JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול המתואר לסינתזה ידנית של oligo-peptoids ואחריו רצף ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה.

Abstract

Peptoids הם שבשליטת רצף מחקה-פפטיד oligomers המורכב מיחידות N alkylated גליצין. בין יישומים פוטנציאליים רבים, peptoids חשב כסוג של אחסון מידע מולקולרית. ניתוח ספקטרומטר מסה נחשב לשיטת הבחירה עבור רצף peptoids. Peptoids יכול להיות מסונתז באמצעות הכימיה מעבדתי באמצעות מעגל התגובה החוזרת בשני שלבים. כאן אנו מציגים שיטה לסנתז באופן ידני oligo-peptoids, כדי לנתח את רצף peptoids באמצעות טכניקות ספקטרומטר מסה (MS/MS) טנדם. Peptoid לדוגמה הוא nonamer המורכבת לסירוגין N-(2-methyloxyethyl) גליצין (Nme) ו N-(2-phenylethyl) גליצין (Npe), וכן של N-(2-aminoethyl) גליצין (נאה)-קצה אמיני. הנוסחה רצף של peptoid אצמנ Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, Ac קבוצת אצטיל. הסינתזה מתרחש כלי זמין מסחרית מוצק-שלב התגובה. השרף אמיד רינק משמש את התמיכה מוצק להניב את peptoid עם קבוצת אמיד-קצה קרבוקסילי. Peptoid ובמוצר נענשים רצף ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה טריפל-פאול מצמידים אל מקור יינון ספקטרומטריית electrospray. המדידה MS/MS מייצרת קשת של יונים שבר הנובע הדיסוציאציה של peptoid טעון. היונים פרגמנט מסודרים בהתבסס על הערכים של היחס בנפח גדול לתשלום (מ/z). הערכים מ/z של היונים פרגמנט מושווים כנגד ההמונים הנומינלי של יונים פרגמנט תיאורטית החזוי, על פי התכנית של פיצול peptoid. הניתוח יוצר תבנית פיצול של peptoid טעון. תבנית פיצול הוא מתואם רצף מונומר של peptoid נייטרלית. בהקשר זה, ניתוח MS קורא את המידע רצף של peptoids.

Introduction

Peptoids הם סוג של פולימרים שבשליטת רצף עם מבני עמוד השדרה מחקה את המבנה של פפטידים. Peptoids יכול להיות מסונתז מן אמינים מגוונים, המאפשרת peptoids שהפגינו מאפיינים מאוד tunable1,2. Peptoids שימשו כמודלים מולקולרי לצורך מחקר biophysical, נחשב סוכני טיפולית, תוכנן ליגנדים חלבונים3,4,5,6. Peptoids פותחו במגוון רחב של חומרים פעילים ביולוגית, כגון חומרים מימטי-נוגדן anti-עכירות, סוכני מיקרוביאלית האנזימים מעכבי7,8,9. עם אופי מאוד מסודרת, tunable, peptoids גם חשב כסוג של אחסון מידע מולקולרית10. הגילוי של יישומים מגוונים אלה דורש פיתוח שיטות אנליטיות יעיל כדי לאפיין את הרצף והמבנה של peptoids. טכניקות מבוססות ספקטרומטר מסה tandem הראו הבטחה כי השיטה של בחירה עבור ניתוח המאפיינים רצף של פולימרים שבשליטת רצף, כולל12,11,peptoids13, 14,15. עם זאת, מחקרים שיטתיים מתאם הדפוסים יון peptoid הפיצול הנובע מסה ספקטרומטר מחקרים, המידע המבני של peptoids מוגבלים מאוד.

Peptoids יכול להיות בקלות מסונתז באמצעות שיטה מעבדתי. השיטה מפותח כרוך איטראציה של שני שלבים מונומר תוספת מחזור16,17. במחזור כל תוספת, אמין מאוגד-שרף הוא acetylated על ידי haloacetic חומצה (בדרך כלל bromoacetic, BMA), זה מלווה תגובת הדחק עם אמין ראשי. למרות פרוטוקולים אוטומטיים סינתזה הוחלו באופן שגרתי של סינתזה peptoid, peptoids יכול להיות מסונתז באופן ידני עם תשואות מצוינות כימיה סטנדרטי מעבדה16,18,19, 20.

המעבדה שלנו אימצו את השיטה של סינתזה peptoid ידנית, פשוטה את המנגנון בשימוש השיטות הקיימות. בעבר למדנו את דפוסי פיצול של סדרת peptoids באמצעות MS/MS טכניקות21,22,23. התוצאות שלנו מראים כי peptoids לייצר fragmentations האופייני כאשר הם נחשפים התנגשות-induced דיסוציאציה (CID)21,23 או לכידת אלקטרון דיסוציאציה (ECD)22 ניסויים. במאמר זה נדגים כיצד oligo-peptoids יכול להיות מסונתז במעבדה לכימיה סטנדרטי, כיצד לבצע את הניסויים CID באמצעות ספקטרומטר מסה טריפל-פאול וכיצד לנתח את הנתונים ספקטרלי. Peptoid כדי להיות מסונתז והוא מאופיין הוא nonamer עם acetylation N-מסוף, amidation C-מסוף, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. המבנה של peptoid מוצג באיור1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. סינתזה של Peptoid

הערה: הסינתזה מתחיל עם הפעלת השרף על ידי נפיחות השרף והסרה של הקבוצה מגן. זה ואחריו גדלה הרשת peptoid על גבי השרף דרך חוזרות מונומר תוספת מחזורים. מונומר הראשון בשילוב שרף הוא השאריות C-מסוף. Peptoid מוארכת C-מסוף קצה אמיני. לאחר שרצף peptoid הרצויה מושגת, השרף הוא ביקע את ואת המוצר peptoid מטוהר.

  1. הכנה של ריאגנטים
    הערה: ריאגנטים נוזלי נמדדים באמצעות של micropipette, ריאקטיבים נמדדים באמצעות איזון האנליטי.
    1. לערבב 6.2 מ של N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), 43.8 מ של N, N-dimethylformamide (DMF) להכין 0.8 מ' של DIC/DMF פתרון.
    2. להמיס 5.56 גר' BMA לתוך 50.0 מיליליטר DMF להכין פתרון מ' BMA/DMF 0.8.
    3. מערבבים 2 מ"ל של פיפרידין (Pip) ו- 8 מ ל DMF להשגת פתרון Pip/DMF 20%.
    4. להמיס מ 1.9 ל Npe לתוך 13.1 מ ל DMF להשגת 1.0 M Npe/DMF.
    5. להמיס מ 1.3 ל Nme לתוך 13.7 mL DMF להשגת 1.0 M Nme/DMF.
    6. להמיס 0.32 מ ל נאה לתוך 2 מיליליטר DMF להשגת 1.0 M נאה/DMF.
      שים לב: רוב הכימיקלים המשמשים הסינתזה הם מסוכנים. חומצה Trifluoroacetic (TFA), DIC, פיפ ו- BMA הם מסוכנים אל העור, העיניים, מערכת הנשימה. DMF, דיכלורומתאן (DCM) חשודים מסרטנים. כל התגובות צריכה להתבצע בשכונה fume, ציוד מגן אישי המתאים אמור לשמש. נא בדוק את גליון הנתונים של בטיחות חומרים (MSDS) של כל הכימיקלים המשמשים הסינתזה.
  2. הפעלת שרף
    1. למדוד את 84 מ ג של שרף אמיד רינק (שרף, 0.047 mmol, טעינת 0.56 mmol/g) ולהוסיף אותו כלי פוליפרופילן מוצק-שלב התגובה 10 מ"ל. הכנס הבוכנה לתוך הכלי.
    2. להוסיף 2 מיליליטר DMF לכלי השיט התגובה, קפטן הספינה עם כובע לחץ. הנח את הכלי על מטרף, להתסיס את כלי הקיבול בטמפרטורת החדר בזווית של תנועה של-12 מעלות ואת תנודות 385/דקה במשך 30 דקות סוחטים הפתרון במיכל אשפה על-ידי הסרת הכיפה, ללחוץ על הבוכנה של כלי השיט התגובה.
    3. להוסיף 2 מ"ל של 20% Pip/DMF פתרון לכלי השיט, קפטן הספינה. להתסיס את זה על אהבת בשייקר למשך 2 דקות, מסננים את הפתרון פח אשפה.
    4. להוסיף 2 מ"ל של 20% Pip/DMF פתרון לכלי השיט, קפטן הספינה, להתסיס זה בטמפרטורת החדר במשך 12 דקות להסיר את הכובע, לרוקן את הפתרון פח אשפה.
    5. רוחצים השרף על-ידי הוספת 1 מ"ל של DMF, מיצוי על הספינה, את לזעזע את הספינה עבור מינימלית 1 הסירי את הפקק ולנקז את הפתרון על ידי דחיפת הבוכנה. לשטוף את השרף עם DMF עבור 4 פעמים נוספות.
  3. מונומר תוספת ו N-מסוף acetylation
    הערה: בכל מחזור תוספת מונומר כרוך התגובה בשני שלבים, bromoacetylation ותזוזה.
    1. לבצע את המחזור הראשון של תוספת מונומר לטופס Nme-שרף.
    2. לבצע תגובה bromoacetylation. מערבבים 1 מ"ל של 0.8 מ' BMA/DMF פתרון ו 1 מ"ל של פתרון 0.8 מ' DIC/DMF גביע. להעביר את התערובת לכלי התגובה המכילים שרף, קפטן הספינה. הנח את הכלי על ניעור להתסיס זה בטמפרטורת החדר במשך 20 דק. הסר את הכובע, לרוקן את הפתרון פח אשפה.
    3. רחץ השרף על-ידי הוספת 1 מ"ל של DMF מיצוי את כלי הקיבול, לזעזע אותו עבור 1 דקות, מרוקן את הפתרון על ידי דחיפת הבוכנה. רחץ השרף על-ידי הוספת 1 מ"ל של DCM לזעזע את הכלי עבור 1 דקות, מרוקן את הפתרון. לשטוף את השרף עם DCM פעם נוספת ולאחר מכן לשטוף אותו עם DMF פעמיים.
    4. לבצע תגובת הדחק. להוסיף 1 מ"ל של 1.0 M Nme/DMF פתרון, קפטן הספינה, להתסיס כלי הקיבול בטמפרטורת החדר במשך 60 דק. הסר את הכובע, לרוקן את הפתרון על ידי דחיפת הבוכנה.
    5. רחץ השרף על-ידי הוספת 1 מ"ל DMF לזעזע את הכלי עבור 1 דקות, מרוקן את הפתרון על ידי דחיפת הבוכנה. רחץ השרף על ידי ציור 1 מ"ל DCM, לזעזע עבור 1 דקות, מרוקן את הפתרון. רחץ DCM עוד פעם אחת, ואחריה כביסה עם DMF פעמיים.
    6. חזור על מחזורי תוספת מונומר מצעדי 1.3.2 כדי 1.3.5 כדי ליצור Nae-(Npe-Nme)4-שרף. כאשר חוזרים לשלב של תגובת הדחק (1.3.4), להשתמש פתרון אמין ספציפיים בהתאם לרצף peptoid.
      הערה: השרשרת peptoid מוארכת מ קצה קרבוקסילי קצה אמיני עם השאריות C-מסוף מאוגד שרף.
    7. לבצע acetylation N-מסוף כדי ליצור Ac-Nae-(Npe-Nme)4-שרף.
