זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Summary

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Abstract

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Introduction

תאים באורגניזמים רבים-תאיים יש הרבה תכונות בודדות שעשויה להיות או ייחודי עבור תא מסוים או לפחות שייכות לקבוצות ייחודיות של תאים. גם תאים משובטים בתרבית להראות מאפיינים אישיים כפי שמעידים המורפולוגיה המגוונת שלהם. כמו כן, האינדיבידואליות של תא משתקפת המוצרים שהיא מפרישה. במקרה של זיהום ויראלי, חלקיקים נגיפיים יכולים לשאת חלבונים מהתאיים שיצר אותם. לדוגמא, ל- HIV רבי חלבוני תא מארח מוטבעי המעטפת הנגיפית וירוסים המופקים על ידי תאים שונים עשויים לשאת חלבונים האופייניים אלה ^{1, 2} או "חתימות תא".

גם בלי זיהום, תאים לשחרר לתוך שלפוחית ​​תאיים הקטנה המקיפה תקשורת (EVS). Biogenesis של שלפוחית ​​אלה והמבנה שלהם במקרים רבים דומה לזו של וירוסים, במיוחד רטרווירוסים. בשנים האחרונות זה הפך להיות ברורמכוניות חשמליות כי, אשר נחשבו בתחילה להיות "אבק טסיות" ^3, מהוות מערכת פיזיולוגית חשובה של תקשורת בין תאים. יחד עם שתי מערכות אחרות של תקשורת בין תאית, כלומר אינטראקציות מגע תאי תאים ומולקולות מסיסות שוחררו, EVS לתאם פיזיולוגיה נורמלית משתנית שונות פתולוגיות ^{4, 5} כולל זיהומים נגיפיים ^{6, 7.}

למרות ששני חלקיקים נגיפיים שוחרר שלפוחית ​​תאיים הם מאוד מגוונים, הם מאופיינים בעיקר על ידי ניתוח בתפזורת שבו המאפיינים האישיים שלהם הם איבדו. שיטה דומה cytometry זרימה, אשר פנוטיפים תאים בהתבסס על אנטיגנים השונים על פני השטח שלהם, יש צורך לאפיין חלקיקים נגיפיים פרט ויראלי דמוי. למרבה הצער, EVS או virions קטן לא ניתן לנתח באמצעות ציטומגלווירוס זרימת תקןשיטות מטריה כי הם קטנים מדי כדי ליצור את האות-פיזור אור על אשר רוב cytometers להסתמך מפעילה. כדי לעקוף מגבלה זו, קרינה ניתן ליישם מפעילה. עם זאת, אם כלי רכב חשמליים או virions מגואלות נוגדני ניאון קשה להבדיל ביניהם לבין נוגדנים בחינם אגרגטים שלהם בגלל הקרינה שלהם הדומה וגדלים דומים.

לאחרונה, פיתחנו שיטה תפוקה גבוהה המבוסס על ננוטכנולוגיה המאפשרת אפיון של אנטיגנים על חלקיקים קטנים בודדים באמצעות cytometers תזרים קבוע ^{8, 9.} אנו מעסיקים MNPs לחלקיקי immunocapture של עניין, כפי שתואר על ידי קבוצות אחרות ליישומים מגוונים ^{10, 11, 12, 13;} עם זאת, השיטה החדשנית שלנו מאפשרת בתמורה ללכידתו של במפרט פרטמטרות FIC ואחריו phenotyping של שנתפסו חלקיקים אלה על ידי cytometry זרימה באמצעות קרינה מפעילה ולא פיזור אור, בלי התערבות נוגדנים צפו חינם. לשיטה זו יש יישומים רחבים וניתן להשתמש בו כדי לאפיין את הרכב אנטיגני של כל חלקיק קטן viral- והלא-ויראלי שנוצר על ידי תאי in vivo ו במבחנה ספקה את הזמינות של נוגדני ניאון ספציפיים נגד אנטיגנים פני שטח. כבר יש לנו ליישם את הטכניקה הזו כדי ללמוד כמה בעיות ביולוגיות.

בפרט, אנו הערכנו את חלוקת תא סמנים מארחים חלקיקי HIV-1 אדם ^9, חקרנו את ההבשלה של וירוסים דנגי פרט (DENV) בהתבסס על ניתוח של חלבוני פני השטח שלהם ¹⁴ וחקרתי כלי רכב חשמליים משתחררים לתוך מחזור הדם של מתנדבים בריאים וחולה עם תסמונת כלילית חריפה (ACS). למרות מבוסס על עיקרון דומה,יישום של הטכניקה החדשה חייב פיתוח פרוטוקולים ספציפיים המתוארות להלן.

Protocol

1. עגינת חלקיקים מגנטיים (MNPs)

1. השתמש בהליך צימוד מסחרי ריאגנטים הזוג MNPs עם נוגדנים (ABS) (בדרך כלל 1 מ"ג). חלקיקי תחמוצת ברזל עם חומצה קרבוקסילית קבוצות תגובתי כמו משמשים.
   1. אם נוגדנים נמצאים בהיקף גדול מסך 0.5 מ"ל, להתרכז באמצעות concentrator 100K. ספין XG ב 2000 במשך 3-5 דקות.
2. בסוף ההליך, לאחר הוספת 10 μl של חיץ מרווה, להעביר MNPs לצינור 12 מ"מ x 75 מ"מ ולהוסיף 3 מ"ל לשטוף / אחסון חיץ. מניחים את הצינור לתוך החור במרכז מפריד מגנטי ולהשאיר למשך הלילה ב 4 ° C..
3. ודא MNPs יש כל שנאספו על הצד של הצינור, ואז בזהירות pipet את כל נוזלי. הוסף 3 מ"ל של חיץ לשטוף / אחסון טריים, ומכניסים המגנט.
4. לאחר כמה שעות, לבדוק אם MNPs נאספים אל הצד של הצינור ואז pipet את הנוזל. השתמש 2 מ"ל של לשטוף / אחסון חיץresuspend את MNPs ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס.
5. ודא כי שרירי הבטן הם מצמידים את MNPs ידי תיוגם עם נוגדן Fab פלורסנט רלוונטי (למשל עיזים ועכבר אנטי אם באמצעות monoclonal העכבר Ab עבור לכידת כמפורט בסעיף 2) ולהפעיל על cytometer זרימה.

2. נוגדנים תיוג מצמידים את MNPs

1. שלב 60 μl (3.9 x 10 ¹² חלקיקים) של MNPs (לכל מצב) ו -5 μl (של פתרון מסחרי 200 מיקרוגרם / מ"ל) שכותרתו שברי Fab, ספציפית עבור אלוטיפ של לכידת Ab צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
2. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות עם ערבוב מתמיד.
3. טרום להרטיב concentrator 100K עם 300 μl של בופר פוספט (PBS) ספין microcentrifuge בבית 1500 XG במשך 5 דקות.
4. לטהר מתחמי שכותרתו על 100K טור. ספין את התערובת משלב 2.2 microcentrifuge בבית 1500 XG במשך 5 דקות, לשטוף עם 200 μl PBS, להתאוששנפח ראשוני.

3. שימוש של מכלולי Ab-MNP תווית ללכוד חלקיקים של ריבית (וירוסים או EVS)

1. דגירה μl 60 מראש שכותרתו MNPs (3.9 x 10 ¹² חלקיקים) עם HIV (60 μl) או הכנה EV (100 μl).
   1. כן הכנות EV בשיטות שונות. הנה, לטהר כלי רכב חשמליים על הדרגתיים סוכרוז, לאסוף אותם מפלזמה עניה טסיות באמצעות ריאגנטים ממטרי exosome או לבודד ישירות פלזמה ^8.
      הערה: יחסים אופטימליים צריכים להיקבע עבור כל ניסוי ותלויים ריכוז של הווירוס / EV בהכנה. MNP-Ab חלק צריך להיות ~ 10 ⁶ העולה לעומת ריכוז של שבריר וירוס / EV.
2. דגירה 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין לאיתור וירוסים, או שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס במשך EVS.
3. להוסיף 2.5% העכבר IgG / IgG האדם לחסום Fc מחייב, בעדינות מערבולת, דגירה 3-5 דקות ב RT.
4. הוסף מומלץ יצרן או titered ריכוזים של כל שרירי בטן זיהוי דגירה נוספות 20 דקות ב RT.

הפרדת 4. של virions MNP שנתפס (או EVS) מ נוגדנים מאוגדים באמצעות עמודות מגנטיות

1. הכן טור הפרדה מגנטי לשימוש על ידי הצבת אותו מגנט מפריד.
2. טרום להרטיב את העמודה עם 500 μl של חיץ לשטוף (2 חומצה מ"מ Ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 0.5% בסרום שור אלבומין (BSA) ב- PBS). אפשר לשטוף חיץ לזרום דרך העמודה.
3. מוסיפים את מתחמי MNP-וירוס / MNP-EV לעמודה ולאפשר לכל נוזל לזרום דרך. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף לעמודה, המאפשר נפח כולו לעבור.
4. חזור כביסה עם פי 2 חיץ לשטוף.
5. הסר את העמודה מגנט ומניחים 12 מ"מ x 75 מ"מ צינור לאיסוף מתחמי MNP-וירוס / MNP-EV העודפים. בואו בעמודה לעמוד בצינור את המגנט במשך 3 דקות. הוסף 200 μl של PBS ולתתהחרוזים לזרום למטה על ידי כוח הכבידה, להוסיף עוד 200 μl של PBS, ולתקן עם 200 μl paraformaldehyde 4% לאחר elution.
   הערה: Paraformaldehyde הוא קרצינוגן חשד יש לטפל במנדף מאוורר יש ללבוש כפפות.
6. כדי לכמת virions יחיד / כלי רכב חשמליים להשתמש בהגדרות נפחית על סמפלר תפוקה גבוהה (HTS) או רק לפני רכישת להוסיף זרימת מוּרבָּך cytometry חרוזים הספירה.

5. ניתוח של וירוסים MNPs שנתפסו / מכוניות חשמליות עם Cytometer זרימה

1. להתחמם cytometer זרימה למשך 30 דקות.
2. חרוזי בקרת איכות לרוץ.
3. הסף נקבע על הקרינה של כל אחד MNPs או וירוסים שכותרתו / EVS. השתמש 0.22 מיקרומטר מסוננים PBS עבור סף כדי להקטין את הרקע "רעש". הגדר את הסף ידי התאמת מתח PMT ברמה שבה PBS המסונן נותן שום, או מעט מאוד, אירועים.
4. הפעילו דגימות על נמוך. (להשתמש במסנן מוטבעות נוסף 0.04 מיקרומטר עבור נוזל נדן להציב סדרה מאחורי0.2 מיקרומטר נדן מסנן סטנדרטי להמשיך לחסל אירועי שווא).

הערכת 6. של היעילות הלכידה

1. לכידת fluorescently כלי רכב חשמליים שכותרתו או HIV עם MNP-Abs כמתואר 3.1, 3.2. (EVS ניתן מסווג עם צבע קרום או דרך המטען שלהם ^15; HIV יכול להיות מתויג אם באמצעות צבע בקידוד גנים ^16, או עם צבע קרום ^{12, 17).}
2. הכן טור הפרדה מגנטי כמתואר (4.1-4.2).
3. מוסיפים את מתחמי MNP-וירוס / MNP-EV לעמודה ולאפשר לכל נוזל לזרום דרך (לזרום חלק). אסוף את הזרימה דרך שבריר בצינור.
4. המשך עם שבריר שמור על העמודה כמתוארת (4.4-4.5).
5. הליך ללכוד חזור על הזרימה דרך שבריר מ -6.3 עם הפרדה שלאחר מכן (4.1-4.5).
6. לנתח את שברי שימור ca הראשוןpture ולכידה שני על ידי הפעלת אותם על cytometer זה מוגדרים על מפעיל על התווית ניאון של EVS או HIV. כדי להעריך את היעילות, השווה את מספר האירועים בשני שברים.

7. הסתגלות לפרוטוקול עבור משימות ספציפיות

הערה: בעוד הפרוטוקול יכול להיות מיושם על ניתוח של HIV כלי רכב חשמלי כמתואר לעיל, ניתוח רכב DENV בשינויים הבאים צריכים להיות הציגו:

1. דגירה virions עם 1 מיקרומטר DiI בחושך במשך 30 דקות ב RT. לאחר דגירה לטהר וירוס מוכתם על ידי צנטריפוגה במדיום שיפוע צפיפות (10%, 20%, 25% ו -35%) ב 240,000 XG עבור 1.5 שעות ב 4 ° C ללא בלם. אסוף חלק בין 20% ו -25% שיפוע צפיפות שכבות בינוניות ^14.
2. דגירה DiI שכותרתו DENV 1 x 10 ⁷ (60 μl) עם ריכוזים היצרן מומלץ או titered של זיהוי Ab בנוכחות IgG עכבר 2.5% למשך 20 דקות ב RT.
3. Incubאכלו תערובת עם 60 מראש שכותרתו μl (3.9 x 10 ¹² חלקיקים) מתחמי MNP ללכוד Ab במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין.
4. מתחמי כתוצאה נפרדים מ ABS מאוגד על עמודות מגנטיות כמתואר לעיל ולנתח על cytometer זרימה.

תוצאות

לכידת סלקטיבי של אנטיגנים הסלולר על ידי virions HIV-1

עם "זרימה virometry" ניתן כיום לדמיין אנטיגנים הסלולר על חלקיקים נגיפיים בודדים. כדוגמה, התמקדנו שני אנטיגנים הסלולר נישא על ידי HIV-1, LFA-1 ו- HLA-DR. מוקדם יותר שני האנטיגנים האלה זוהו בהכנות HIV-1 נתחו בתפזורת ^1. הכנו MNPs בשילוב עם אחד של נוגדנים נגד חלבון ה- HIV מעטפה, VRC01, וכבש עם אלה MNPs HIV-1 virions (HIV-1 _LAI.04 או HIV-1 _SF162 המיוצר בתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs)). בנוסף, אנו מוכתמים virions אלה עם 2G12, אחר נוגדן אנטי מעטפה. virometry הזרימה הראה ההטרוגניות גבוהה של virions HIV-1 לגבי הנוכחות של LFA-1 ו- HLA-DR. בממוצע 16.7 ± 2.0% (n = 6) ו -8.6 ± 0.3% (n = 3) של HIV-1 _LAI.04 virions נשאו LFA-1 ו- HLA-DR,בהתאמה. רק 4.8 ± 0.6% (n = 3) של כל virions נמצאו חיוביות הן אנטיגנים. על זן HIV-1 האחר, HIV-1 _SF162, אנטיגנים אלה נכחו 20.0 ± 4.4% (n = 6) ו -10.8 ± 1.3% (n = 6) של virions, בהתאמה, ואילו הן אנטיגנים בוצעו ב -6.5 ± 0.4% (איור 1).

ההתפלגות של החלבונים התאיים הייתה תלויה התאים משוכפלים וירוס. חיים עם HIV תאי Jurkat מיוצרים virions השונה antigenically לבין תוצרת PBMCs הנגוע. Virions של HIV-1 _{LAI 0.4} המיוצר על ידי תאי Jurkat נשא 1.6 ± 1.4% (n = 3) ו -1.6 ± 0.7% (n = 4) LFA-1 ו- HLA-DR בהתאמה. עבור HIV-1 _SF162 virions המיוצר בתאי Jurkat, פרמטרים אלה היו 7.2 ± 2.5% (n = 3) ו -5.6 ± 2.7% של (n = 4). לכן, איפור אנטיגני (לפחות עבור HLA-DR ו LFA-1) היה שונה ל- HIV-1 _LAI.04 הנוצר על ידי שני תאים שוניםסוגים (p <0.02).

זרימת virometry כפי שהוחל על הערכה של וירוס דנגה

התבגרות DENV קשורה הביטוי של חלבון PRM על virions. יישמנו זרימת virometry להעריך איזה חלק של DENV מיוצר BHK-1 ו בתאי LoVo מהווה וירוסים בוגרים. Virions הוכתמו לצבוע lipidic DiI. ניתוח של virions שנתפס פרט חשף PRM על 48.2 ± 5.3% (n = 8) של DENVs. לעומת זאת, 84.5 ± 3.4% (n = 4) של DENV המיוצר בתאי LoVo נשאו PRM. שאר virions, בהתאמה 51.8 ± 5.3% (n = 8) ו -15.5 ± 3.4% (n = 4) היו PRM שלילית (איור 2). לפיכך, זרימת virometry יכול לשמש כדי להבדיל בין DENV פרט לבגרות מלאה מ בשלה (או חלקי המבוגר) virions DENV.

שלפוחית ​​תאיים שוחררה למחזור הדם של בריאהמתנדבים חולים עם תסמונת כלילית חריפה (ACS)

על מנת לחקור תת EV שונה בחולים עם ACS ובקרות בריאות, אנו שבויים כלי רכב חשמליים מפלזמה העניה טסיות (PPP) על ידי MNPs מצמיד פלורסנט עם נוגדנים נגד CD31, CD41a, או CD63. מכוניות חשמליות בשבי CD31-MNPs היו מוכתמים עבור CD41a ו CD63, EVS בשבי CD41a-MNPs היו מוכתמים עבור CD31 ו CD63, ו כלי רכב חשמליים בשבי CD63-MNPs היו מוכתמים עבור CD31 ו CD41a (איור 3).

הסכום של EVS בשבי CD31-MNPs וחיובית עבור אחד או שניים של נוגדני זיהוי בחולי ACS היה 3,359 [2,328; 5472] כלי רכב חשמליים / μl בהשוואה 1,272 [714; 2,157] מכוניות חשמליות / μl במתנדבים בריאים (p = 0.001). הסכום הכולל של כלי רכב חשמלי בשבי CD63 בחולי ACS בהשוואה מתנדבת בריאים היה 3,541 [1,318; 5173] כלי רכב חשמליים / μl לעומת 806 [488; 2,112] מכוניות חשמליות / μl (p = 0.007). היו 4,752 [3,238; 7173] כלי רכב חשמליים / μl בפלסמה של חולים עם ACS בשבי CD41a-MNPs, ואילו בפלסמה של מתנדבים בריאים המספר הזה היה נמוך משמעותית, 2,623 [1,927; 4188] כלי רכב חשמליים / μl (p = 0.015). באופן כללי, התוצאות שלנו מצביעות על כך, ואילו סכומי EV הוגדלו בעיקר בחולי ACS, סדר הגודל של הגידול היה שונה תת-אוכלוסיות שונות של כלי רכב חשמליים.

איור 1: שילוב סלקטיבי של אנטיגנים הסלולר ב- HIV-1 virions שכפול תאים מסוגים שונים. HIV (HIV-1 _LAI.04 או HIV-1 _SF162) virions שפורסמו על ידי PBMCs או תאים Jurkat נתפסו עם VRC01-MNPs ומוכתמת עם נוגדן אנטי gp120 השני 2G12 ועם נוגדנים ספציפיים כנגד HLA-DR ו LFA-1. ההכנות המוכתמות היו נתוני ניתוח תזרים עבור HLA-DR (פסים לבנים) ו LFA-1 (ba השחורRS). אמצעי ± SEM של שלושה עד שישה ניסויים ^9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: מדינת הבשלה של virions DENV. DENV מיוצר BHK-21 תאים (A, B) או בתאי LoVo (C, D) תויגו עם צבע lipidic DiI, ואחרי ultracentrifugation במדיום שיפוע צפיפות, מוכתם עבור חלבון PRM עם 2H2 נוגדנים (A, C) או עם IgG2a אלוטיפ (B, D). Virions שכותרתו אז נתפסו עם 3H5-1-MNPs נתון לזרום ניתוח ^14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.

איור 3: ניתוח של EVS מחולי ACS ובקרות בריאות. כלי רכב חשמליים פלזמה נתפסו עם CD31-MNPs, CD63-MNPs או CD41a-MNPs ומוכתמת עם נוגדנים נגד CD41a ו CD63, נגד CD31 ו CD41a ונגד CD31 ו CD63, בהתאמה. מכוניות חשמליות שנתפסו, מוכתמות לפחות אחד Abs זיהוי, היו דמיינו ו מנויי ניתוח תזרים. מנתונים שהוצגו כמו עלילת נקודה עם מגוון חציון interquartile (IQR). סימני גרין: מתנדב בריא (שולט), סימנים חומים: חולי ACS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: Evaluatiעל השבר של אירועי זרימת מייצגי virions פרט. (א) HIV-1. השעיה של virions חולקה לשני חלקים ומוכתמת או עם DID (פאנל משמאל) או DIO (פאנל באמצע). לאחר ערבוב, ההשעיה, שהכיל שני virions מוכתם באופן דיפרנציאלי, נלכד עם VRC01-MNPs נתון לזרום virometry (פאנל מימין). אגרגטים (אירועים כפולים בצבע) היוו פחות מ -10% של סך כל אירועים. (B - D) DENV. השעיה של virions מוכתם DiI היה מדולל באופן סדרתי שני לקפל מ 1: 2 עד 1: 256 ורכש עם HTS על cytometer זרימה (B). DiI-DENVs תויגו עם 2H2 נוגדנים (C) או-DENVs DiI נתפסו עם 3H5-1-MNPs (D). תכשירים C ו- D אז היו בדילול סדרתי שני לקפל מ 1: 2 עד 1: 256 ורכש עם HTS ^14. Virions לא נראה לצבור מאז בכל המקרים ישקשר לינארי הוא בין הגורם לדילול ומספר האירועים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: איתור של חלקיקים אחת על ידי cytometer זרימה. DiI מוכתם ההשעיה DENV דוללה סדרתי שני לקפל מ 1: 2 עד 1: 2,048 ורכש באמצעות HTS על cytometer זרימה. (א) מספר הווירוסים שאותרו כפונקציה של גורם לדילול. (ב) עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של DiI שכותרתו DENV ^14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6: הערכת החלק היחסי של virions ואת שלפוחית תאיים שנתפסו עם MNPs מצמידים נוגדנים ספציפיים. HIV-1 virions או מכוניות חשמליות שכותרתו נתפסו עם MNPs מצמידים נוגדנים ספציפיים נתון לזרום virometry. לאחר הפרדה על עמודות מגנטיות, את הזרימה דרך (לא שמר) שברים נותחו עבור הנוכחות של virions או מכוניות חשמליות של עניין כי הוחמצו בטווח הראשון. (א) virions HIV-1 _BAL תווית נתפסו עם 2G12-MNPs (פאנל משמאל). שבר זרימת הדרך נכבש מחדש נתון לזרום virometry (פנל מימין). במחזור הראשון על 95% של virions עניין נתפסו. (ב) כלי רכב חשמליים תווית נתפסו עם MNPs אנטי CD81 ומבודד על עמודות מגנטי (פאנל משמאל). שבר הזרימה דרך מחדש שנאסף ונותח (פנל מימין). בראשוןמחזור כ -99% של שלפוחית עניין נתפסו ^8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

Cytometers תזרים קונבנציונלי להישאר הכלי העיקרי לניתוח תאים בהתבסס על מאפיינים פיזיים וכימיים שלהם ברמת הפרט ^18. העקרונות הבסיסיים של זרימת cytometry לא שונו מאז הפיתוח שלה: תא שעובר דרך קרן הליזר ומפזר אור מהווה אירוע שמפעיל את ההקלטה של ​​ספקטרום הניאון הנפלטת נוגדני ניאון כלוא. קטנים חלקיקים מתחת ל -300 ננומטר לא ניתן לאתר על ידי פיזור צד של cytometer כפי שהן מפזרות יותר אור תחת זוויות גדולות שבו רוב לזרום cytometer לא אוספים אור ^18. הטכניקה המתוארת כאן, מאפשרת זיהוי והניתוח של אנטיגנים מרובים על וירוסים או מכוניות חשמליות אישיים רבים על ידי cytometers תזרים הקונבנציונלי עם קרינה מפעיל.

השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול הם הצימוד של נוגדני MNPs. הניסויים שלנו היו perforMed באמצעות 15 חלקיקי תחמוצת ברזל ננומטר עם חומצה קרבוקסילית כקבוצה תגובתי כפי שתואר לעיל ^9. לדברי היצרן, כל 15 MNP ננומטר יכול להיקשר לכל היותר 20 נוגדנים; אנו לאגד כ 10 נוגדנים לכל 15 ננומטר MNP. הערכה זו מבוססת על כמות הנוגדנים לפני ואחרי צימוד ומספר חרוזים / מ"ל, כפי שהיא נמדדת על ידי אפיון nanoparticle ומכשור אומדת. באופן עקרוני, צימוד עלול לגרום צבירה של חלקיקים ואף אינו רצוי. כדי לבדוק צבירה זה לא קורית עם הפרוטוקול שלנו, אנו מאמתים את זה עם אפיון nanoparticle ומכשור אומד. מכשיר זה מודד את הקוטר הידרודינמית עבור החלקיקים, הכולל את שכבות ציפוי נוגדנים ולא ליבת 15 ננומטר בלבד. מצאנו כי הרוב המכריע של חרוזים בשילוב נמצאים בשיאם יחיד (ממוצע השיא ב 64.7 ± 4.2 ננומטר עם 90% מכלל האירועים להלן 73 ± 7.3 ננומטר). הערבוב של שיתוף Ab-MNPmplexes עם virions או מכוניות חשמליות בפרופורציה הנכונה חשוב, כך MNPs נמצא הריכוז של כמה הזמנות גבוהות יותר מאשר כלי הרכב חשמלי / virions. דבר זה הוא קריטי על מנת להבטיח כי יחיד כלי רכב חשמליים / virions מנותחים. הימנע צירופי מקרים של אירועים על ידי הפעלת cytometer ב זרימה נמוכה. ודא כדי לעורר את הרכישה על קרינה ולהשתמש שולטת נפח למדוד את הריכוז של הגופים שנתפסו.

עם זאת, MNPs יכול לצבור כלי רכב חשמליים או virions ידי crosslinking או על ידי קשירה של שניים או יותר virions לאותו ננו-חלקיקים. כדי לבדוק זאת, מבחן עבור צבירה כמתואר באיור 4 צריך להתבצע. אפילו ברמת הפרט נתפס virions או מכוניות חשמליות רשאי להיכנס קרן הלייזר בו זמנית של זרימת cytometer. בכך ייווצר-חיוביות כוזבות עבור שני אנטיגנים שונים. כדי להימנע מכך, cytometer הזרימה צריך להיות מוגדר כמתואר וההכנות צריכות להיות מדוללות. אפשר לבדוק אם זה מקרה שקורה באמצעות אותוהאסטרטגיה כמתואר לנקודה הקודמת. כמו כן, חוסר מקרה יכול להיות מאומת על ידי ניתוח דילולים סדרתי של הכנה להוכיח כי מספר האירועים פוחתת באופן ליניארי עם דילול בעוד עוצמת הקרינה הממוצעת של אנטיגן fluorescently מוכתם נשאר קבוע בכל דילולים (איור 5). בעיה נוספת היא שמעט מדי וירוסים / כלי רכב חשמליים יכולים להיות בשבי. זה יכול להיות בגלל המחסור האמיתי של וירוסים / כלי רכב חשמליים שנושאים אנטיגנים שדרכו הם נלכדים על ידי ספציפי MNPs. לחלופין, את היעילות של לכידה נמוכה בשל סיבות שונות (למשל, צימוד יעיל של נוגדני MNPs, הסטייה היחסית של MNPs כדי virions / כלי רכב חשמליים שפותח עבור פרוטוקול זה, וכו '). כדי למנוע את האפשרות האחרונה, את היעילות של לכידה יש ​​להעריך במיוחד. בדרך כלל, את היעילות צריכה להיות בערך 90% כמו באיור 6.

נוגדנים שונים יכולים להתערב בשלהפרעה סטרית אחד עם השני או עם הנוגדנים מצמידים את MNPs. כדי לוודא שזה לא קרה פרוטוקול ללכוד הפוך חייב להיבדק (כמתואר בסעיף 7. בקצרה, virions או מכוניות חשמליות צריכים להיות מוכתם ראשון עם ABS איתור פלורסנט ואז נתפס על ידי מתחמי Ab-MNP עם פרדה עוקבת משב"א שתרחף על עמודות מגנטיות.

יש זרימה virometry יתרונות משמעותיים ביחס לשיטות הקיימות של ניתוח הרכב אנטיגני של virions או מכוניות חשמליות. בשיטות ביוכימיות שיגרתיות לדווח על הנוכחות הכללית של חלבונים מסוימים בהכנות, אבל מספקות שום מידע על ההטרוגניות של virions או מכוניות חשמליות. זה כולל immunocapture של virions או מכוניות חשמליות על חלקיקים גדולים זמינים מסחרית. חלקיקים כאלה הם בדרך כלל של כמה מיקרונים בקוטר וכל אחד מהם יכול ללכוד מאות או אלפי virions או מכוניות חשמליות. לכן, כל ממוצעים לניתוח שלאחר מכן את המאפיינים של virions / כלי רכב חשמלייםנתפס על ידי חלקיק אחד. לעומת זאת, תזרים virometry משתמשת MNPs של 10-15 ננומטר בקוטר עם פרוטוקול המתואר לפחות 90% של אירועים מייצגים virion בודד או EV יחיד.

המגבלה העיקרית היא כי אוכלוסיית virions או מכוניות חשמליות בהכנה אולי לא להיות מנותחת, אבל רק אלה נלכדים. לכן, הבחירה של אנטיגן שדרכו virions או מכוניות חשמליות נלכדים הופכת להיות קריטית. כמו כן, תזרים בניגוד cytometry מספר אנטיגנים שונים (מספר נוגדני ניאון נגד אנטיגנים שונים) הוא מוגבל על ידי המשטח הקטן של virions או מכוניות חשמליות. לבסוף, נוגדנים שונים עשויים sterically להפריע זה לזה שוב בשל קטן (לעומת התאים) משטח.

הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מותאם עבור ניתוח של כל וירוס או EV ממקור כלשהו, ​​ובלבד נוגדנים ספציפיים שבאמצעותם הם יכולים ליפול בפח זמינים. ניתוח של אנטיגנים על יתר virions פרטחוקרים של להתייחס בפתוגנזה של שברים שונים של אוכלוסיות ויראלי. יתר על כן, זיהוי של כלי רכב חשמליים פרט בפלזמה עשוי לאפשר להתחקות אחר מקורו של EVS תאים מסוימים ולדווח על תנאים נורמלים או פתולוגי של תאים אלה ואת האיברים שבם הם מתגוררים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits	Ocean Nanotech	ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane	Millipore	UFC810024
5 ml Round Bottom PP Test Tube, without Cap	Falcon	352002
DEPC treated water	Quality Biological	351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator	Ocean Nanotech	SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k	Pall Corp	OD100C34
EDTA 0.5 M	Corning Cellgro	46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution	Sigma-Aldrich	A9576-50ML
PBS	Gibco	10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified	EMS	15710
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CytoCount beads	Dako	S2366
AccuCheck count beads	Invitrogen	PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST)	BD Bioscience	642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution	Thermo Fisher Scientific	V22885
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
µMACS column	Miltenyi Biotec	130-042-701
OctoMACS Separator magnet	Miltenyi Biotec	130-042-108
Nanodrop	ThermoFisher	none
NanoSight NS300	Malvern	none
BD LSRII flow cytometer	BD Bioscience	none
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Flowjo software	Flowjo
BD FACSDiva software	BD