JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Abstract

הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) היא כיום התווך לזיהוי ישויות כימיות מסוגלות ויסות תגובות ביוכימיות או תהליכים תאיים. עם ההתקדמות ביוטכנולוגיות ופוטנציאל translational הגבוהה של מולקולות קטנות, מספר גישות חדשניות גילוי סמים התפתחו, מה שמסביר את העניין המתחדשת בשימוש HTS. לתחום הסרטן הוא כיום תחום המחקר הפעיל ביותר עבור הקרנה בסמים, ללא פריצת דרך משמעותית עשויה לזיהוי תרכובות אימונו החדשים מיקוד סיבוכים הקשורים להשתלה או מחלות אוטואימוניות. כאן, אנו מציגים רומן assay הלימפוציטים פלורסנט המבוסס murine במבחנה להתאים בקלות לזיהוי תרכובות אימונו-חדשות. assay זה משתמש תאי T או B נגזר עכבר מהונדס, שבו האמרגן Nur77 מניע ביטוי של GFP על טריקו או גירוי הקולטן B-cell. כשעוצמת GFP משקפת אתפעילות הפעלה / תעתיק של תא המטרה, assay שלנו מגדירה כלי רומן כדי לחקור את ההשפעה של תרכובת מסוימת (ים) על תגובות הסלולר / ביולוגיות. למשל, הקרנה עיקרית בוצעה באמצעות 4398 תרכובות בהעדר של "שערת יעד", אשר הובילה לזיהוי של 160 להיטים פוטנציאליים מוצגים פעילויות מערכת חיסוניות. לפיכך, השימוש של assay זה מתאים תוכניות לגילוי תרופות לחקור ספריות כימיות גדולות לפני לקדם במבחנה / in vivo מחקרי אימות.

Introduction

הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) היא אסטרטגיה מוכחת לאימוץ נרחב לזיהוי מולקולות טיפוליות חדשות או עבור מחדש של תרופות ה- FDA באינדיקציות רפואיות חדשות. 1 עד כה, הצלחת HTS מושגת ניתן למדוד על ידי השפע של תרופות גילה בעבר. למשל, lapatinib מעכב טירוזין קינאז המשמש לטיפול בסרטן השד, סיטגליפטין; peptidase-4 dipeptidyl (DPP-4) inhibitor לשמש תרופה אנטי hyperglycemic, ואת dasatinib מעכב טירוזין קינאז Bcr-Abl אוראלי המשמש לטיפול לוקמיה מיאלואידית כרונית מייצגים כמה מהדוגמאות הלקוחות מתוך רשימה ארוכה של תרופות מאושרות גילה במקור על ידי HTS. 2 למרות התפוקה של תעשיית התרופות בזמן האחרון סבלה ממחסור בתגלית של ישויות כימיות חדשות, הסבירות של גילוי תרופות מוצלח ניתן לשפר באמצעות גידול במספר קנדידה טרום קלינייםtes מוצגת תכונות ביולוגיות / ביוכימיים modulatory. לפיכך, פיתוח מבחני HTS החדשים המותאמים להקרנת פנוטיפי יכול להציע את הפוטנציאל לספק כלים תרופתיים חשובים על גילוי להיטי תרופה חדשים. 3, 4, 5, 6 יתר על כן, HTS יכול להתבצע כעת בקצב מהיר בשל תמורות טכנולוגיות בולטות בשנים האחרונות כוללים התקנות רובוטית גמישות אישי מעוצב, טכנולוגיות לקריאה מתוך רומן מזעור נרחב. 2, 7 בין גורמי תורמי העניין הגובר שימוש הקרנת פנוטיפי (aka קדימה פרמקולוגיה) הוא התפייס כי התמקדות תופעות פונקציונליות ולא נחות הרדוקציונית פשטניות לגבי מטרות מולקולריות (/ הקרנת מבוססי יעד תגובות ביוכימיות) סבירה יותר כדי sho יעילות קלינית w. לפיכך, הקרנה פנוטיפי ולפוטנציאל לחשוף תרכובות חדשות טיפוליות פוטנציאל מסלולים מולקולריים של מחל כיום חשוכות. 2

כדי לזהות מעכבי או activators כראוי עבור מטרה מולקולרית נתון או פונקציה הסלולר, assay רגיש ואמין מאוד נדרש כדי להבדיל בין להיטים ישרי-לב תוצאות חיוביות שגויות. אז, מה עושה assay טוב? האיכות של assay נתון חייב להישפט לראשונה על ידי יחס אות לרעש (משתקף דרך גורם Z). 8 שנית, ההשפעה הממוקדת או המטרה של המסך צריכה לקבוע בנקל. לדוגמא, גישות מבוססות תאים פונקציונליים יכולות להציע יתרונות משמעותיים להקרנת קולטן להבדיל assay תוכננה במיוחד כדי להעריך קולטן ליגנד מחייב. הסיבה לכך היא כי הגישה השנייה לא יכולה להבדיל בין הליגנדים אגוניסט ו אנטגוניסט.ss = "Xref"> 9 לעומת זאת, גישה מבוססת תאים עשויה להיות יעילים יותר כפונקצית קולטן ניתן להעריך ישירות פנוטיפ ביולוגי (התפשטות, עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס, ו / או בידול). עם זאת, יש לציין כי מבחני ביוכימיים יכולים לספק יתרונות משמעותיים על פני מבחני פנוטיפי כפי שהם מפרים על מטרה תאית ספציפית. Assay ביוכימיים היטב אופטימיזציה יהיה פחות פיזור נתונים בדרך כלל מאשר הקרנה פנוטיפי תוך פישוט לאחר מכן חקירות קשורות למנגנון המולקולרי תרופת פעולה. עם זאת, החסרון העיקרי של מבחני המטרה מבוסס או ביוכימי הסיכוי של הגברה בקצב להיטים חיוביים כוזבים שעשויים להשפיע מטרות הלא ספציפית כאשר נבדקו מערכת ביולוגית (פסד של סגוליות למדו במקור ב assay ביוכימיים). 10 למרות נקודה ומבוססת חתוכים בין להיטים שליליים וחיוביים יכולה לצמצם את מספר תוצאות חיוביות שגויות in ההקרנה הראשית, השימוש של מערכת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית מחקה את הסביבה התאית היליד כגון תאים שלמים, כל רקמה או כל חיה נשארת הליבה של מטוטלת עיצוב assay. לכן, הקרנה פנוטיפי מאפשרת גילוי יתרון תופעות פנוטיפי ביולוגיות / רצויות מחלות ללא מטרות תרופה מזוהות ללא צורך בידע המוקדם של פעילות המתחמת או במצב של פעולה. 11

המחקר במסמך נוגע פיתוח ובדיקות של הקרנת פנוטיפי אופטימיזציה לשחזור המבוססת על שני מרכיבים חשובים: במודל של עכברים מסחריים קיים מש'-משנה מקובצים של תרכובות כימיות. עם כל הכבוד במודל חיה, assay מסתמך על השימוש של לימפוציטים שמקורו בזן העכבר (Nur77 GFP) מחסה כרומוזום בקטריאלי מלאכותי המכיל קלטת שבה הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא מונע על ידי האמרגן הדואר Nur77. 12 סימן ההיכר של גירוי זה מבוסס על העובדה כי Nur77 הוא גן מוקדם מיידי למעלה המוסדר הבא קולטן תאי T (TCR) או הקולטן B-cell (BCR) גירוי. 12 באשר שיטת ההקרנה עצם, גישה שמשה לעזור הימנעות הקרנת אנלוגים טריוויאלי תוך מזעור הזמן הנדרש כדי להעריך ספרייה כימית גדולה (> 10 5 תרכובות). לשם כך, מסד נתונים של תרכובות כימיות שנבחרו על ידי כימאים תרופתיים באמצעות כלי סריקה ממוחשבים נוצלו לזהות תרכובות דומות טופולוגית באמצעות מבני זרע פעילים המכונים אזכור. גישה זו אפשרה לנו מסך 4398 תרכובות מייצג ספרייה כוללת של מעל 136,000 ישויות כימיות.

Protocol

כל הפרוטוקולים החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של אונ' מונטריאול. עכברים היו מורדמים משאיפת הדרגתית של CO 2 עד לא נצפו אחריו סימנים חיוניים על ידי נקע בצוואר הרחם. ההליך בוצע על ידי אדם מוסמך על מנת להבטיח כי בעלי החיים היו מורדמים באופן הומני על פי ההמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי החיים.

1. הכנת Splenocyte בינוני ושפל-cytometry הצפת

  1. ביצוע כל הצעדים מתחת למכסה המנוע הביולוגי 70% לניקוי אתנול.
  2. הסר 70 מ"ל של מכון ממוריאל פארק מחומם מראש רוזוול (RPMI) בינוני 1x 1640 (זמין וסיפקה מסחרית 500 מסוננים מ"ל נפח בקבוקי סטרילי) ומניחים בתוך שפופרת סטרילית. מדיום הסיר שישמש מאוחר יותר בפרוטוקול.
  3. מוסף הנותרים 430 מ"ל של RPMI 1640 1x עם 50 מ"ל מומת בסרום שור העובר (FBS), 5 פניצילין מ"ל / סטרפטומיצין, 5מ"ל HEPES, 5 מ"ל שאינם חיוניים חומצות אמינו, 5 מ"ל פירובט נתרן, ו 0.05 מ"ל מסוננים (1M) 2-mercaptoethanol.
    הערה: בינוני splenocyte טרום חמים באמצעות באמבט מים נקבע על 37 מעלות צלזיוס, כדי למנוע תאים מזעזע חום. זה חשוב כדי למנוע אינדוקציה של אפופטוזיס הסלולר.
  4. כדי להכין את החיץ זרימה cytometry, להוסיף 2 מ"ל של FBS ל -98 מ"ל פוספט בופר (PBS) ולשמור בקירור עד השימוש (רצוי בתוך שלושה ימים).

2. דור של השעיה תא Splenocyte מ Nur77 GFP עכבר טחול

  1. Septically לבודד את הטחול של עכבר Nur77 GFP נקבה בת 6-8 בשבוע.
    1. כדי להשיג זאת, לעבוד מתחת למכסה המנוע סטרילית. משרה את פרוות עכבר הקריבו, מספרי מלקחיים באתנול 70%.
    2. הנח את העכבר על צידו הימני, לחתוך את העור והשרירים ברבע הבטן השמאלית העליונה. בדוק את אזור החתך כדי בעליל לאתר את הטחול ואז לגזור אותו. שמור את הטחולבמדיום splenocyte על הקרח עד מוכן לביצוע השלב הבא.
  2. מניחים את הטחול (ים) בצלחת פטרי תרבות 10 ס"מ 2 תאים המכיל 5 מ"ל של מדיום splenocyte מחומם מראש.
  3. מועך את הטחול באמצעות בוכנת מזרק סטרילי עד הפתרון הוא עכור. מטריצת קולגן טחול צריכה להישאר עד סוף ההליך.
  4. בעקבות רסוק נרחב במדיום splenocyte, לאסוף את ההשעיה תא ולהעביר אותו דרך מסננת תא 70 מיקרומטר דגש על שפופרת 50 מ"ל לסנן החוצה את כל הפסולת או קרישי דם.
  5. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. לאחר השלכת supernatant, מחדש להשעות את התא גלולה ב 2-3 מ"ל של in-house המיוצר או מסחרי חיץ תמוגה תאי הדם האדומים. בעקבות pipetting (2-3 פעמים) ולתת לשאר השעיה למשך 20-30 שניות.
  6. הוסף 5 מ"ל של PBS או חיץ מתאים הבחירה אז בצנטריפוגה ההשעיה תא במשך 5 דקות ב 500 x גרם.
  7. הסר את supernatant (צריך להיות בצבע אדום מכיוון שהיא מכילה lysed ב אדוםתאים lood) מחדש להשעות את התא גלולה ב 2 מ"ל של מדיום splenocyte.
  8. באמצעות hemocytometer, לספור את מספר תאים מוכתם כחול trypan להבדיל בין חיים ומתים (נמקי) תאים.

3. בידוד תאי T מן תרחיף תא Splenocyte

  1. צנטריפוגה השעית התא במשך 5 דקות ב 500 x גרם. Re- להשעות את התאים בינוני סרום ללא RPMI (50 מ"ל משלב 1.3) כדי להשיג ריכוז הסלולר של 10 x 10 6 תאים / מ"ל.
  2. מעביר את התאים לצינור קלקר 5 מיליליטר ו להפריש aliquot 100 μL של splenocytes עבור / השוואת הערכה טוהרת בסוף צעד הטיהור.
  3. להוסיף סרום עכברוש נורמלי ההשעיה התא ב 50 μL / מ"ל ​​ואחריו קוקטייל נוגדנים בידוד תא T (50 μL / מ"ל).
  4. מערבבים את ההשעיה תא ולתת לו לנוח במשך 10 דקות. צעד זה מאפשר קוקטייל של נוגדנים כדי לאגד את כל תאים לא רצויים.
  5. מוסיף את התחומים המהירים streptavidin (מגנטחרוזי ic) עבור 2.5 דקות, ולאחר מכן להביא את הנפח ל -2.5 מיליליטר באמצעות מדיום הסרום ללא.
  6. מניחים את הצינורית מגנט בידוד תא במשך 3 דקות.
  7. מעביר את השעית תא T לתוך צינור פוליסטירן חדש באמצעות לחיצת המגנט וממטיר הפתרון במהלך אחד.
    הערה: השעיית המבודד מכיל תאי T המטוהרים. כל התאים לא רצויים מתקיימים בצד של הצינור חייב חרוזי streptavidin המגנטיים.
  8. ספירת תאי T מבודדים באמצעות trypan כחול ו hemocytometer.
    הערה: בשלב זה את הטוהר של תאי T המבודדים ניתן לאמת (אופציונאלי) על ידי ניתוח אחוז CD3 + האירועים לפני ואחרי בידוד תא T על ידי זרימת cytometry. 13
    1. בקצרה, צנטריפוגות 1 מ"ל של תרחיף תאים splenocyte ב g 500 x. בטל supernatant להשעות תאי חיץ זרימת cytometry בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
    2. להוסיף ניאון מתויג אנטי mousדואר CD3 נוגדנים בריכוז של 1: 100. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפי פעם, צנטריפוגה מחדש להשעות במאגר זרימה cytometry (400 μL) לניתוח על ידי-cytometry הזרימה.

4. בידוד B-cell מן תרחיף תא Splenocyte

  1. פעל על פי אותו פרוטוקול כמתואר עבור תאי T (שלבים 3.1-3.8) אבל באמצעות ערכת בידוד B-cell. להערכת טוהר, השתמש נוגדן CD19 במקום הנוגדן CD3. 13
    1. להערכת טוהר (אופציונלית), השתמש נוגדן CD19 במקום נוגדן CD3. צנטריפוגה 1 מ"ל של השעיה תא splenocyte ב 500 גרם x. בטל supernatant להשעות תאי חיץ זרימת cytometry בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
    2. ניאון להוסיף מתויג נוגדן אנטי עכבר CD19 בריכוז של 1: 100 ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפי פעם, צנטריפוגה מחדש להשעות במאגר זרימת cytometry (400 μL) FOניתוח r ידי-cytometry הזרימה.

5. הפעלת תאי T ואת האינדוקציה של ביטוי GFP

  1. זרעים התאים T, השעיה, לתוך צלחת 96-היטב עגולה תחתית בריכוז של 2.5 x 10 5 תאים / היטב.
  2. להוסיף interleukin רקומביננטי (IL) -7 ב 2 ng / mL ו CD3 / CD28 חרוזים מגנטיים (25 μL / 10 6 תאים). שמור חלק תאי T מטופל עם חרוזים לשמש כביקורת שלילית למדידות מאוחר יותר באותו מייצגים תאים T שאינו מופעל.
  3. שתים עשר שעות מאוחר יותר, לקצור את תאי T מהצלחת 96-היטב על ידי pipetting בעדינות את השעית התא היטב כל אחד למעלה ולמטה כדי לשבור את כל חרוז תאים מורכבים / אגרגטים. אסוף את ההשעיה מכל בארות לתוך צינור קלקר 5 מ"ל.
  4. מניחים את הצינור המכיל את ההשעיה בתוך המגנט אותו לצינוק השתמשו בעבר לניקוי של תאי T או B ולאפשר לו לנוח במשך 5 דקות.
  5. מעביר את int השעית תא TOA צינור פוליסטירן חדש באמצעות לחיצת המגנט וממטיר הפתרון במהלך אחד.
  6. צנטריפוגה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות. Re- להשעות את התאים בינוני splenocyte טריים כדי לקבל ריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ"ל.
  7. הערכת עוצמת הביטוי GFP ידי-cytometry זרימה (אופציונלי עבור בקרת איכות) ב 12 עד 24 שעות לאחר גירוי בהשוואה תאי T שאינם מופעלים. 12
    הערה: GFP הקרינה היא חלק מובנה בתוך תאים Nur77 GFP T ובא לידי ביטוי על הפעלה מוצלחת של TCR. 12
  8. להערכת הכדאיות והפעלה (אופציונלי) על ידי מיקרוסקופ, להכתים את התאים מופעל עם Hoechst 30 דקות לפני הניתוח בריכוז של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל. להוסיף נפח נאותה של ההשעיה תא לשקופית כיסוי או אל באר צלחת תחתית שטוחה שחור-צדדית 384 גם ולבחון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי להעריך תאים חיים. תאים מתים לא ישמרו גרעיניהַכתָמָה. 14

6. הפעלת B-cell ואת האינדוקציה של ביטוי GFP

  1. באמצעות בקבוק תרבות T-25, מחדש להשעות את תאי B המבודד 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
  2. להוסיף אנטי עכבר IgG / IgM (H + L) בשעה 10 μL / מ"ל ​​ו CD40L רקומביננטי בריכוז של 200 ng / mL. שמור חלק תאי B שלא טופלו לשמש כביקורת שלילית למדידות מאוחר יותר (המייצגים תאי B שאינם מופעלים).
  3. הערכת עוצמת הביטוי GFP ידי-cytometry הזרימה ב 12 או 24 שעות לאחר גירוי בהשוואה תאי B שאינו מופעל.
    הערה: GFP הקרינה היא חלק מובנה בתוך תאים Nur77 GFP B ו- מתבטאת על הפעלה מוצלחת של BCR. 12
  4. להערכת הכדאיות והפעלה (אופציונלי) על ידי מיקרוסקופ, להכתים את התאים מופעל עם Hoechst 30 דקות לפני הניתוח בריכוז של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל. להוסיף נפח נאות של השעית התאשקופית כיסוי או אל באר צלחת תחתית שטוחה שחור-צדדית 384 גם ולבחון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי להעריך תאים חיים. תאים מתים לא ישמרו מכתים גרעיני. 14

7. הקרנת תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

  1. כן השעית תא 2 x 10 6 תאים / מיליליטר של תאי T או B מופעלים (חרוזים מגנטיים או נוגדנים / CD40L) או קבוצות שאינן מופעל.
  2. פלייט 75,000 תאים / היטב צלחת 384 גם (נפח של 40 μL). השתמש 384-גם צלחת עם תחתית שטוחה שחורה-צדדית או שקופית כיסוי מיקרוסקופ להערכה כדאית והפעלה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (שלב בקרת איכות אופציונלית לפני HTS) באמצעות כתם Hoechst (עיין בשלבים 5.8 ו -6.4 לפרטים נוספים). 14
  3. באופן ידני או באמצעות מערכת אוטומטית, להוסיף את התרופות של בחירה (מומסת 0.5% DMSO) זה טוב.
  4. מוסיפים את הרכב (DMSO) לחיובי (מופעל) והשלילי (לא activated) בארות שליטה. התאם ריכוז DMSO עד למקסימום של 0.5%.
  5. דגירה צלחות עבור 24 שעות (או זמן הדגירה של בחירה) ב 37 ºC, 5% CO 2.
  6. ביום של ההקרנה, לדלל את התמיסה כתם Hoechst 33342 (1:. 3,333; עבור למשל להוסיף 10 μL אל תאי 384 גם הצלחות כדי ליצור נפח הכולל עד 50 μL). הכתם 30 דקות לפני ניתוח GFP על ידי הוספת פתרון Hoechst כדי להשיג ריכוז של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל.
  7. בעדינות פיפטה התאים למעלה ולמטה כדי להשיג חלוקה הומוגנית בכל טוב.
    הערה: שלב זה חשוב במקרה של מחלק הסמים (שלב 7.3) באמצעות מערכת אוטומטית כמו התאים נוטים לצבור בצד אחד של הבאר, אל מול כיוון הזרימה.
  8. ספין צלחות ב 45 XG במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. השאירו את הצלחות לנוח במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. בצע צלחת (ים) לקריאת outs, באמצעות scre התכולה גבוה confocal האוטומטיתמערכת ening (HCS). 15 טען את הצלחת אל המכונה. הגדר את המטרה בהגדלה 40X ומעלה. שימוש במצלמה # 4 עבור Hoechst (מנורת UV) ואת המצלמה # 1 עבור GFP (לייזר 488). הגדר את המכונית לקרוא 6-10 שדות לכל טוב. להתאים את המכונה לעשות שתי קריאות רציפים לכל שדה ב 488 ננומטר (לקרוא GFP) אור אולטרה סגול (לקרוא Hoechst). הגדר את המטרה בהגדלה 40X ומעלה.
    הערה: המערכת מיקרוסקופ ממוחשבת שאינה דורשת כל התאמות. מרחק המוקד, עוצמת אור האירוע ואת זמן חשיפה היא כל ההתקנה באופן אוטומטי על ידי מכונה.

תוצאות

עיצוב של assay HTS

שני גורמים חשובים נלקחו בחשבון בעת ​​תכנון assay הניאון בזאת. ראשית, אנחנו צריכים לשכפל מצב פיזיולוגי שבו הפעלת תא T-או B תייצג מחלה (למשל שתל-versus-host disease). שנית, הערכת ההפעלה הסלול...

Discussion

לקריאה מתוך מספר שיטות שנוצלו לפיתוח מבחני HTS רגישים ואמינים. אלה כוללים שיטות colorimetric, זורח או ניאון. למרות ששיטות colorimetric הן פשוט להגדיר, הם דורשים תוספות רבות של כימיקלים, אשר עלול להפריע או לשבש את התאים נבדקים. 23 בנוסף, הם אינם מאפשרים הערכה דינמית של תג...

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות Merck Frosst Start-up שמספקת אוניברסיטת מונטריאול. ברצוננו להודות לד"ר ז'אן Duchaine ודומיניק Salois מהפלטפורמה תפוקה גבוהה במכון למחקר באימונולוגיה וסרטן לדיון, הערות פידבקים שלהם. Moutih Rafei בעל פרס 1 Fonds de la משוכלל ונדיר en Santé קוויבק ג'וניור.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Nur77GFP miceThe Jackson LaboratoryMouse strain No. 016617An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterileVWR International10062-902T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterileCorning Inc.352350Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterileCorning Inc.352058Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterileVWR International89039-656 Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterileBecton, Dickinson and Company305482To mash the spleen
T-25 culture flaskGreiner Bio-One690 175To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterileGreiner Bio-One627 160To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)WISENT Inc.450-200-EL  Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamineWISENT Inc.350-002-CL Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acidsWISENT Inc.321-010-EL Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 MWISENT Inc.330-050-EL Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM)WISENT Inc.600-110-EL Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS) WISENT Inc.080-910 Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS)WISENT Inc.311-010-CLComponent of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific21985-023Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kitStemcell Technologies19851To isolate T cells
B-Cells isolation kitStemcell Technologies19854To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beadsThermo Fisher Scientific11452DTo activate T cells 
Cell isolation magnetStemcell Technologies18000To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-006-068To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7Peprotech217-17 To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40LR&D Systems8230-CL/CFTo stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibodyBD Pharmingen561799To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibodyBD Pharmingen553786To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A31842To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening SystemPerkinElmer Inc.HH14000000To analyze GFP/Hoechst signal

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121TBNur77 GFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved