סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של<em&gt; Trichinella</em&gt; זחלים בדגימות שריר

Summary

מניעת trichinellosis אדם במדינות רבות ברחבי העולם בוסס על בחינת המעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות בשיטות של עיכול, מתוכם שיטת הבוחש המגנטית נחשבת תקן הזהב.

Abstract

Trichinellosis היא מחלה מתישה בבני אדם והיא נגרמת על ידי צריכת בשר נא או שלא בושל של חיות נגועות עם הזחלים נמטודות מהמין Trichinella. המקורות החשובים ביותר של זיהומי אדם בעולם הם בשר משחק ומוצרי בשר חזיר או בשר חזיר. במדינות רבות, מניעת trichinellosis אדם מבוססת על זיהוי של בעלי חיים נגועים באמצעות העיכול המלאכותי של דגימות שריר מ פגרי בעלי חיים רגישים.

ישנן מספר שיטות המבוססות על העיכול של בשר אבל השיטה הבוחשת המגנטית נחשבת תקן הזהב. שיטה זו מאפשרת זיהוי של זחלי Trichinella ידי מיקרוסקופ לאחר העיכול אנזימטי של דגימות שריר וצעדי סינון ושיקוע שלאחר מכן. אמנם שיטה זו אינה דורשת ציוד מיוחד ויקר, בקרות פנימיות לא ניתן להשתמש. לכן, ניהול איכות מחמירים יש applieד לאורך כל הבדיקה. מטרת העבודה הנוכחית היא לספק הוראות טיפול מפורטות ונקודות בקרה קריטיות של שיטת אנליסטים, על סמך הניסיון של המעבדת תחוס האיחוד האירופי עבור טפילים ובמעבדת ההתייחסות הלאומית של גרמניה עבור Trichinella.

Introduction

נמטודות ממין Trichinella ניתן לאתר בשרירים מפוספסים של יונקים טורפים ו אומניבור, ציפור, וזוחל ברחבי העולם. נמטודות zoonotic אלה יכולים להגיע בני אדם כאשר גלם או חצי גלם מוצרים שמקורם בשר מן החזירים, סוס, וחיות המשחק מעובדים. זואונוסיס זה יכול להיות מחלה קשה בבני האדם מאופיינים בתסמינים פתוגנומוני, למשל שלשול, חום, בצקת periorbital ואת כאבי שרירים וסיבוכים אפשריים כגון דלקת שריר לב, מחלת תרומבואמבוליים ודלקת מוח ^1.

Spiralis Trichinella הוא סוכן אטיולוגי הנפוץ ביותר של דלקת Trichinella בטבע פראי ופנים וגורם למרבית של זיהומי אדם ברחבי עולם. באירופה, צפון ומערב אפריקה, ובמערב אסיה, Trichinella britovi הוא מקור נוסף של זיהומים האדם. בנוסף, עשרה מינים אחרים פחות מדווחים בכינויו סיבתי סוכנים של המחלות האנושיות והן נמצאים באזורים שונים של העולם, בדרך כלל חיות בר ^2. בנוסף חיות ברות כגון חזיר בר, דובים, סוסי ים וגיריות, חזיר מייצג את המקור החשוב ביותר של הידבקות בני אדם ברחבי העולם.

הדרך הטובה ביותר למנוע trichinellosis היא להימנע מאכילת מוצרי בשר נאים לבשל כל בשר, בעיקר בשר משחק לטמפרטורות בטוחות (> 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, כלומר לשנות את צבע בשר מורוד עד חום הליבה של מוצר בשר) ^3. האיחוד האירופי USDA ציינו פעמי הקפאה ובישול וטמפרטורות עבור מוצרי בשר חזיר, שניתן להשתמש בם כדי להרוג זחלי ט spiralis בבשר ^{4, 5.} יתר על כן, המלצות על האיון של Trichinella במוצרי בשר שפורסמו על ידי הוועדה הבינלאומית Trichinellosis"Xref"> 6. באירופה, בנוסף המבוא של תנאי דיור נשלטו בעדרים מסחריים חזירים שבה סכנת זיהום Trichinella זניחה, למניעת trichinellosis אדם מבוססת על הבדיקה במעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות ^4.

למטרות בטיחות מזון, מבחני עיכול הנהלים האמינים רק לצורך זיהוי הישיר של זחלי Trichinella בבשר ^{3, 7.} גם אם יש כמה וריאציות של assay העיכול, השיטה הבוחשת המגנטית היא שיטת ההתייחסות המקובלת בעולם ^{3, 4, 7.} Assay זה מבוסס על זיהוי של זחלי Trichinella ברקמות שריר מפוספסים. לאחר העיכול אנזימטי של דגימות שריר וצעדי סינון ושיקוע עוקבים Triזחלי chinella מזוהים על ידי מיקרוסקופ. בהתאם חובות סחר וחקיקה לאומית, יש שפע של וריאציות קטנות בפרוטוקול הכללי של שיטת הבוחש המגנטית. הנה, הפרטים הטכניים מבוססים על דרישות האיחוד האירופי ⁴ מפרטים ISO ^8, הנחיות ICT ^6, והחוויה של מעבדת יחוס האיחוד האירופי עבור טפילים (EURLP) ובמעבדה הפניה הגרמני Trichinella.

Protocol

1. הכנות

1. אוסף דוגמאות
   הערה: השיטה הבוחשת המגנטית יכולה לשמש דגימות שריר בודדות או תקווינה.
   1. לאסוף דגימות מאתרי הנטייה המתאימים בסכום מתאים ^9. עיין בדרישות המדינה או להמלצות של ICT, OIE או ISO.
      1. עבור האיחוד האירופי, למשל, לקחת דגימת 1 גרם מתוך עמוד סרעפת על מעבר החלק השרירי של חזירים מקומיים. ודא שכל דגימות שריר הן ללא כל שומן fascia.
   2. אם הלשון נבחנת, להסיר את שכבת פני השטח לפני הבדיקה.
   3. תשמור על עצמך אם דגימות קפואות, כמו רוב זחלי Trichinella אינם להקפיא עמידים uncoil לאחר מותו, הם עמידים פחות עיכול נוטים להיצמד קירות מכל, וכתוצאה מכך רגיש assay ירד.
      הערה: אם קפוא, להכפיל את גודל המדגם ב lמהמזרח ולהגדיל את זמן השקיעה (ראה להלן).
2. הכנת נוזל עיכול
   1. הוסף 25% HCl (16 ± 0.5 מ"ל) ל -2 ליטר של מי ברז שחומם מראש ב 46 - 48 ° C לתוך כוס זכוכית 3 L. נמוך מדי של תוצאות טמפרטורה לעיכול שלם; גבוה מדי של טמפרטורה מנטרל את המאפיינים האנזימטית של פפסין.
   2. מניחים מוט בחישה בכוס, ומערבבים הפתרון על צלחת שחומם מראש (46 - 48 מעלות צלזיוס).
   3. הוסף 10 ± 0.2 גרם של פפסין (1: 10,000 NF, 1: 12,500 BP, 2,000 FIP) לפתרון חומצי.
      הערה: איכות פפסין היא פעילות חשיבות ואנזים עליונות חייבות להיות מאושר על ידי היצרן. מטעמי בטיחות במעבדה ועל מנת לשמור על פעילות פפסין, הרצף של הוספת רכיבים נוזלים עיכול חייב להיות דבק.
3. הכנת שריר מדגם
   1. קוצץ עד 100 גרם של דגימות שריר בבלנדר או במטחנה. כדי להקל blenדינג, להוסיף 2 מ"ל שחומם מראש מים על דגימות ומערבלים במהירות מקסימלית עבור 2 - 3 שניות.
   2. לפני המיזוג השני, פתח את הבלנדר ולהעביר כל מדגם שרירים בחלק העליון של מרווח קצה מיזוג קערה על המיזוג התחתון וחזור. המשך מיזוג עם התפרצויות של 2 - 3 שניות עד אין חתיכות גלויות של בשר להישאר.
      הערה: ערבוב מעט מדי עלול לגרום עיכול לא שלם, תוך ערבוב מדי יכול לפגוע בהווה הזחלים Trichinella בדגימות ^6.

נוהל 2.

1. עיכול שרירי מדגם
   1. העבר 1 ליטר של נוזל העיכול לגליל. מעבירים את הבשר הטחון לתוך כוס ולהפיץ בנוזל העיכול בעזרת כף או מזלג. לשטוף ביסודיות את המכסה בבלנדר, להב בבלנדר קערה עם 500 מ"ל של נוזל עיכול שחומם מראש לתוך כוס 3 L.
      הערה: שטיפת Incomplete יכולה לגרום לאובדן של sensitivity.
   2. מכסים את הכוס עם רדיד אלומיניום ולשמור על טמפרטורה קבועה של 44 - C ° 46 ולפקח עם מדחום.
   3. מערבב את נוזלי העיכול למשך 30 דקות כדי ליצור מערבולת עמוקה בלי מתיז עד חלקיקי הבשר להיעלם. בהתאם לסוג של בשר הנבדק (בשר למשל של חיות ברות), להאריך את משך זמן העיכול עד למקסימום של 60 דקות.
2. סינון ושיקוע של נוזל העיכול
   1. כדי לקבוע את כמות הרקמה מעוכלת, להתאים את קנה המידה לאפס, לשקול את המסננת לפני השימוש, ושימו לב משקליו. המסננת צריכה להיות נקיה ונטולה כל חלקיקי רקמות, אשר יכול לעכב את זחלי Trichinella לכת משפך השקיעה. בדוק כי משפך ההפרדה מפולס אנכי.
   2. לאחר עיכול, בזהירות לשפוך את נוזל העיכול דרך מסנן 180 מיקרומטר לתוך משפך זכוכית הפרדה. רוחבו של משפך זכוכית הפרדה אסור bדואר גדול מ -55% מאורך לאפשר שקיעת זחל טובה. תשמור על עצמך כדי למנוע הצפה.
   3. כדי למנוע אובדן של רגישות, לשטוף ביסודיות את כוס זכוכית ואת המסננת עם כ 200 מיליליטר של מים ברז מבקבוק לשטוף לסחוט ולהעביר את מי שטיפה לתוך משפך זכוכית שקיעה. תשמור על עצמך כדי לשטוף את הקצוות בקפידה את כוס 3 L. הרם את המסננת ולשטוף את האזור תחת המסננת ביסודיות.
3. קביעת כמות רקמה מעוכלת
   הערה: בשל טעויות בביצוע של השיטה, רקמת שריר יכולה להישאר על המסננת, כמו fascia גם ורקמות חיבור שהן בלתי ניתנות לעיכול. כמות הרקמה מעוכלת נקבעת במהלך שלב שקיעת 10 הדק 'הראשון (ראה 2.5). זה מאפשר כ -30 דקות עבור המסננת להתייבש, כמו מים שיורית יכולים להשפיע על המשקל הנחרץ של הרקמות המעוכלות.
   1. מניח מגבת נייר בסולם, ולשקול את המסננת עם undigesרקמות טד.
   2. הפחת המשקל המסנן לפני הסינון מן המשקל המסנן עם רקמות מעוכלות. תהליך העיכול נחשב משביע רצון, אם לא יותר מ -5% ממשקל פתיחה לדוגמא נשארים על המסננת (כלומר 5 גר '/ 100 גרמו חומר מוצא).
   3. אם כמות רקמה מעוכלת עולה על 5%, לחזור על הבדיקה באמצעות דגימות שריר טריות. אם הרקמה הנותרת מורכבת בעיקר של רקמות שריר מעוכלות דגימות טריות אינן זמינות, לעכל את השרידים המעוכלים שוב ולבחון בנוסף הדגימות המקוריות.
4. שקיעה של נוזל העיכול
   1. שמור את נוזל העיכול המסונן במשפך separatory למשך 30 דקות. אם נותר ללא הפרעה, זחלי Trichinella יישבו בתחתית המשפך.
   2. אם דגימות קפוא משמשות, להאריך את משך זמן השקיעה עד למקסימום של 60 דקות.
   3. לאחר השקיעה תושלם, מלא לפתוח את השסתוםשל משפך separatory לתת לפחות 40 מיליליטר של נוזל עיכול במהירות לברוח לתוך גליל מדידה (80 מיליליטר אם דגימות שריר שהוקפאו בעבר).
   4. ראשית, בואו וחצים של הנוזל לתוך הצילינדר ולאחר מכן מלא לפתוח את השסתום בכיוון ההפוך כדי לאפשר 10 מיליליטר של נוזל עיכול לעבור. לבסוף, פתח את השסתום בכיוון ההפוך עוד 10 מיליליטר. הליך זה מבטיח כי הזחלים Trichinella אינם לכודים ברזלים.
      הערה: מהירות מספקת נדרשת על מנת להימנע זחלים שנותרו משפך separatory, הפחתת רגישות.
5. שקיעה של נוזל עיכול בצילינדר
   1. השאר את המשקע בצילינדר במשך 10 דקות כדי לאפשר זחלים משקעים. הסר 30 supernatant מ"ל ידי שאיבת עם טפטפת מבלי להפריע משקעים 10 מ"ל.
   2. כדי להפחית את כמות סיבי רקמות במדגם, להוסיף ברז מיליליטר 30 מים משקעים ולהשאיר למשך עוד 10 מ 'ב. חזור על פעולה עד שהנוזלים ברורים.
   3. הסר supernatant ולהעביר את 10 מ"ל שטף משקעים לצלחת פטרי gridded או אגן ספירת הזחל. שוטף את הגליל עם 10 מ"ל מים ברז ולאחר מכן להוסיף את המים המדגמים.
      הערה: כפי כמויות גדולות של פסולת במדגם יכולות למנוע זיהוי של זחלי Trichinella (איור 1), צעדי כביסה נוספים צריכים להתבצע, אם נדרשו.
6. בדיקה מיקרוסקופית
   1. השתמש trichinoscope או-מיקרוסקופ סטריאו עם מקור אור המועבר תת-שלב בעצמה מתכווננת בהגדלה 15 עד 20X לבחון דגימות מייד לאחר שלבי הכביסה.
   2. לאחר שמזג מדגם לתוך צלחת פטרי gridded, לבחון את המנה / אגן הרשת באופן שיטתי על ידי הרשת. אם אין מבנים חשודים נמצאים, בעדינות להזיז את הנוזל בצלחת פטרי gridded או אגן ספירת זחל בצורה מעגלית כדי לאפשר לכל Trichinella larvae, שהיו מתעלמים באופן פוטנציאלי, לצבור במרכז צלחת פטרי. חזור על הבדיקה.
   3. אם מבנה חשוד נמצא, להגדיל גדלה ל -40 - 100X. הסר הזחלים Trichinella מצלחת / אגן עם טפטפת ולאסוף בתוך שפופרת עם אתנול 90%.
   4. לאחר המנה המלאה נבדקת, לחזור על התהליך, החל הרעד העדין של המנה / אגן. חזור על התהליך לפחות שלוש פעמים או עד שלא זחלים יותר נמצאים.
   5. ספירת הזחלים. כדי לתאם את כמות רקמת שריר נבדק ובהווה כזחלים לגרם (גפ"מ).
   6. אם יותר מדי זחלים נמצאים בנוזל העיכול כדי לקבוע את מספר הזחל באופן מהימן, להחזיר את הנוזל המכיל את הזחלים אל גליל המדידה, יש לשטוף במים ברז מבקבוק לשטוף לסחוט, ולהשאיר זחלים ליישב לתחתית.
   7. לאחר זמן שקיעה 10 דקות, מנמיכים את supernatant לנפח מוגדר (למשל10 מ"ל). כדי לקבוע את הנפח המדויק, להעביר את supernatant לגליל חדש עם טפטפת.
   8. להשעות זחלי homogenously בנוזל על ידי טלטול נמרץ. במהלך התנועה הרועדת, להוסיף 12 טיפות של 20 μL השעית זחל לצלחת פטרי.
   9. לבחון כל טיפה ידי מיקרוסקופ. לקבוע את מספר זחלי 240 μL ולמחוק את הספירה העליונה לעשירונים תחתונה. לחיץ במספר הזחלים לסך נפח (למשל 10 מ"ל) של supernatant.
      הערה: איכות מיקרוסקופ סטריאו היא בעלת חשיבות עליונה לזיהוי זחלי Trichinella.
   10. כאשר הזחלים נאספים צינור ידי טפטפת, לבדוק היטב כי הזחלים לא מקל על הקיר פיפטה אך מועברים הצינור.
       הערה: ממצאי Trichinella החיובי ממדגמים ונקוו חייבים להיות נעוצים מהברכה אל הפגר מוצא. הנה, את גודל הברכה צריך להיות ירידה בהדרגה עד הפגר החיובי היא iDENtified. גודל המדגם יכול גם להיות מוגבר במהלך תהליך זה כדי להגביר את הרגישות. איפה בדיקת מדגם קולקטיבי מייצרת תוצאה חיובית או לא בטוחה, מדגם 20 גרם עוד לקוח מתוך כל חזיר. 20 הדגימות גרמו מחמישה חזירים הם אספו ובדקו באמצעות השיטה המתוארת. בדרך זו דגימות מ -20 קבוצות של חמישה חזירים תיבחנה. כאשר Trichinella מזוהה מדגם נקווה מחמישה חזירים, 20 דגימות גרמו נאספות החזירים הבודדים בקבוצה וכל אחד מהם נבחן בנפרד עד הפגר מהמוצא החיובי מזוהה.

תוצאות

לאחר עיכול, את הצורה של זחלי שריר התולעת יכולה להשתנות, מה שהופך זיהוי קשה יותר. צורות אופייניות כוללות זחלים מפותלים היטב, זחלים או ג בצורה מפותלת קל או זחלי uncoiled לחלוטין (2B ומספרים - 2C). מספר הזחלים מצא לגרם יכול להשתנות במידה ניכרת והוא נע בין זחל אחד לכמה מאה זחלים.

המורפולוגיה של זחל שריר זיהומיות מוצגת איור 2 א. זחלי Trichinella הם 0.7 1.5 מ"מ ארוך כ 0.3 מ"מ רוחב. הוושט הוא צר ויש לו סוף מעוגל מעט. לציפורן היא חלקה. במחצית הקדמית של חלל הגוף, stichosome, מבנה היווה של צינור ארוך וצר מוקף בשורה של 45 עד 55 תאים גדולים (stichocytes), ניתן לצפות. פי הטבעת הוא גם מעוגלת ללא כל תחזיות או כספיחיהם ^{10, 11.}

t "> מבנים אחרים, מלבד זחלי Trichinella, ניתן למצוא לאחר עיכול שרירים כמה דוגמאות מוצגות איורי 3A -.. 3F חיות ברות נגועות לעתים קרובות עם טפילים אחרים או דגימות השריר הזמינות לבדיקה הם מזוהמים במהלך תהליך הוצאת הקרביים על ידי נפש או מבנים דוממים / אורגניזמים. אורכו של הזחלים, את המראה של קצוות הקדמי וגם האחורי לבין התרחשות לסייע stichosome להפלות בין סוגים שונים נמטודות ^12.

איור 1: בדיקה מיקרוסקופית של Trichinella זחלים לאחר (א) לא מספק ו (ב) שלבי שטיפה מספיק. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול version של נתון זה.

איור 2: המורפולוגיה של זיהומיים Trichinella זחלים מציגים הרקטום, Stichosome והוושט של הזחל (א). צורות אפשריות של זחלי שרירים אחרי הראה העיכול (B) מפותלות היטב מפותלות קלות העברת זחלים (C) נפרשו עד זחלים. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: דוגמאות לממצאים אגב לאחר העיכול של שרירי דוגמאות עם שיטת סטירר המגנטית. (א) זיפים דמויי שיער שלתולעת מצאה אדמת חזיר בר; (ב) Alaria Alata מן חזיר בר; (C) סיבי השריר מן חזיר בר; (ד) Metastrongylus sp. מן חזירי בר; (ה) צמח סיבים נמצאים חזיר בר (F): sp Toxocara. הזחל מן חזיר בר. ברי סולם עולים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

למרות ששיטת הבוחש המגנטית יכולה להתבצע בקלות, לא הקפדה על פרטים טכניים מובילה רגישות מספק, ובכך מסכנת את בריאות צרכנים. נקודות הבקרה הקריטיות הודגשו בטקסט לעיל. בנוסף, השימוש בציוד מתאים הוא קריטי עבור התוצאה המוצלחת של המבחן. כל הכלי צריך להיות עשויים טיפי זכוכית פיפטה מצופים סיליקון להפחית דבקות של זחלים אל פני השטח.

הרגישות של שיטת העיכול תלוי צפיפות הזחל בשרירים וכמות מדגם שריר הנבדקת. עבור צפיפות זחל של 3 - 5 גפ"מ רקמות שריר, רגישות של 100% נמסרה, אך מתחת גפ"מ 1 הרגישות ירדה ל -40% ^13. בהתאם מינים של בעלי החיים מארחים נבדקים, הרגישות של הבדיקה ניתן לשפר על ידי הגדלת כמות מדגם. האנינטל nfection חיות בר הוא בדרך כלל נמוך, ולכן גדלים מדגמים גדולים משמשים ^14. אתרי נטייה גם להשתנות בין בעלי חיים מארחים. הנה, את הנעכלות הנמוכות של כמה רקמות שריר כגון הלשון צריכה להילקח בחשבון, אשר יכול גם לגרום מדגם גדול יותר בגדלי ^15.

יתר על כן, חשוב להבין כי שיטת הבוחש המגנטית אינה כוללת בקרות פנימיות. לכן, ניהול אבטחת איכות מדגימה בתיעוד חיוני להשיג תוצאות מדויקות ומדויקות. איכות ביצועי מעבדה כדי לזהות זחלי Trichinella בדגימות שריר צריך להיות במעקב על ידי השתתפות סדירה של כל אנליסט במבחני בקיאות.

הגבלות נוספות של השיטה הן ששלב זיהוי הסופי של זחלים שרירים על ידי מיקרוסקופ הוא סובייקטיבי מאוד heavily תלוי בידיעת מורפולוגיה זחל על ידי המטפל לבחון.

שיטה חלופית מעניינת לעקוף בעיה זו היא השיטה בוחשת המגנטית / על בידוד המסנן ואחריו זיהוי זחלים על ידי מבחן התלכדות לטקס. עם זאת, לפי חוקי איחוד שיטה זו נחשבת רק שווה ערך עבור הבדיקות של בשר חזירים מקומיים אך לא עבור בעלי חיים אשר נמצאים בסיכון גבוה יותר של הידבקות כגון חזיר בר ^4. זיהוי של אנטיגן הזחל עם נוגדנים חד שבטיים עושה המבחן אובייקטיבי יותר, אך מכחיש במעבדה אפשרות קביעת מספר הזחלים לגרם בשר ^16.

וריאציות נוספות של השיטה הבוחשת המגנטית כוללות את טכניקת שיטה / שקיעת עיכול מדגם נקווה בעזרת מכשור המכאני, חפירה המדגמת ונקווית בעזרת מכשור המכאנישיטת estion / על טכניקת בידוד מסנן, ושיטת העיכול האוטומטית עבור דגימות משולבות של עד 35 טכניקה גרם. טכניקות אלו מבוססות כולם על העיכול המלאכותי של הבשר להדמית ספירת Trichinella הזחלים, אך נבדלות הציוד המשמש את צעדי הסינון ושיקוע.

הזחלים המבודדים ניתן לזהות נוסף ברמת המין על פי מבחן מולקולרי (למשל, רב מפלסי PCR) ^17. לפי תקנות איחוד אירופאיות, כל הדגימות החיוביות יש להעביר למעבדת ההתייחסות הלאומית או EURLP לקביעת מיני Trichinella.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knife, Scissors, Tweezers			Cutting samples and removing non-digestible tissue
Blender			With a sharp chopping blade
Magnetic stirrer			With thermostatically controlled heating plate
Stirring Rod			Teflon-coated, approximately 5 cm long
Conical glass separation funnel			Capacity of at least 2 L, preferably fitted with Teflon safety plugs. The width should not be larger than 55% of the length to allow a good larva sedimentation.
Stands, rings and clamps
Sieve			Mesh size 180 microns, external diameter 11 cm, with stainless steel mesh
Funnel			Internal diameter not less than 12 cm, to support the sieves
Glass beaker			Capacity 3 L
Glass measuring cylinder			Capacity 50 to 100 mL, or centrifuge tube
Stereo-microscope			With a substage transmitted light source of adjustable intensity or trichinoscope with a horizontal table
Petri dishes			9 cm diameter, marked on their undersides into 10 × 10 mm square examination areas using a pointed instrument or a larval counting basin for the tricinoscope
Aluminium foil			Alternatively a lid to cover the beakers
25% hydrochloric acid
Pepsin			Strength: 1:10,000 NF (US National Formulary) corresponding to 1:12,500 BP (British Pharmacopoeia) and to 2,000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), or stabilised liquid pepsin with minimum 660 European Pharmacopoeia units/mL
Ethanol			70-90% ethyl alcohol
Tap water			Heated to 46-48 °C before use
Balance			Accurate to at least 0.1 g
Metal tray			Capacity 10 to 15 L, to collect the remaining digestive juice
Pipettes and pipette holder			Different sizes (1, 10 and 25 mL)
Thermometer			Accurate to 0.5 °C, temperature range at least from 20 ° C to 70 °C
Siphon			For tap water