    8. שילוב של µL 92 אצטי, 43.5 µL של N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) ו- 2 מיליליטר DMF בתוך לעשות בערך 2 מ ל acetylation קוקטייל.
    9. להוסיף 2 מ של acetylation קוקטייל כלי המכיל שרף, קפטן הספינה, להתסיס זה בטמפרטורת החדר במשך 60 דק. הסירי את הפקק ולנקז את הפתרון על ידי דחיפת הבוכנה.
    10. רחץ השרף על-ידי הוספת 1 מ"ל של DMF לזעזע את הכלי עבור 1 דקות, מרוקן את הפתרון על ידי דחיפת הבוכנה. רחץ השרף על-ידי הוספת 1 מ"ל של DCM לזעזע את הכלי עבור 1 דקות, מרוקן את הפתרון. חזור על שטיפת השרף עם DCM פעם נוספת ולאחר מכן לשטוף עם DMF עוד פעמיים.
    11. רחץ השרף על-ידי הוספת 1 מ"ל של DCM לזעזע את הכלי עבור 1 דקות, מרוקן את הפתרון על ידי דחיפת הבוכנה. חזור על כביסה עם DCM פעמיים. הסירי את הפקק, נתנו השרף מילה נהדרת בתוך הכלי התגובה למשך 10 דקות.
  4. פצילות וטיהור
    1. מערבבים מ 3.8 ל TFA 100 µL של triisopropylsilane (טיפים), 100 µL של HPLC-כיתה ח2O בתוך לעשות 4 מיליליטר המחשוף קוקטייל.
    2. להוסיף 4 מיליליטר טריות המחשוף קוקטייל לכלי השיט המכילים שרף, קפטן הספינה, להתסיס זה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
    3. הסירי את הפקק ולאסוף את הפתרון פילטרט של תוך שפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן 50 מ. להוסיף 1 מ"ל של TFA לכלי השיט, וחוץ מזה, להתסיס עבור 1 מינימלית לאסוף הפתרון פילטרט של תוך הצינור צנטריפוגה אותו.
    4. להתנדף TFA על ידי פיצוץ בזרם של גז חנקן בעדינות עד כ 1 מ"ל פתרון צמיגה שנשאר.
    5. להוסיף 15 מ"ל של דיאתיל אתר הפתרון הנותרים, קאפ הצינור צנטריפוגה ולאחר דגירה אותו במקפיא-20 ° C עבור 2 h ללון. Peptoid גולמי ארגונייט שוקע לבן מוצק.
    6. גלולה המוצק באמצעות צנטריפוגה ב 4,427 x g עבור 10 דקות להסיר את הכובע של הצינור צנטריפוגה, decant דיאתיל אתר לתוך גביע בזהירות מבלי לאבד את המוצק.
      זהירות: דיאתיל אתר היא הממס האורגני דליק. אנא השתמש צנטריפוגה בטוח דיאתיל אתר.
    7. שטיפת המוצק על-ידי הוספת 10 מ"ל של דיאתיל אתר קר כקרח לתוך צנטריפוגה הצינור המכיל המוצק, מיצוי הצינור, והצבתו בצנטריפוגה. בצע צנטריפוגה ב 4,427 x g עבור 10 דקות להסיר לצנטריפוגה צינור מ לצנטריפוגה ו decant דיאתיל אתר לתוך גביע בזהירות מבלי לאבד את המוצק.
    8. יבש המוצק על ידי פיצוץ בעדינות בזרם של גז חנקן.
    9. להוסיף 10 מ של HPLC-כיתה ח2O להתמוסס המוצק מיובשים. עוברים את הפתרון דרך מסנן מזרק ניילון עם גודל הנקבוביות של 0.45 מיקרומטר, לאסוף את פילטרט של תוך שפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן מראש משוקלל 50 מ.
    10. מעטפת להקפיא את הפתרון על ידי הצבת וסיבוב צנטריפוגה שפופרת המכילה הפתרון peptoid בכוס 12 אונקיות, מוערם כפול המורחב פוליסטירן 1/3 מלא עם חנקן נוזלי. Lyophilize הפתרון קפוא במשך הלילה להניב peptoid מוצק.
    11. אני חוזר lyophilization עוד פעם אחת על ידי המסת את peptoid מוצק לתוך 10 מ"ל של HPLC-כיתה ח2O, מעטפת קפוא חנקן נוזלי, lyophilizing לילה. Peptoid שנוצר הוא מספיק טהורות רצף ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה.

2. MS מדידות וניתוח רצף

הערה: הניסוי MS/MS מתבצעת בספקטרומטר טריפל-פאול מצמידים אל מקור יינון (ESI) ספקטרומטריית electrospray. איסוף נתונים נשלטת באמצעות התוכנה רכישת נתונים מלווה עם המכשיר. ההליך כללי כולל 1) ביצוע הניסוי ספקטרומטר מסה הסריקה המלאה ואת הקלטת הספקטרום המוני, 2) ביצוע CID MS/MS הניסוי הקלטה הספקטרום MS/MS ו 3) השוואת הנתונים MS/MS ספקטרלי עם תיאורטי פיצול ערכת החזוי בהתבסס על התכונה מבנית של peptoid.

  1. הכנת המדגם פתרון
    1. שוקלים לצאת 1.0-2.0 מ ג peptoid מוצק בתוך בקבוקון זכוכית 3-5 מ. להוסיף 1 מ"ל מעורב הממס acetonitrile ומים (לחצן מצוקה/H2O, 1:1, וי/v) כדי להמיס את peptoid. זה נותן את הפתרון מדגם מניות עם ריכוז של-10-3 מ'.
    2. להעביר 20 µL של פתרון מניות לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל מעורב הממס של לחצן מצוקה/H2O להניב פתרון מדולל מדגם של-10-5 מ'.
    3. הסר כל החלקיקים לא מסיסים אפשרי הפתרון מדולל לדוגמה על-ידי ביצוע צנטריפוגה ב 4,427 x g במשך 3 דקות להעביר כ-700 µL של החלק העליון של הפתרון לתוך צנטריפוגה 1.5 mL עוד צינור כדי להפוך peptoid MS הפתרון עובד עם ריכוז של-10-5 מ'.
    4. התאם את הריכוז של הפתרון עובד MS בהתבסס על עוצמת האות נצפתה במהלך המדידות ספקטרומטר מסה.
    5. דרך חלופית כדי להסיר את כל החלקיקים לא מסיסים אפשרי בפתרון מדגם מדולל היא לעבור את הפתרון מדגם מסנן מזרק מיקרומטר 0.20 לאסוף את פילטרט של תוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL כדי להפוך peptoid MS הפתרון עובד של בערך 10-5 מ'.
  2. הקלטה ספקטרה המונית
    1. לרוץ הממס מעורבות של לחצן מצוקה/H2O (1:1, וי/v) דרך המקור יינון (ESI) ספקטרומטריית electrospray ולהגדיר את המכשיר יון חיובי סטנדרטי, סריקה מלאה במצב ספקטרומטר מסה עם מגוון יחס מסה-כדי-אחראי (מ/z) של 100-1500.
      הערה:
      פרמטרי הפעלה טיפוסית:
      ESI המחט מתח, 5 kV
      צינור קפילר מתח, 40 V
      ייבוש גז (גז חנקן) בטמפרטורה 200 מעלות צלזיוס.
    2. להוסיף כ- 300 µL של הפתרון עובד peptoid MS (10 כ-5 מ') µL 500 או מזרק 1 מ"ל וחבר את המזרק לים ESI באמצעות נימי פוליאטר אתר קטון (פיק) אבובים. להציב את המזרק לתוך למשאבה מזרק ולהגדיר את קצב הזרימה ב- µL 10/דקה כדי להשרות את הפתרון מדגם לתוך הים ESI.
    3. להפעיל את המתח המחט ESI כדי להפעיל את תהליך ESI ולאחר מכן הפעל את הגלאי. להגדיר את תצוגת מצב פרופיל וממגוון 100-1,500 מ'/z. הצג פרופיל ספקטרום המוני שמוצג בחלון פרופיל. הפסגה-מ/z 1,265 (מוצג מ/z של 1,264.6) מקביל peptoid יון או protonated peptoid.
    4. שיא הקשת MS למשך 2 דקות. בחלון של"השיטה", להשתמש 2 דקות כמו "זמן ריצה". פתח את החלון הקלטה ולמלא שם קובץ נכונה, וכן להתחיל להקליט את הספקטרום.
      הערה: הספקטרום המוני וכתוצאה מכך מוצג באיור3.
    5. למטב את האינטנסיביות של הפסגה-מ/z של 1,265. להגדיר את הטווח מ/z כדי 1,150-1,350 ולהתאים את המתח נימי בעת הצגת עוצמת שיא ב mV שמוצג בחלון פרופיל. לדוגמה, תגביר את המתח נימי 50 V או גבוה יותר ולהציג את השינוי של עוצמת שיא. עוצמת שיא אופטימלית היא בסביבות 150-200 mV.
      הערה: כוונון המתח נימי יכול לשנות באופן משמעותי השפע של יונים מסויימים. הגדלת המתח נימי עשוי לשפר את עוצמת יון peptoid. עם זאת, נימי מתח גבוה עשוי גם זירוז דיסוציאציה של יונים peptoid במקור יון, להקטין את עוצמת שנצפו. התאמת הטמפרטורה של ייבוש גז עשוי לשפר את האינטנסיביות של הפסגה-מ/z 1,265, אבל זה פחות יעיל מאשר התאמת המתח נימי. אם הפסגה-מ/z 1,265 לא מגיעים עוצמת אופטימלית, להתאים את הדגימה ריכוז (או דוגמה, להכפיל את הריכוז של הפתרון עובד MS).
    6. להחליף את המכשיר למצב MS/MS. הגדר את יון קודמן-מ/z 1,265, MS/MS המונית, כוון מ/z של 100-1400. בחלון"שיטה", שתשמש מ/z 1,265 "Q1 הראשון המסה" ולהשאיר "ש1 אתמול המסה" ריק. כדי להשתמש מ/z 100 "המיסה הראשונה Q3" מ/z 1,400 כמו "Q3 האחרון למיסה"
      הערה: במצב MS/MS, הפונקציות יחידה (Q1) פאול הראשון כמסנן המונית כדי לבודד את יון peptoid כמו יונים קודמן, יחידת פאול השני (Q2) הוא תא התנגשות, הפונקציות יחידה (Q3) פאול השלישי בתור מנתח המוני.
    7. סט מן האנרגיה התנגשות 40 eV והגז התנגשות (ארגון, במקרה זה) לחץ על 1.5 mTorr.
    8. הצג פרופיל ספקטרום המוני מוצג בחלון פרופיל. הפסגה-מ/z של 1,265 מקביל יון peptoid, הפסגות עם ערכים נמוכים יותר מ/z מייצג את השברים של יונים peptoid.
    9. התאם את אנרגיית התנגשות כדי למטב את התצוגה של הספקטרום פיצול. לדוגמה, להגביר את האנרגיה התנגשות 45 eV ולהציג את השינוי של הפרופיל הספקטרום.
      הערה: באופן כללי, הגברת האנרגיה התנגשות לשפר את השפע של היונים פרגמנט ולהפחית השפע של יונים peptoid. הגדלת לחץ הגז התנגשות יהיה לשפר גם השפע של היונים פרגמנט.
      התראה: אין להגדיל לחץ הגז התנגשות מעבר 2 mTorr.
    10. שיא הקשת MS/MS למשך 2 דקות. בחלון"שיטה", להשתמש 2 דקות כמו "זמן ריצה". פתח את החלון הקלטה ולמלא שם קובץ נכונה, וכן להתחיל להקליט את הספקטרום.
    11. חזור על הקלטה 1 - 2 פעמים.
  3. ניתוח רצף Peptoid
    הערה: תחת התנאי סיד, יון peptoid קטע על הקשרים אמיד לאורך עמוד השדרה peptoid לייצר סדרה של N-מסוף קטעים בשם B-יונים, ואת סדרת C-מסוף שברי בשם Y-יונים
    1. למשוך החוצה את המבנה הכימי של peptoid acetylated על-ידי הצבת את קצה אמיני בצד שמאל, את קצה קרבוקסילי בצד ימין, לצייר קו מקווקו על כל בונד אמיד כדי ליצור ערכת פיצול כפי שמוצג באיור 2a. צייר פרוטון עם עיגול מקווקו כדי לציין את נושא מטען. החל מן הצד השמאלי של המבנה, במקום תוויות על קווים מקווקווים כדי לציין השברים N-מסוף B1, B2, B8. החל מן הצד הנכון, במקום תוויות על קווים מקווקווים כדי לציין השברים C-מסוף כמו Y1, Y2, Y8.
      הערה: תוכנת הציור כימי יכול להיות מנוצל כדי לצייר את מבנה peptoid.
    2. לדמיין פיצול בכל בונד אמידth 4 מצד שמאל, וצייר את המבנים של מהרסיס N-מסוף, השבר C-מסוף עם אישום נכונה, כפי שמוצג באיור 2b. במקום התווית של B4 על השבר N-מסוף, ומניחים את התווית של Y5 על השבר C-מסוף. לחשב את ערך מ/z של B4 על-ידי סיכום ההמונים הנומינלי של היסודות במבנה להניב ערך של 580, במקום 580 מ/z על השבר N-מסוף. לחשב את ערך מ/z של Y5 והנח מ/z 685 על השבר C-מסוף.
    3. לחשב את ערכי מ/z עבור כל שמונה B יונים, יונים כל Y שמונה, ולהרכיב מהם בטבלה, כפי שמוצג בטבלה 1.
      הערה: הערכים מ/z של השברים ניתן לחשב באמצעות חומר כימי תוכנת ציור.
    4. פתח את קשת MS/MS מוקלטות peptoid באמצעות התוכנה סקירה נתונים מלווה עם המכשיר. הגדר את העדפות תיוג "הצג יון תוויות" ואת תווית הסף ל-3%. זה יוצר קשת MS/MS עם ערכים מ/z עם התווית על הפסגות.
    5. לייצא את MS/MS נתונים ספקטראליים כקובץ טקסט בתבנית CSV לעצב, לשחזר את הספקטרום באמצעות תוכנת עיבוד נתונים. במקום ערכים מ/z על הפסגות. הספקטרום המתקבל MS/MS מוצג באיור4.
      הערה: כמה ספקטרומטרים המונים הינם מצוידים עם יכולת עיבוד נתונים תוכנה ליצירת הספקטרום MS/MS. במקרה זה, ייצוא נתונים ספקטרלי של MS/MS אין צורך.
    6. הקצה את הערכים מ/z שמוצג על הספקטרום MS/MS לאלו המוצגות בטבלה 1 כדי לזהות את המקביל B - ו Y-יונים. לדוגמה, הפסגה-מ/z 580 מזוהה B4-יון ו- m/z 685 מזוהה Y5-יון. תווית הפסגות עם סימנים B ו- Y מקבילים על הקשת, כפי שמוצג באיור4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מבנה peptoid 9-מר עם acetylation N-מסוף, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, מוצג באיור1. Peptoid היה מסונתז באופן ידני מגרגרי התגובה פוליפרופילן fritted דרך הגישה מעבדתי. שרף אמיד רינק (0.047 mmol, 84 מ ג עם טעינת 0.56 mmol/g) משמש את התמיכה מוצק להניב את peptoid עם amidated קצה קרבוקסילי. שרשרת peptoid זה נב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, יש להיות מסונתז באמצעות פרוטוקול שהוצג. מנגנון סינתזה כרוך כלי דמוי מזרק פוליפרופילן מוצק-שלב התגובה מטרף מכני. כלי התגובה הם זמינים מסחרית בעלות נמוכה. מכני מטרף הוא מנגנון משותף במעבדות הכימיה. עם השימוש של כלי דמוי מזרק התגובה, פתרונות יכולים להיות נשא?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות מר מייקל קונלי, ד ר רונלד צוקרמן (יציקה מולקולרית, המעבדה הלאומית לורנס ברקלי) על טכניקה תמיכה סינתזה peptoid. אנו להכיר התמיכה של הקרן הלאומית למדע (צ'ה-1301505). ספקטרומטר מסה כל הניסויים נערכו במתקן ספקטרומטר מסה של הכימיה באוניברסיטה של האוקיינוס השקט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320LAgilent Technologies Inc.The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.
Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review softwareVarian Inc.The software is a part of the Varian 320L package
Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DDFisher Scientific International Inc.14-400-126
Hermle Centrifuge, Model Z 206 AHermle Labortechnik GmbH
Solid phase reaction vessel, 10 mLTorviqSF-1000
Pressure caps for reaction vesselsTorviqPC-SF
Syringe filters, pore size 0.2 μmFisher Scientific Inc.03-391-3B
Syringe filters, pore size 0.45 μmFisher Scientific Inc.03-391-3A
Polypropylene centrifuge tuges, 50 mLVWR International, LLC.490001-626
Polypropylene centrifuge tuges, 15 mLVWR International, LLC.490001-620
ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0CambridgeSoft CorporationCambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.
Styrofoam cup, 12 OzCommon Supermarket
Rink amide resinChem-Impex International, Inc.10619
PiperidineChem-Impex International, Inc.02351Highly toxic
N, N’-diisopropylcarbodiimideChem-Impex International, Inc.00110Highly toxic
Bromoacetic acidChem-Impex International, Inc.26843Highly toxic
2-PhenylethylamineVWR International, LLC.EM8.07334.0250
2-MethyoxyethylamineSigma-Aldrich Co. LLC.241067
N-Boc-ethylenediamineVWR International, LLC.AAAL19947-06
Acetic anhydrideSigma-Aldrich Co. LLC.252845
N, N-dimethylformamideVWR International, LLC.BDH1117-4LGFurther distillation before use
N, N-diisopropylethylamineChem-Impex International, Inc.00141
TriisopropylsilaneChem-Impex International, Inc.01966
Trifluoroacetic acidChem-Impex International, Inc.00289Highly toxic
Millipore MILLI-Q Academic Water Purification SystemMillipore CorporationZMQP60001For generating HPLC grade water
HPLC-grade WaterProduced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System
MethanolPharmco-Aaper339USP/NFHPLC grade
AcetonitrileFisher Scientific International, Inc.A998-4HPLC grade
Diethyl etherVWR International, LLC.BDH1121-19LFurther distillation before use
DichloromethaneVWR International, LLC.BDH1113-19LFurther distillation before use
Nitrogen gasFresno Oxygen/Barnes SupplyNIT 50-C-FUltra high purity, 99.9995%
Argon gasFresno Oxygen/Barnes SupplyARG 50-C-FUltra high purity, 99.9995%

References

  1. Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
  2. Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
  3. Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  4. Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
  5. Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
  6. Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
  7. Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
  8. Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
  9. Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
  10. Lutz, J. -F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), Washington, DC. 628(2013).
  11. Altuntas, E., Schubert, U. S. "Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
  12. Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
  13. Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
  14. Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
  15. Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
  16. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
  17. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
  18. Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
  19. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373(2011).
  20. Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
  21. Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
  22. Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
  23. Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132PeptoidN alkylatedYB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved