JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אסטרטגיות טיפוליות הרומן של רפואה רגנרטיבית הלב דורשים מקיף ומפורט הלימודים במודלים של בעלי חיים פרה גדולה לפני שהם יכולים להיחשב לשימוש בבני אדם. כאן, נדגים שיטה הזרקת intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית בארנבים, וזה יקר עבור בדיקת יעילותם של טיפולים חדשניים כאלה השערות.

Abstract

תא טיפול גנטי מרגש, אסטרטגיות מבטיח לצורך התחדשות לב בהגדרה של אי ספיקת לב עם הקטינה שבריר פליטה (HFrEF). לפני שהם יכולים להיות נחשב לשימוש, מיושמת אצל בני אדם, מחקרים מקיפים פרה נדרשים במודלים של בעלי חיים גדולים כדי להעריך את הבטיחות היעילות, גורל injectate (למשל, תאי גזע) נמסר פעם לתוך שריר הלב. מודלים מכרסם קטן להציע יתרונות (למשל, עלות יעילות, amenability עבור הנדסה גנטית); עם זאת, בהתחשב במגבלות הטבועה של מודלים אלה, הממצאים הללו לעיתים רחוקות לתרגם למרפאה. לעומת זאת, מודלים בעלי חיים גדולים כגון ארנבות, יש יתרונות (למשל, דומה אלקטרופיזיולוגיה לב לעומת בני אדם וחיות גדולות אחרות), תוך שמירה על איזון טוב חסכונית. . הנה, נדגים כיצד לבצע טכניקה הזרקה (ממ י) intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה מלעורית ניגודיות, אשר פולשנית, בטוח, נסבלת היטב, ויעיל מאוד בהעברת injectates, כולל תאים, יישוב לתוך מספר מיקומים בתוך שריר הלב של דגם ארנב. לביצוע ויישום טכניקה זו, גם לקחנו יתרון של מערכת אקוקרדיוגרפיה קליני נרחב זמין. לאחר הצבת בפועל את הפרוטוקול המתואר כאן, חוקר עם אולטרסאונד הבסיסיות ידע יהפוך המוסמכת. הביצועים של טכניקה זו תכליתי ולא פולשנית לשימוש שגרתי בניסויים, מכוון לבדיקת השערות יכולות של הלב הרפוי משובי במודל ארנב. ברגע כשירות מושגת, ניתן לבצע את כל התהליך בתוך 25 דקות לאחר anaesthetizing את הארנב.

Introduction

טיפולים אלטרנטיביים תא ג'ין מרגש, אי לפתח אסטרטגיות עבור התחדשות/תיקון של שריר הלב נפגע ב- HFrEF. מעט מחקרים משווים את יעילות המסלולים שונים המסירה תאים, אשר הדגימו באופן עקבי העליונות של ממ י על מסלולים intracoronary או תוך ורידי1,2 (למשל, תא שימור שיעור) , 3 , 4 , 5. לפיכך, אין זה מפתיע כי אחוז גדול של מחקרים על מודלים translational של טיפול בתאי גזע של שריר הלב הפצוע, לספק את injectate באמצעות ממ י תחת נוף ישיר החזה נוהל6,7 . עם זאת, גישה זו יש מספר מגבלות, כולל העיקרון החודרני של ההליך, אשר נושאת את הסיכון לתמותה פרי-נוהלי (לעתים קרובות לפי דיווח)8. בנוסף, אימי תחת תצוגה ישירה לא לשלול את האפשרות להזרקה בהיסח הדעת לתוך חלל חדרית. בפרקטיקה הקלינית אימי במהלך ניתוח החזה פתוח יכול להיות שיטה המתאימה עבור משלוח תא טיפולית, למשל, במהלך עורקים מעקפים שתל (CABG); עם זאת, גישה זו יתכן המתאים למסירה תא שריר הלב העולמית ממוצא שאינו-איסכמי (למשל, HFrEF משני בהשפעה anthracycline של שריר הלב (AICM)).

אין כל ספק כי מחלת לב איסכמית (IHD) הוא הגורם הנפוץ ביותר של HFrEF (~ 66%)9,10; עם זאת, שריר הלב-איסכמי, כולל AICM, עדיין משפיע שיעור משמעותי של חולים עם HFrEF (33%)9 . אכן, התפתחויות אחרונות לאונקולוגיה קלינית גרמו יותר מ-10 מיליון ניצולי סרטן בארה ב לבד11, עם הערכות של מספר דומה באירופה, בקנה אחד עם המגמה הכללית לקראת שיפור ההישרדות של חולי סרטן12 ,13. לפיכך, חקר את היתרונות של טיפולים חדשניים כגון השתלת תא גזע-איסכמי של שריר הלב, כמו גם את trialing של מסלול יעילה ולא פולשנית של תאי גזע משלוח הוא בעל חשיבות עליונה, בהתחשב הגדלת מספר מטופלים מושפע cardiotoxicity משני תרופות נגד סרטן.

ראוי לציין, בדיקת מחקרים באמצעות טיפול בתאי גזע שמטרתה תיקון/להתחדש שריר הלב נפגעים לעתים קרובות השערות כרוכה בשימוש של מכרסם קטן (למשל, עכברים וחולדות). מודלים אלה לעיתים קרובות דורשים מערכות סאונד בתדירות גבוהה יקר עבור הערכה של תפקוד שריר הלב, מצוידים בדרך כלל מתמרים ליניארי מערך אשר יש כמה מגבלות המשויך הטבועה (למשל, ההד)14. עם זאת, מודלים אחרים כגון ארנבות, המייצג דגם פרה גדול, יש כמה יתרונות עבור בדיקת השערות של תאי גזע טיפולים ב- HFrEF. לפיכך, בניגוד חולדות ועכברים, ארנבים לשמור על מערכת התחבורה+2 Ca ואלקטרופיזיולוגיה הסלולר הדומה לזה של בני אדם אחרים חיות גדולות (למשל, כלבים וחזירים)15,16,17 18, ,19. יתרון נוסף, הוא amenability שלהם עבור הלב אולטראסאונד הדמיה באמצעות זול יחסית אקוקרדיוגרפיה קליני נרחב זמין מערכות מצויד עם מערך שלב מתמרים יחסית בתדירות גבוהה, למשל, 12 מגה הרץ, כגון אלה נעשה שימוש תכוף בקרדיולוגיה neonatal, רפואת ילדים. מערכות אלו מאפשרות הדמיה echocardiographic מעולה עם טכנולוגיה משוכללת, הם מנצלים העליונות של הרמוני הדמיה20. יתר על כן, בדיקת השערות נרחב של הפוטנציאל של טיפולים משובי הלב (למשל, טיפול בתאי גזע), שלהם בטיחות, יעילות, cardiomyogenic הפוטנציאל, כמו גם הערכה על גורלם של injectate פעם העבירה שריר הלב, הוא חובה לפני שהם יכולים להיחשב לשימוש בבני אדם, הם דורשים השימוש במודלים בבעלי חיים פרה גדולה, כמו ארנב17,19. כאן, אנו מתארים טכניקה פולשנית עבור תא משלוח באמצעות ממ י מלעורית חדות-אקוקרדיוגרפיה מודרכים באמצעות מערכת אקוקרדיוגרפיה קלינית, אשר מיועדת בטיפול המבוסס על השתלת תאי גזע של שריר הלב-איסכמי20 . גם אנו מתארים את היתרונות של דיות (InI, הידוע גם בשם סין דיו) כמו אולטרסאונד ניגודיות סוכנת וגם בחיי עיר מעקב של injectate בלב ארנב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הניסויים המתוארים בזאת אושרו על-ידי ועדת מחקר האתית של אוניברסיטת מורסיה, ספרד, ולא בוצעו על פי הוראה 2010/63/האיחוד האירופי של הנציבות האירופית. השלבים המתוארים בוצעו תחת פרוטוקולים סטנדרטיים ההפעלה היו חלק מתכנית העבודה, לא בוצעו אך ורק למטרת לצלם את הוידאו המלווה את הנייר הזה.

1. הכנת התאים ואת הביטוי בתרבית של וקטור

הערה: הנה, אנחנו תאר בקצרה פרוטוקול הכנה, תרביות תאים של קו תא (עובריים כליה אנושית 293 (HEK-293)); עם זאת, תאים מתאים פרוטוקולים ספציפיים עבור סוג התא עניין צריך להיות ממוטבת (למשל, תאי גזע).

  1. לשמור על תאים HEK-293 גלוקוז גבוהות Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר (DMEM) בתוספת 10% עגל עוברית סרום (FCS) 1% נתרן פירובט, 2 מ מ גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2 . ברגע תאים הם תת confluent, לפצל ביחס של 1:3.
  2. להתחיל פיצול התאים על-ידי כ רפה בעברית התקשורת, ולאחר מכן לשטוף פעם עם פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS), להסיר את עודף PBS ולאחר מכן דגירה עם 2.5 מ של 0.5 x טריפסין-Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (5 דקות, 37 ° C).
    1. הוסף אמצעי אחסון אחד של DMEM מדיה (בתוספת כמתואר לעיל) כדי לעצור את התגובה ולאחר מכן לנתק את התאים על ידי לאט ובעדינות כ רפה בעברית למעלה ולמטה עם פיפטה אלקטרונית.
  3. אז, העברת התליה תא לגורם המתאים (למשל, צינור חרוטי צנטריפוגה 15-50 מ"ל). צנטריפוגה בדלי סווינג (100 x g), למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את גלולה פעמיים עם PBS סטרילי.
  4. Resuspend בגדר בזרע-צפיפות תאים מתאים (למשל, עונה 1 פרק 106 תאים בקבוקון2 75 ס מ) ומדיה DMEM טריים טריים תרבות מבחנות או מנות גדולות על פי שיטות מעבדה מקומיים.
    1. החלף קיימת מדיה media טריים כל יומיים.
      הערה: וקטור הביטוי היה נגזר pIRES1hyg, נעשה בהתאם להוראות היצרן כפי שתואר לעיל21. p(EGFP) IRES1hyg נוצר על ידי subcloning EGFP cDNA כמו BamHI + NotI הכניסו אל BamHI pEGFP-N1 + NotI מתעכל pIRES1hyg21.
  5. יום אחד לפני תרביות תאים, זרע HEK-293 תאים-צפיפות של 0.5 x 10 תאים/ס מ5 2 ב 12 או 24-ובכן תרביות רקמה צלחות.
  6. ביום של תרביות תאים, להכין את ה-DNA-השומנים תרביות תאים ריאגנט מתחמי mL 1.5 נפרד microcentrifuge צינורות (צינור 1/טוב).
    1. התחל בהוספת 250 µL של מדיום מופחת סרום לתוך כל שפופרת, ולאחר מכן להוסיף 4 µg דנ א (לערבב בעדינות).
    2. לאחר מכן, להוסיף 250 µL מן תערובת מוכנה בעבר של 10 µL השומנים תרביות תאים ריאגנט µL 250 של מדיום מופחת סרום, כל שפופרת (לערבב שוב בעדינות).
    3. לבסוף, המשך עם transfections, על ידי המקננת HEK-293 תאים עם ה-DNA השומנים תרביות תאים ריאגנט קומפלקסים 4h, להחליף בינוני DMEM בתוספת כמתואר לעיל (שלב 1.1), ואת תקופת דגירה של ה 48 עוד סמים לבצע מבחר יציבה transfectants עם µg/mL 100 hygromycin B.
  7. ניתוק HEK-293 תאים עם טריפסין כמתואר לעיל (שלב 1.2). לאחר שטיפת התאים ב- PBS סטרילי, resuspend בתוך כלי רכב מתאים (למשל, 10% v/v InI ב- PBS), כדי להשיג ריכוז תא הסופי של 5 x 106/mL.

2. הכנת הארנב

הערה: המיקום של הארנב, המתמר עבור ממ י אינה אופטימלית להערכת המורפולוגיה ותפקוד הלב של החיה. לכן, מומלץ לבצע בדיקה echocardiographic מלאה20 לפני ממ י (ראו להלן), בנקודות זמן הבאים כפי שהוגדרו על ידי הנבחנים. זה במטרה להעריך בסיסית אנטומי פונקציונלי המאפיינים של הלב החיה כי לקבל זריקה, ואת גם להעריך את ההשפעות, של אימי בפונקציה של הלב.

  1. לבצע בדיקה זו באופן עיוור ובעקבות להנחיות הועדה אקוקרדיוגרפיה של המכללה האמריקאית של רפואה וטרינרית פנימית של החברה של אקו/אירופה האגודה האמריקאית הדמיה לב וכלי דם 22 , 23 , 24.
  2. לקבל עקיבה 1-עופרת סימולטני רל (א) לאורך כל תקופת המחקר echocardiographic לגמרי.
  3. עזים ומתנגד הארנבת עם קטמין 10 מ"ג/ק"ג, בשילוב עם medetomidine 200 µg/kg, זריקה תוך שרירית (I.M.).
  4. ודא הרמה של הרדמה לאחר 10-20 דקות בעקבות ניהול של הרדמה.
  5. שימוש שיער clipper להסיר את שיער החזה נרחב (למשל, מתחת לצוואר באזור תת xiphoid) (איור 1 א').
  6. לגלח אזורים נוספים של 1-2 ס מ2 בפנים פנימי של forelimb נכון (אזור mediocubital) ושל שני הגפיים האחוריות (אזור mediotibial) (איור 1B).
  7. במקום אלקטרודות א דבק על האזורים מגולח של הגפיים לנטר את קצב הלב באופן סינכרוני במהלך ההליך (איור 1C).
  8. מקום החיה במצב פרקדן כסאות גלגלים על שמיכה תרמית, עם הגפיים מתוחות באמצעות הדבקה מצורף לטבלה (איור 1C).
    1. ודא שהאוזניים הם מכופפות לאחור מאחורי הראש/הגב של הארנב, במיקום זה נמוך יותר forelimbs שלה, מאז זה מסייע לשמור על מיקום נכון של בית החזה של החיה לאורך כל ההליך.
  9. לאפשר את החיה לנשום באופן ספונטני תוך מתן חמצן על ידי מסכת פנים לאורך כל התהליך (100%, 2-3 L/min).

figure-protocol-4994
איור 1. הכנה של הארנב ממ י. (א) קליפ שיער של בית החזה; (B) קליפ שערה גפיים; (ג) לצרף אלקטרודות ומקם את הארנב עם רגליים פרושות לפנים על שמיכה תרמית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. מלעורית ניגודיות מונחה אקוקרדיוגרפיה ממ י טכניקה הארנב

  1. לנקות ולחטא את העור של בית החזה עם פתרון chlorhexidine מבוסס.
    1. השתמש של הטכניקה aseptic לאורך כל התהליך, לפי מומלצת הנוכחי.
    2. במידת האפשר, אם מעשית סבירה, לבצע הליך סטרילי לחלוטין, לרבות אך ללא הגבלה, השימוש בחומר סטרילי כגון שמלות, כפפות, פעירת, וילונות סטרילי הלביש חומר עבור הטבלה, כמו גם של אולטרסאונד סטרילי כיסוי מתמר ואולטרסאונד סטרילי ג'ל. זה יהיה להפחית עד למינימום את הסיכון של היכרות עם פתוגנים לחיה קבלת תעש, הוא יאושם בהגדרה קלינית (למשל, במהלך חדירה הלב).
      הערה: מומלץ להמשיך תמיד בקנה אחד עם תקנות מקומיים וארציים של מחקר בבעלי חיים החלים על המוסד המקומי ואת ארץ בפועל.
  2. חלות ג'ל שידור אולטרסאונד בחזה ו/או המתמר, ועל עם חוט מתמר מסביב לצוואר של הנסיין, לבצע סריקה מהירה חלון של הלב של בעל החיים, אשר לעיתים קרובות שימושי כדי להמחיש אנטומיה וכדי לתכנן ממ י.
  3. למקם את המתמר באופן ידני 4ה-6th לחלל הבין-צלעי, 2-3 ס מ מקו מתחת נכון עם שכיחות של זווית של ~ 90 ° ביחס בצד הימני של הקיר בית החזה (איור 2 א).
  4. להתאים את המיקום של המתמר ביחס לחלל הבין-צלעי את וכן שלה anteroposterior, זווית dorsoventral כדי למטב את נוף ששונה ציר קצר ברמה של השרירים papillary. לזהות בתצוגה זו את החדר הימני (RV), החדר השמאלי (LV), interventricular מחצה (עירויים), קיר אחורי (PW), וכן anterolateral (אי אל) posteromedial (PM) השרירים papillary (איור 2B).
    1. יש שדה ראייה רחב על ידי הגדלת באופן משמעותי את עומק באמצעות הפקד המתאים במערכת (למשל, כפתור, החיוג).
    2. תשומת לב מיוחדת להשגת תמונה סימטרית תצוגה זו, כמו גם בידול המתאים של קווי endocardial, epicardial, במידת הצורך, התאם באמצעות פקדי מיטוב תמונה (למשל, רווח).
  5. לאחר התצוגה echocardiographic אופטימלית מתקבל (איור 2B), לשמור על עמדה זו במהלך המשך ההליך, בזמן אופרטור השני מבצע ממ י (ראו להלן).
    1. בעודכם מחזיקים המתמר, להימנע להסתיר את סימן התמצאות מתמר, אשר צריך תמיד להיות פונה קדימה, ובכך מאפשר יישור שלה עם המחט בצעדים העוקבים (איור 2 א, ג).
  6. עם מחט 24-G המצורפת מזרק 1 מ"ל, למקם את המחט קרוב לעור של hemithorax השמאלי במיקום שיקוף סימטרי ביחס המתמר. לאחר מכן, ידנית ליישר את המחט עם סימון התמצאות מתמר בזווית של ~ 90° (איור 2C), ולהתקדם לאט את המחט דרך העור, לתוך הפתח שבחזה.
    הערה: הכניסה מלעורית המחט נמצא במצב הזה כיוון מקלה על הפריט החזותי של המחט במישור של קרן אולטרסאונד (איור דו-ממדי, E), ובכך מאפשר ניטור בזמן אמת, ובמקרה הצורך, התאמת מיקום המחט יחסית לאזור היעד של שריר הלב (איור 2 G, H).
  7. עם הטיפ במיקום היעד, לאט לספק את injectate (עד 0.25 mL לכל ההזרקה) בתוך 10-30 s (איור 2E), בעוד לאט ובעדינות פותחים את המחט במהלך ההזרקה כדי להגדיל את היקף שריר הלב מטופלים.
    1. השתמש InI 10% (v/v) מדולל ב- PBS התקינה של הטכניקה, וכן מעקב בחיי עיר בזמן רכישת כשירות, כמו גם באשר לאשר מיקוד מוצלחת של כל האתרים ממ י ארבע בתוך שריר הלב על ידי פתולוגיה ברוטו ו- histopathology (ראה נציג תוצאות). ברגע כשירות מושגת, InI יכול להיות מוחלף על ידי סוכן ניגודיות אולטרסאונד מסחרי מתאים במקרה הצורך.
      הערה: משלוח של 10% (v/v) InI מדולל ב- PBS עם או בלי תאים התוצאות שריר הלב ב hyperechogenicity transmural (כלומר, מראה בהיר אקו) באתר היעד של הזרקה (איור 2E, F). ההאטה ארעי או האצה של קצב הלב, הקשורים התכווצויות חדרית מוקדמת (למשל, מבודד, זוגות מחורזים, שלישיות) הם נצפו לעתים קרובות אפילו מן המגע הראשון של המחט עם epicardium כמו גם במהלך ו/או זמן קצר לאחר ממ י. עם זאת, אין הפרעות קצב מסכנות חיים מפותחים, תופעות לוואי חריפה הן נדירות באמצעות עד 0.25 mL (1.25 x 106 תאים) של injectate לכל תעש ההזרקה (ראה נציג תוצאות ודיון.).
  8. לבצע שינויים עדינים בשכיחות של זווית של המחט לפי הצורך כדי להשלים זריקות של 0.25 mL לכל אחד מן האתרים תעש היעד ארבע (שלוש לפנות שמאלה חדרית חינם קיר (LVFW) ואחד עירויים).
  9. לאחר השלמת ההליך ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש, להעריך את קצב הלב (למשל, באמצעות טורי אק ג מעקב ו/או 24 שעות Holter אק ג) ולבצע סריקות echocardiographic טורי החלון כדי לוודא העדר סיבוכים, עד החיה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה, רק אז העברה לחדר מחזור אור.
    1. כאן, אנו משתמשים 24 שעות Holter אק ג כדי לנטר את ההשפעות של תעש עם ה-InI על קצב הלב במשך 24 שעות ביממה. בשביל זה, השווינו קבוצת ארנבים 6 עם פנוטיפ נורמלי (קבוצה רגילה) וקבוצה של ארנבים 6 קיבל עירוי לוריד של דוקסורוביצין (cardiotoxic anthracycline סם, משמש בדרך כלל לטיפול בסרטן; קבוצת DOX) במינון של 2 mg/kg/קיבל בשבוע 8 שבועות ולאחר מכן שני גדודים תעש עם ה-InI.

figure-protocol-10350
איור 2 . ניגודיות percutaneous הזרקה intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ב הארנב. (א) הצבת המתמר ב hemithorax נכון בזווית של ~ 90 °. (B) תמונת הנציגה של תצוגת ציר קצר מתחת (PSSX) של הלב ברמה של שרירי papillary הארנב. (ג) יישור של המחט בזווית של ~ 90 ° ביחס הסימן התמצאות מתמר. (ד) מיקום המחט באתר היעד בתצוגת PSSX של הלב (שים לב כי המחט הוא מדמיין בקלות במישור של קרן אולטרסאונד). (E ו- F) הפגנה של hyperechogenicity באתר היעד על intramyocardial הזרקת דיו הודו (ראשי חץ להדגיש את hyperechogenicity transmural). מיקום המחט בבית הבליעה LV מקרית (G) (ראשי חץ לסמן הפיר מחט). Repositioning (H) של המחט אל הקיר חינם LV (ראשי חץ לסמן הפיר מחט). RV = הימני; LV = החדר השמאלי; עירויים = מחצה interventricular; PW = הקיר האחורי; AL = שריר papillary anterolateral; PM = שריר papillary posteromedial. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. פוסט אימי ניתוחים

  1. לבצע ניתוח histopathological של דגימות רקמות הלב של ארנבים.
    1. לתקן רקמת במשך 24 שעות ביממה ב- 10% פורמלדהיד, ואחריו התייבשות עם הגדלת ריכוזי אתנול כדלקמן:
      • 1 x ב- 70% (60 דקות)
      • 1 x ב- 95% ethanol/5% מתנול (60 דקות)
      • 1 x 100% (60 דקות)
      • 1 x 100% (90 דקות)
      • 1 x 100% (120 דקות)
      הערה: כל incubations לעיל מתנהלים בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, תחליף פעמיים עם 100% קסילן (1h, RT), ולבסוף להטביע פרפין שני צעדים (60 דקות, 58 ° C)25.
    2. לבצע 4-5 מיקרומטר רקמות פרקים מיקרוטום25. הר מקטעים בשקופיות.
    3. לבצע צביעת ועם hematoxylin-אאוזין מאסון שיטות trichrome25,26,27.
  2. בסעיפים רקמות של לבבות המושתלים, לבצע אימונוהיסטוכימיה לזהות תאים EGFP(+) HEK-293 (למשל, באמצעות השיטה (ABC) מורכבים אבידין-ביוטין), בקצרה:
    1. מבטל את השעווה הלב בעובי 4-5 מיקרומטר ובסעיף קסילן 100% (10 דקות, ב- RT). נוזלים ברקמות בשטיפה עם הפחתת אתנול ריכוז פתרונות (2 x 100% (2 דקות) 2 x ב- 95% (2 דקות) ב 70% (2 דקות)-x 1; 1 x ב- 50% (2 דקות); 1 x ב- 30% (2 דקות); 1 x ddH2O (2 דקות)) ב- RT.
    2. לבצע peroxidase אנדוגני עיכוב על ידי מכסה את החלקים עם 100 µL 3% H2O2 מעורבבת עם מתנול (מוכנים עם 5 מ של תמיסת מניות 30% H-2-O-2, מתנול הוספת את הנפח הכולל של 50 מ ל) ( דגירה 30 דקות, RT), ולאחר מכן תשטוף על ידי טבילה בתמיסת טריס buffered (TBS; pH 7.6).
    3. לבצע אנטיגן חשיפת פרצופו האמיתי באמצעות טיפול אנזימטי, על ידי כיסוי הסעיפים עם 100 µL של 0.1% Pronase (המוכנים 0.01 גרם Pronase מעורבבת עם 10 מ"ל TBS) (דגירה 12 דקות, RT), ואז לשטוף עם TBS (5 דקות, RT).
    4. דגירה בחסימה פתרון (עז נורמלית בסרום ב-10% ב- TBS) משתמש µL 100 לכל שקופית (30 דקות, RT) ולאחר לשטוף עם TBS (5 דקות, RT).
    5. דגירה עם חלבון נמכרות עוף אנטי-ירוק (GFP) כמו נוגדן ראשוני (שבערך ב- TBS) (1h, 30 מעלות צלזיוס), לשטוף עם TBS (5 דקות, RT).
    6. דגירה עם נוגדן משני biotinylated עז-נגד-עוף IgG (1:250 ב TBS) (1h, 30 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן לשטוף עם TBS (5 דקות, RT).
    7. דגירה עם מתחם אבידין-ביוטין (20 דקות, 30 מעלות צלזיוס) ולאחר מכן צור תווית באמצעות 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 דקות).
    8. לבסוף, מייבשים על ידי שטיפה בהגדלת ריכוזי אתנול (ב 30% (2 דקות)-1 x 1 x ב- 50% (2 דקות); 1 x ב- 70% (2 דקות); 2 x ב- 95% (2 דקות); 2 x 100% (2 דקות)) ב- RT, סעיפים counterstain באמצעות שיטת hematoxylin-אאוזין25ולאחר מכן לטעון כיסוי שקופיות. כוללים חיובי, שלילי כמו גם שולטת isotype.
      הערה: פרוטוקול קצר המתואר לעיל אינו מיועד לשימוש כללי אימונוהיסטוכימיה; אופטימיזציה עבור הרקמה של הריבית ותנאי הכרחי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ניגודיות מלעורית מונחה אקוקרדיוגרפיה תעש עם ה-InI:

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, ולא פעם המיקום האופטימלי של קצה המחט אושר ע י אקו ואת הזריקה יזם, transmural hyperechogenicity נצפתה במהלך מסירת InI (10% v/v ב- PBS) (איור 2E) , כמו גם כמה ז...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המטרה העיקרית הייתה לפתח טכניקה מינימלית פולשנית שיכול לשמש למסירה של תאי גזע לתוך שריר הלב של ארנבים (בגודל פרה חיה דגם גדול)17,18, תוך ניצול השימוש זול יחסית זמינים רבים קליניים מערכת הדמיה מחקר מרכזי. כאן, אנו מראים, באמצעות מערכת אקוקרדיוגרפיה קליני, שנעזר ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים Monfort שילה, ברנדה מרטינס, קרלוס Micó, אלברטו מוניוס, מנואל מולינה על תמיכה מצוינת הניתנים במהלך איסוף של נתונים, קרלוס בואנו למתן את התאים EGFP(+) HEK-293. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי: Fundación Séneca, Agencia דה Ciencia y Tecnología, מוקדי דה מורסיה, ספרד (JT) (מענק מספר: 11935/פאי/09); אדום de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, דה PN השישי אני + D + אני 2008-2011 (מענק. לא. RD12/0019/0001) (JMM), שיתוף מימנה עם מבני מימון של האיחוד האירופי (פדר) (JMM); מאוניברסיטת רדינג, ארצות הברית (AG, ג'יגה-בתים) (מימון מרכזי). התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HD11 XE Ultrasound SystemPhilips10670267Echocardiography system.
S12-4PhilipsB01YgG4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212 over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringeBraun9161406V
Imalgene (Ketamine)MerialRN 9767Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)EsteveCN 570686.3Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99India (China) Ink
Holter SyneflashEla medicalSF0003044S24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®Ambu (NUMED)VLC-00-SHolter ECG electrodes.
MicrotomeLeica BiosystemsRM2155
MicroscopeOlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibodyInvitrogenA10262Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG AntibodyVector LaboratoriesBA-9010Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)DAKO (Agilent)S3000
Fluorescence MicroscopeCarl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Fisher Scientific11965084
10% fetal calf serum (FCS)Fisher Scientific11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)Fisher Scientific11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)Fisher Scientific31985070
Hygromycin BCalbiochem (MERCK)400051
Xylene (histological)Fisher ScientificX3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)SigmaH1009
PronaseFisher Scientific53-702-250KU

References

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23(2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342(2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. , Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149(2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594(2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. , e51566(2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902(2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131intramyocardial

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved