הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

Summary

כאן נתאר להכנת נתיישב hydrogels להזרקה מבוסס משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. שיטות להתאמת חוזק מכני של הידרוג ויישומה בתרבות תא 3D מוצגים.

Abstract

הפרוטוקול מציג שיטה נתיישב, יעיל, ו תכליתי כדי להכין hydrogels מבוססי משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. הידרוג מוכן על ידי ערבוב פתרונות של גליקול משקם עם gelator פולימר benzaldehyde מסונתז הסתיים, hydrogels מתקבלים ביעילות תוך מספר דקות בטמפרטורת החדר. על ידי יחסי משתנות בין גליקול משקם, פולימר gelator ותוכן מים, מתקבלים hydrogels רב-תכליתי עם gelation שונים פעמים וקשיחות. כאשר פגום, הידרוג יכול לשחזר שלה הופעות, המודולוס, בשל הפיכות מכבלי אימין דינמי כמו crosslinkages. מלון healable עצמית זה מאפשר את הידרוג להיות להזרקה, שכן הוא יכול להיות עצמי נרפא מפיסות סחוט הידרוג בצובר נפרד לאחר תהליך ההזרקה. הידרוג הוא גם רב מגיב לגירויים ביו-אקטיביות רבות בשל מצבים שונים equilibration מכבלי אימין דינמי. הידרוג הזה אושר כמו ביו-תואם, תאי פיברובלסט העכבר L929 היו מוטבעים הבאים הליכים סטנדרטיים, התפשטות תא הוערכה בקלות על ידי תהליך הטיפוח תא תלת-ממד. הידרוג יכולים להציע פלטפורמה מתכווננת למחקר אחר שבו לחקות פיזיולוגיים של סביבה תלת-ממד עבור תאים הוא מרוויח. יחד עם תכונותיו רב מגיב healable עצמית, זריקות, פוטנציאל ניתן להחיל את hydrogels כמו ספקים מרובים עבור תאים יישומים ביו-רפואיים עתידיים וסמים.

Introduction

Hydrogels הם חומרים פולימריים תפור עם כמויות גדולות של מים רכים תכונות מכניות, הם שימשו. יישומים ביו-רפואיים רבים^1,2. Hydrogels יכולים להציע סביבה רך ורטוב, אשר דומה מאוד הסביבה פיזיולוגיים עבור תאים ויוו. לכן, hydrogels הפכו לאחד פיגומים הפופולרי ביותר עבור תא 3D-תרבות-^3,-⁴. בהשוואה ל תרבית תאים 2D פטרי, תרבית תאים 3D התקדמה במהירות להציע שמטריצה חוץ-תאית (ECM) חיקה microenvironment עבור תאים ליצור קשר עם ולהרכיב למטרות של התפשטות ובידול -⁵. בנוסף, hydrogels המכילה פולימרים טבעיים יכול להציע ביו תואמי וקידום סביבות עבור תאים להתרבות, להבדיל³. Hydrogels נגזר פולימרים סינתטיים עדיפים רכיבי שלהם פשוטה וברורה, אשר לא לכלול השפעות מורכבות כמו חיה-מקור חלבונים או וירוסים. בין כל הידרוג המועמדות תרבית תאים 3D, hydrogels מוכנים בקלות, יש מאפיין עקבי הם תמיד המועדף. המתקן כדי להתאים את המאפיינים של הידרוג כדי להתאים לדרישות מחקר שונים חשוב כמו טוב⁶.

כאן אנו מציגים נתיישב הכנת גליקול מבוססי משקם הידרוג באמצעות כימיה אימין דינאמי, אשר הופכת פלטפורמה תכליתי הידרוג תרבות תלת התא⁷. בשיטה זו, משקם גליקול ביו תואמי ידועים משמשים להקים מסגרות של הרשתות של הידרוג. קבוצות אמינו שלה הם הגיבו benzaldehyde הסתיים פוליאתילן גליקול כמו פולימר gelator כדי ליצור חוב אימין דינמי כמו crosslinkages של hydrogels⁸. אימין דינמית אג ח ניתן ליצור, מתפרקים הפיכה ואת responsively לסביבתם, שהעניקו את hydrogels עם תפור באופן מכני מתכוונן רשתות^9,10,11. בשל שלה לתוכן מים גבוהה, חומרים ביו-תואם, חוזק מכני מתכוונן, הידרוג מיושמת בהצלחה בדומה לפיגום עבור תאים L929 תא 3D תרבות^12,13. פרוטוקול כאן פרטים ההליכים, לרבות פולימר gelator סינתזה, הכנה הידרוג, תא הטבעה culturing תא תלת-ממד.

הידרוג מציגה גם מספר תכונות אחרות בשל שלה crosslinkages אימין דינמיים, כולל שלה רב מגיב לגירויים שונים ביו-(חומצה/pH, pyridoxal נגזרות ויטמין B6, חלבון פפאין, וכו '), המציין כי הידרוג יכול להיות המושרה מתפרקת תחת התנאים הפיזיולוגיים⁸. הידרוג הוא גם עצמית healable להזרקה, מה שאומר הידרוג אפשר יהיה לנהל באמצעות שיטת הזרקת פולשני מינימלי ולהשיג יתרון סמים ותא משלוחים^14,15. על ידי הוספת תוספים תפקודית או פולימר ספציפיות מוגדרות מראש gelators, הידרוג מתאים להשגת מאפיינים ספציפיים כמו מגנטי, טמפרטורה, pH מגיבים, ועוד^16,17, אשר יכול להגשים מגוון רחב של דרישות המחקר. מאפיינים אלה חושפים יכולת פוטנציאלית של הידרוג ניתן בהזרקה ספקים מרובים עבור תאים בתוך חוץ גופית ו ויוו מחקר ביו-רפואי והן יישומים וסמים.

Protocol

אזהרה: נא היוועץ כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. אנא השתמש נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע ניסויים בכימיה, כולל השימוש של הוד fume וכן ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות מגן, חלוק המעבדה, וכו '). הפרוטוקול מחייב תא רגיל בטיפול טכניקות (לחיטוי, שחזור תא, passaging תא, תא הקפאה, תא מכתים, וכד').

1. הכנה של Hydrogels

1. סינתזה של benzaldehyde הסתיים di functionalized פוליאתילן גליקול (DF PEG)
   1. לייבוש מראש של פג פולימר
      1. שוקל 4.00 ג'י פג (4,000 מגה-וואט, 1.00 mmol), להעביר את זה לתוך בקבוקון התחתון עגול (250 מ"ל), ולהוסיף טולואן (100 מ"ל).
         הערה: אחרים יתדות עם משקולות מולקולרית שונים יכולים לעבוד על היווצרות הידרוג אך יוביל קשיחות שונות.
      2. מחממים את הפתרון על ידי אקדח חום (או פלטה בסביבות 40 ° C) במתינות כדי לעזור לפזר את כל פולימרים. לאחר כל פולימרים התמוססות, להשתמש של המאייד כדי להסיר את כל ממיסים. חזור על זה התמוססות ותהליך יבש פעמיים כדי להפוך פג מיובשים פולימרים.
         התראה: זו צריכה להתבצע בשכונה fume בזהירות מרבית. טולואן הוא דליק.
   2. Benzaldehyde התגובה סיום של פג
      1. להוסיף פגים ו tetrahydrofuran (THF, 100 מ ל) ל הבקבוק, להמיס פג באמצעות של בחישה. להוסיף 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6.0 mmol) ו- 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0.6 mmol) ברצף הפתרונות כדי להמיס כל מוצקים לחלוטין.
      2. הוסף N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1.25 g, 6.0 mmol) לפתרון, ולהוסיף צינור ייבוש מלא CaCl נטול מים ₂ הבקבוקון. לשמור את התגובה תחת ערבוב בטמפרטורת החדר (~ 20 ° C) במשך כ- 12 ח'
   3. פוסט-תגובה תהליך
      1. לסנן מוצקים לבן המופקים הפתרון על ידי ואקום בסיום התגובה. שופכים את הפתרון לתוך קר דיאתיל אתר (500 mL) תחת זע, כדי לזרז את מוצקים לבן. לאסוף את כל המוצקים לבן על-ידי מסנן ויבשה מוצקים בשכונה fume.
      2. יתמוסס מוצקים לבן THF שוב, לסנן מוצקים לבן לא מסיסים, שופכים את הפתרון לתוך טריים דיאתיל קר, כדי לזרז את מוצקים לבן, לייבש אותו. חזור על תהליך זה שתיים עד שלוש פעמים, ולאחר מכן מקם מוצקים לבן בתנור ייבוש ואקום (20 ° C, 0.1 mbar) כדי לייבש אותם לחלוטין. לאסוף את אבקה לבנה כמו המוצר הסופי: benzaldehyde הסתיים DF פג.
2. הכנת hydrogels
   1. לשקול כמויות שונות של DF פג (0.11 גרם, 0.028 mmol גרם 0.22, 0.055 mmol; 0.44 g, 0.110 mmol) צינור (10 מ"ל), להוסיף מים יונים (5.0 מ"ל) ולהשתמש למערבולת או פגים כדי לעזור להמיס הפולימר.
   2. לפזר משקם גליקול (0.495 ז, 6.18 x 10 ^-3 mmol) במים יונים (15.0 מ ל) צינור (50 מ"ל), והשתמש מערבולת לכמה דקות כדי homogenize את הפתרון משקם (3 wt %).
   3. להוסיף את פתרון משקם גליקול (0.2 מ ל, 3 wt %) ו- DF יתד פתרונות (0.2 מ"ל) ברצף בצינור (2.0 מ"ל). השתמש מערבולת לערבב את הפתרונות homogeneously hydrogels טופס מספר דקות. בצע את היחס טבלה 1 כדי לגרום hydrogels של חוזק מכני שונה.
      הערה: השתמש בשיטת היפוך-צינור כדי לקבוע אם הידרוג כבר הקים.
3. Rheology ניתוחים
   1. לבצע rheology ניתוח על rheometer המסתובבת עם צלחת פלדה מקבילים (קוטר: 20 מ מ). עבור הבדיקה gelation, התפשטה פתרון משקם גליקול (0.2 מ ל, 3 wt %) על צלחת התחתון. לאחר מכן, מוסיפים DF יתד פתרונות מימית (0.2 מ"ל, 2 wt %) שווה dropwise על גבי המשטח פתרון משקם ומערבבים עם פיפטה במהירות. נמוך יותר למטה את הלוח העליון ולהתחיל כשהילדים
   2. עבור הידרוג ' s נוקשות מבחן, של הידרוג לחתוך עיגול (קוטר: 20 מ מ) ולמדוד את המודולוס אחסון (G ') ערכים לעומת ניתוח תדירות-זן 1%. G טיפוסי ' ערכים-ראד 6.3 s ^{− 1} המפורטים בטבלה 1-
      הערה: לבצע את הבדיקות rheology של הידרוג 0.5 h לאחר היווצרות הידרוג כדי להבטיח ייצוב דינמי בונד הידרוג-
   3. עבור הידרוג ' s healable עצמי לבדוק, לחתוך חתיכות של הידרוג ורכוש לאסוף את החלקים יחד כדי self-heal אל כלי נפרד של. ואז לחתוך את פיסת הידרוג לעשות עיגול (קוטר: 20 מ מ), שים rheometer כדי לבצע את הניתוח rheology.

2. תא תלת-ממד, בטיפוח Hydrogels

1. ההכנה של פתרונות gelation הידרוג
   1. שוקל DF פג (0.44 g, 0.11 mmol) בצינור סטרילי (4.0 מ"ל), להוסיף תא תרבות בתקשורת (RPMI-1640, 2.0 mL), ולהשתמש למערבולת או קדירות לעזור לפזר הפולימר להשגת הפתרון פולימר (20 wt %). לטעון את הפתרון ב מזרק (10.0 מ ל) ולחטא אותו לאחר מכן על ידי העברתו דרך מסנן חיידקים-לפרטים מיקרון (0.22 מיקרומטר).
   2. שוקל את משקם גליקול (0.165 g, 2.06 x 10 ^-3 mmol) בצינור סטרילי (15.0 מ ל), להוסיף תא תרבות המדיה (RPMI-1640, 4.0 מ"ל) ב, מערבולת כדי לעזור לפזר הפולימר להשגת הפתרון משקם גליקול (4.0 wt %). לטעון את הפתרון ב מזרק (10.0 מ ל) ולסנן אותו עם מסנן חיידקים-לפרטים מיקרומטר 0.22.
2. תא בטיפוח hydrogels
   זהירות: לבצע כל תא שגרות בשכונה תרביות רקמה. ידע בסיסי סטרילי טכניקה צפוי.
   1. הכנה של השעיה תא
      1. התרבות L929 תאים RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 5% פניצילין (10 מ"ל) ב- פטרי צלחת (בקוטר 10 ס מ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂. מחליף המדיום כל יום לפני השימוש.
      2. לקצור את התאים L929 עם PBS המכיל טריפסין (0.025% w/v) ו- EDTA (0.01% w/v), ואז צנטריפוגה (70 x גרם, 5 דקות), מחדש להשהות את התאים בטווח הבינוני RPMI-1640 (1.0 מ"ל). לבצע ספירת תאים באמצעות הפעולה הרגיל של לוח ספירת דם. מחדש להשעות את התאים כדי להתאים את הריכוז תא ל ~ 3.75 × 10 ⁶ תאים למ"ל.
   2. תא כימוס ב- hydrogels
      1. לערבב את המתלים תא L929 (0.4 mL, 3.75 x 10 ⁶ תאים מ ל ^-1) עם פתרון משקם גליקול (0.4 מ"ל) צינור (4.0 מ"ל) על ידי מערבולת. Pipette הפתרון משקם L929/גליקול (0.8 מ ל) אל מרכז צלחת פטרי קונאפוקלית (קוטר 2.0 ס מ). Pipette הפתרונות DF פג (0.2 מ"ל) לתוך אותה המנה, פיפטה בעדינות כדי לערבב את הפתרון זירוז היווצרות הידרוג-
         הערה: להעריך את היווצרות הידרוג בהטיית הפטרי.
      2. לקבלת תרבית תאים ישירה, להוסיף סכומים נוספים של RPMI-1640 תרבות המדיה (1.0 מ"ל) על גבי הידרוג. לשים את hydrogels תא מוטבע (1.0 מ"ל, 1.5 wt % גליקול משקם, wt 4.0% DF פג, 1.5 × 10 ⁶ תאים מ ל ^-1) בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂) ושנה את המדיום כל יום. להתכונן תא הדמיה ביום 1, 3, 5 ו- 7 אחרי כימוס תא.
   3. עבור התרבות שלאחר תא תלת-ממד ב- hydrogels לאחר ההזרקה, להכין הידרוג התא טעון (מל ' 1.0, ראה שלב 2.2.2) במזרק (10.0 mL, המחט 48 גרם). לאחר הטפסים הידרוג להזריק את הידרוג לאט לתוך צלחת פטרי עבור הדמיה קונפוקלי. להוסיף סכום נוסף של תרבות התקשורת (1.0 מ"ל) על גבי הידרוג ולשנות אותו כל יום. לשים את צלחת פטרי באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂) ולהתכונן הדמיה לאחר מכן.
      התראה: בבקשה לבדוק ולעקוב אחר הפרוטוקול מבצע בטיחות של מזרק.
3. תא הכדאיות ניתוח
   1. תצפית קונאפוקלית
      1. לשטוף את hydrogels עם PBS (1.0 מ"ל) עבור שתי פעמים. מכתים את hydrogels עם diacetate Fluorescein (ה-FDA, 0.5 mL, 0.05 מ"ג/מ"ל) ופתרונות יודיד (PI, 0.5 mL, 0.08 מ"ג/מ"ל) propidium למשך 15 דקות. לאחר צביעת, להסיר כל ממיסים את.
      2. לבחון את hydrogels באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תחת עירור אורכי הגל של 488 ננומטר, 543 nm לדמיין חיים ומתים תאים, בהתאמה. לקחת את z-במחסן דרך כל עומק מיקרומטר 2 hydrogels כדי לאמת ריפודי כתופיים של תאים בכל רחבי.
         הערה: ה-FDA כתמי תאים חיים בזמן PI כתמי תאים מתים.
   2. לבזות את הידרוג (1.0 מ"ל) עם חומצה אצטית (HAc, 3 v %, 1.0 מ"ל) במשך 5 דקות, פיפטה לתוך צינור (4.0 מ"ל). איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (70 x גרם, 5 דקות), מחדש להשעות את התאים RPMI-1640 תא תרבות בינוני (1.0 מ"ל). לבצע תא ספירת דם ספירת לוח.

תוצאות

מצגת סכמטי של פרוטוקול זה על הידרוג ההכנה והשימוש בה כמו תרבית תאים 3D מוצע באיור1. פרטים של התוכן של הידרוג יחסי המוכנים חוזק מכני שונה מסוכם בטבלה1. הידרוג healable עצמית, rheology מאפיין מציג נוקשות של הידרוג על-ידי אחסון מודולוס לעומת מבחן תדירות באיור2. ?...

Discussion

הידרוג הוצג פרוטוקול זה (איור 1) מכיל שני רכיבים מרכזיים: את משקם גליקול פולימרים טבעיים, benzaldehyde סינתטי הסתיים פולימר gelator פג DF, אשר שניהם חומרים מסתיימים. סינתזה של DF פג מוצג באמצעות תגובת שינוי בשלב אחד. יתד של משקל מולקולרי 4,000 נבחר ב פרוטוקול זה, חששות, המסיסות, שינוי יעילו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycol chitosan	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	619-66-9	99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	538-75-0	99%
Calcium chloride anhydrous	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	10043-52-4	96%
4-dimethylamiopryidine	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	1122-58	99%
Polyethyleneglycol	Sino-pharm Chemical Reagent	5254-43-7	99%
Tetrahydrofuran	Sino-pharm Chemical Reagent	109-99-9	99%
Toluene	Sino-pharm Chemical Reagent	108-88-3	99%
Ethyl ether	Sino-pharm Chemical Reagent	60-29-7	99%
Acetic acid	Sino-pharm Chemical Reagent	64-19-7	99%
Anhydrous CaCl2	Sino-pharm Chemical Reagent	10043-52-4	99%
Fluorescein diacetate	Sigma	596-09-8	99%
Propidium iodide	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 culture media	Gibco
Fetal bovine serum	Gibco
Trypsin-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
Penicillin streptomycin solution	Hyclone		10,000 U/mL
Rheometer	TA Instrument		AR-G2
Confocal microscope	Zeiss		710-3channel
L929 Cells	ATCC		NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator	EYELA		N-1100
48 guage needle	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		48-guage
Microscope	Leica		DM3000 B
Microscope software	Imaris
Heat gun	Confu		KF-5843
Petri dish	NEST