפן סטרילי בתנועה זיגזג על העור, למרוח את aliquots על כוויות להפיץ תאים חיידקיים באזור נשרפו בצורה שווה ככל האפשר.
10. מייד לאחר חיסון חיידקים, לבצע הדמית פליטת אור עבור הכוויות הנגועות, כמפורט בסעיף 4.
11. מניחים את העכברים על מצע כירורגיים מים מחומם (37 מעלות צלזיוס, אזור התאוששות) עד העכברים החלימו לחלוטין מן ההרדמה. בית העכברים עם מספר מרבי של 5 לכל כלוב בחדר חית בטיחות ביולוגי רמה-2.
12. נהל משככי כאבים (הזרקה תת עורית של עצירות 0.1 מ"ג / ק"ג) פעמיים ביום למשך שלושה הימים הראשונים לאחר הפציעה כוויה.

3. טיפול באור כחול אנטימיקרוביים A. & #160; זיהום baumannii עכברים

1. התחל טיפול ABL ב 24 שעות לאחר חיסון חיידקים.
2. השתמש אור דיודה (LED) עם פליטת שיא 415 ננומטר עבור הקרנת ABL. הר LED על גוף קירור כדי למנוע תופעות תרמית על האזור המוקרן בעכברים ^18. תקן את ביאת מוט תמיכה אופטית עם מחברי קליפ לאפשר LED לנוע מעלה ומטה.
3. הפעל את מד הכוח / אנרגיה ולחץ על כפתור הגל כדי לבחור 415 ננומטר. איפוס מד כוח / אנרגיה כדי להפחית את (אור הסביבה) ברקע.
4. מניח את מד כוח / אנרגיה ממש מתחת LED. תלבש משקפי אור כחול מגן. הפעל את נורית ה- LED ולהתאים את המרחק בין הצמצם LED (עדשה כי מתכנס בין האור ובין LED) ואת חיישן אור (2 ס"מ קוטר) של מד הכוח / אנרגיה כך כתם אור מכסה את כל האזור של חיישן האור.
5. בזהירות לכוון את הנהג LED ולהקליט את הקריאה של power / מד אנרגיה. חשב את והקרינה פי הקריאה: וקרינה = קריאה (W) / שטח (סנטימטר ^2). התאם את והקרינה של LED אל 100 mW / cm2 ידי כוונון נהג LED.
6. כבה את הנורית. מדוד את המרחק בין צמצם LED וחיישן האור של מד כוח / אנרגיה.
7. להרדים את העכברים עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל קטמין-xylazine (100 מ"ג / ק"ג - 20 מ"ג / ק"ג). היעדרות של רפלקס palpebral מרמזת עומק הרדמה מתאים.
8. אקראי לחלק את העכברים לתוך קבוצת ABL שטופלה (n = 10) וכן קבוצת ביקורת ללא טיפול (n = 10).
9. עבור קבוצת ה- ABL שטופל, לכסות את העיניים של עכברים עם רדיד אלומיניום על מנת להימנע מחשיפת יתר לאור. מניחים את העכבר כוויות ישירות תחת LED, עם מכסה של צלחת פטרי 35 מ"מ מתחת לבטן העכבר כדי לשמור גבם במצב מאוזן.
10. החלף את מד הכוח / אנרגיה כאמור בשלב 3.5 עם העכבר על di פטרי רבועיםsh. התאם את גובה העכבר בחזרה למצב שבו המרחק בין צמצם LED ואת השטח של כוויית העכבר שווה כי בין צמצם LED ורמת חיישן האור של מד הכח / האנרגיה (כפי שפורטו צעד 3.5).
11. מקרין את הכוויות הנגועות irradiance של 100 mW / cm ^2. לספק ABL במינונים של 72 J / cm ² עד מינון כולל של 360 J / cm ² הוא הגיע (למשל, 0, 72, 144, 216, 288 ו 360 ² J / ס"מ). אחרי כל מנה אור, לבצע הדמיה פליטת אור על עכברים, כפי שפורט בסעיף 4.
12. עבור קבוצת הביקורת שלא טופלה, לבצע הדמית פליטת אור של כוויות העכבר, כפי שפורט בסעיף 4, תוך שימוש באותה המרווחים הזמן כפי שמוצג עבור הקבוצה שטופלה-ABL.
13. לפני ההתאוששות של העכברים, למקם את העכברים על מיטת כירורגי המים מחוממים כדי למנוע איבוד חום היפותרמיה. שימו לב הפעילות רפלקס palpebral של עכברים עד להחלמה. לאחר ההתאוששות דואר של העכברים, לשכן אותם 2-3 בכל כלוב.
14. לאחר טיפול ABL, לבצע הדמיה פליטת אור, כפי שפורט בסעיף 4, מדי יום במשך 3 הימים הראשונים ולאחר מכן לסירוגין כדי לפקח על ביו-עול הזמני של זיהומים אצל עכברים.

4. הדמיה פליטת אור של דלקות עכברים

1. תמונת העכברים באמצעות מערכת הדמיה בתאורה חלשה שכוללת מצלמת מכשיר התעצמה תשלום מצמיד, בקר מצלמה, בתא דגימה, לבין מעבד תמונה ^19.
2. להרדים את העכברים עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל קטמין-xylazine (100 מ"ג / ק"ג - 20 מ"ג / ק"ג). בעדינות לגעת palpebral של עכברים עם מקלון צמר גפן; בהעדר של רפלקס palpebral מרמז עומק ההרדמה המתאים.
3. הפעל את תוכנת הדמית חיים. בלוח הבקרה שמופיע, לחץ אתחול. מתן עד צבע תיבת הטמפרטורה הופך לירוק, המציין כי הטמפרטורה של הבמהבתא הדגימה הגיעה 37 מעלות צלזיוס.
4. מניח את העכברים על הבמה (37 ° C) בתא הדגימה של מערכת ההדמיה, עם הכוויות הנגועות ישירות תחת המצלמה.
   הערה: פליטת האור של החיידק יכול להקטין כאשר הכוויות להיות יבשות. לכן, מומלץ לחות כוויות העכבר עם PBS לפני ההדמיה.
5. בלוח הבקרה, לשים סימן ביקורת לצד "הארה". בחר "חשיפה אוטומטית", כך זמן החשיפה לדימות יהיה מותאם על ידי תוכנת הדמיה החיה שמבוססת על עוצמת פליטת האור.
6. בחר "C" מתוך "מבט שדה" הרשימה הנפתחת. בחר באפשרות "סרוק אמצע הטווח" לתת את התוכנה לקבוע מרחק המוקד. לשים סימון ליד שכבת העל.
7. לחץ "לרכוש" כדי ללכוד את התמונה. בתיבה "ערוך תמונה לייבל", לחץ על "אישור"; "חלון תמונה" ו "Palette אגרה" יופיע.
8. גדר פרמטרי ROI האוטומטי עבור בחירה אוטומטית.
9. לכמת את עוצמת פליטת האור כיחידות הארה יחסית (RLUs) ולהציג את פליטת האור בקנה מידה בצבעים מלאכותיים החל ורוד (האינטנסיבי ביותר) לכחול (אינטנסיבי לפחות) ^{19, 20.}
10. חשבתי את שבריר ההישרדות של חיידקי כוויות עכבר על משתנה נקודות זמן המבוססת על ניתוח עוצם פליטת אור. שבר ההישרדות של חיידקים בנקודת זמן נתונה = עוצמת פליטת האור נמדדה באותה נקודת הזמן / עוצמת פליטת האור נמדדה ממש לפני חשיפת ABL ^17.

5. המתת חסד של עכברים

1. את נקודות הקצה של הניסוי הם כדלקמן: (א) ברזולוציה של הזיהום כפי שמעיד הפסד של פליטת אור כפי שנקבע על ידי הדמיה; (ב) התרחשות של זיהומים שיטתיים כפי שצוין על ידי ההתפשטות של פליטת אור מחוץ שרפה הםא; (ג) אובדן משקל גוף ≥15% בהשוואה לעכברים רגילים לפי גילים, או הסובלים מכאב ומצוקה כפי שצוין על ידי חוסר היענות גירוי ידני, חוסר תנועה, חוסר יכולת לאכול או לשתות. במהלך המחקר, אם אנו נתקלים במצב שבו אנחנו לא בטוחים אם עכבר במלואו הגיע למעמד של גוססת, כפי שתואר על ידי ההגדרה שלנו, ו / או איננו בטוחים אם אנחנו צריכים להרדים אותו, נפנינו צוות וטרינרי CCM עבור תוכנית פעולה; (ד) אחרת העכברים יהיו מורדם 30 ימים לאחר תחילת המחקר.
2. מקם מחדש את העכברים לתוך כלובים סגורים במיוחד עבור המתת חסד להרדים את העכברים ידי אספקת פחמן דו חמצני (CO ₂₎ גז דחוס לתוך הכלובים.
   1. פתח את רגולטור טנק או שסתום CO ₂ ליזום את זרימת הגז. ודא כי הרגולטור קורא את psi הנכונה (פאונד לאינץ 'מרובע) מבוסס על הוראות שפורסמו על ידי היחיד, ולהתאים מחדשgulator אל psi הנכון לפי הצורך, בדרך כלל לא יותר מ 5 psi.
   2. מלאו לאט. קצב הזרימה צריך לתפוס לא יותר מ 30% של נפח תא / כלוב לדקה (עבור כלוב עכבר טיפוסי, ~ 2 L / min; עבור כלוב חולדה, ~ 7.5 L / min).
   3. יש להמתין כ 3-5 דקות על החיה להפסיק לזוז או לנשום; צריכות להיות קבועות ומורחבות העיניים. בטל טנק CO ₂ או שסתום הרגולטור כדי לעצור את זרימת CO _2.
   4. ודא כי הלב חדל לפעום ידי מרגיש את החזה בין האגודל לאצבע. ודא כי אין רפלקס מצמוץ ידי נגיעת גלגל העין.
      1. אם יש דופק או רפלקס מצמוץ, לחזור על תהליך מתת החסד או להשתמש במספריים כדי לפתוח את בית החזה כדי ליצור pneumothorax (החיה חייבת להיות ללא תגובה קמצוץ בוהן לפני ביצוע הליך זה).

תוצאות

זן א baumannii כי השתמשנו הוא לבודד קליני MDR, כפי שדווח בעבר ^{12, 17.} זן החיידקים נעשה bioluminescent ידי transfection של אופרת luxCDABE ^11. האיור 1 א מציג את תמונות ההארה הרצופות חיידקים מכל עכבר נציג לשרוף נגועות...

Discussion

ABL היא שיטה חדשנית לטיפול בזיהומים. מאז מנגנון הפעולה שלה שונה לחלוטין מזו של כימותרפיה, זה יותר של פיזיותרפיה. הסוכן המתווך את ההשפעה מיקרוביאלית הוא הקרנת אור כחול (400-470 ננומטר). עם ההתפתחות של נוריות כחולות, רכשנו גישת גישה מיקרוביאלית מבוסס אור יעילה ופשוט עבור זיה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS	PerkinElmer Inc, Waltham, MA	IVIS Lumina Series III	Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED	VieLight Inc, Toronto, Canada	415 nm	Light source for illumination
Power/energy meter	Thorlabs, Inc., Newton, NJ	PM100D	Light irradiance detector
Mouse	Charles River Laboratories, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii	Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX	Clinical isolate	Engineered luminescent strain
Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79	BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride	Fisher Scientific	721016	0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution	Fisher Scientific	BP24384	A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion	Fisher Scientific	B11059	Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C	For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers	Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH	Incu-Shaker Mini	For culturing of bacteria
Inoculating Loops	Fisher Scientific	22-363-605	For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL	Fisher Scientific	02-707-502	Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-220	For bacterial suspension seperation
Brass Block	Small Parts, Inc., Miami, FL	10 mm by 10 mm	For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves	Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY	PBI83514	Heat Resistant Gloves
Greiner dishes	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate	Cole-Parmer Instrument Company, LLC	UX-84301-65	10" x 10", 220 VAC, for boiling water
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed	E-Z Systems	EZ-211	Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness