הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

Summary

הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.

Abstract

הרשתית היא רקמה מורכבת יוזם ו משתלב הצעדים הראשונים של חזון. תפקוד לקוי של תאים ברשתית מהווה סימן היכר של מחלות רבות מסנוור, טיפולים עתידיים-טיבית ההבנות הבסיסיות על הרשתית כמה שונה התאים לתפקד כרגיל. צובר מידע כזה עם שיטות ביוכימיות הוכיחו קשה כי תרומות של סוגי תאים מסוים הם הצטמצמו בחצרו תאים ברשתית. הדמיה רשתית חיה יכול לספק תצוגה של תהליכים ביולוגיים רבים על רמה של subcellular, בזכות מספר גדל והולך של מקודדים גנטית ביולוגיים פלורסנט. עם זאת, טכניקה זו כה הוגבלה ראשנים של הזחלים דג זברה, שכבות הרשתית החיצונית ביותר של הרשתיות מבודד, או הדמיה ברזולוציה נמוכה יותר של הרשתית בבעלי חיים. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת חיים שמחוץ ברשתית פרוסות של דג זברה למבוגרים עבור הדמיה בשידור חי דרך מיקרוסקופיה קונפוקלית. הכנה זו מניבה פרוסות רוחבי עם כל שכבות הרשתית ואת רוב סוגי תאים גלויים לביצוע ניסויים הדמיה קונאפוקלית באמצעות זלוף. דג זברה מהונדס לביטוי החלבונים פלורסנט או ביולוגיים סוגי תאים ברשתית מסוימים או organelles משמשים כדי לחלץ מידע מתא בודד רשתית העין שלמות. בנוסף, ניתן לטעון פרוסות ברשתית עם צבעי פלורסנט מחוון, הוספת צדדיות של השיטה. פרוטוקול זה פותחה עבור הדמיה Ca^{2 +} בתוך דג זברה חרוט photoreceptors, אבל עם סמנים תקין זה יכול להיות מותאם למדוד Ca^{2 +} או מטבוליטים של תאים, התאים הפרעה דו קוטבית או אופקי, מיקרוגלייה, תאי אמקרין או רשתית מולר תאי גנגליון. אפיתל הפיגמנט ברשתית יוסר פרוסות כך שיטה זו אינה מתאימה ללמוד את סוג התא. בפועל, זה ניתן להפיק פרוסות טורי מחיה לחיה לניסויים מרובים. טכניקה זו הסתגלות מספק כלי רב עוצמה עבור לענות על שאלות רבות אודות ביולוגיה של התא רשתית, Ca^{2 +}אנרגיה הומאוסטזיס.

Introduction

דג זברה (רזבורה rerio) להיות בשימוש נרחב רפואי ומחקר מדעי בסיסי¹, בשל גודלו הקטן, פיתוח מהיר ומערכות איברים חוליות. השקיפות הטבעית של הזחלים דג זברה בשילוב עם שיטות הוקמה transgenesis אפשרו ויזואליזציה מפורטת של תהליכים תאיים בחיים. מספר של מקודדים גנטית ביולוגיים פלורסנט סומנו כמטרות לתאים דג זברה ספציפי כדי לזהות Ca^{2 + 2}, מימן על-חמצני³, מוות הפעלה⁴ ו- ATP⁵

In vivo הדמיה של דג זברה הזחלים הוביל פריצת דרך בתחום של מדעי המוח, כולל מיפוי של המוח המעגלים⁶ , פיתוח תרופות עבור מערכת העצבים המרכזית הפרעות⁷. דג זברה מתאימים היטב לחקר הראייה שלהם כוללים את מבנה למינריות והסוגים נוירון של חולייתנים הגבוהים, הם מציגים התנהגויות חזותיים חזקים^8,9. מספר סוגים של הרשתית degenerations מקביל מחלות אנושיות המודל בהצלחה ולמד דג זברה^10,11, כולל הדמיה חיה של הפרט photoreceptors מושחת בתוך הרשתית^{2, 12}.

בעוד ויוו דג זברה זחל הדמיה הוא כלי רב ערך, הוא הופך להיות יותר מאתגר כמו דגים לגדול ולהתפתח פיגמנטציה, טיפולי תרופתי כלשהו לא יכול לחדור חיה שלמה. יתר על כן, תהליכים תאיים מסוימים לשנות עם הגיל, ופיתוח עושה מאוחר יותר נקודות זמן קריטי עבור הפונקציה להבנה, התקדמות המחלה בבעלי חיים למבוגרים. שיטות ביוכימיות כגון immunoblot, quantitiative ה-PCR, צריכת₂ O ניתוחים metabolomic יכול לספק רמזים חשובים על הביולוגיה של הרשתית בכללותה, אך קשה להבחין תרומות של סוגי תאים בודדים מושפע המחלה. הדמיה רקמת רשתית מבודד שמחוץ עוקף בעיות אלה, בעוד הדמיה במול הרשתיות הנטען מעניק תצוגה של הרשתית החיצונית¹³, תכונות ברשתית פנימי עמוק יותר מטושטשות. אופסין # רטינל רוחבי פרוסות, כגון אלה הציג באופן קבוע ניתוחים immunohistochemical, מאפשרים תצוגה ברורה של כל שכבות וסוגי תא אלא מציעים רק תמונה אחת של תהליכים דינמיים מעורב תפקוד תקין ומחלות.

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת שמחוץ רוחבי ברשתית פרוסות של דג זברה למבוגרים עבור הדמיה. זה דומה שיטות להכנת פרוסות ברשתית דו-חיים, דג זברה מחקרים אלקטרופיזיולוגיות מורפולוגי^14,15, עם שינויים חשובים עבור זמן לשגות הדמיה שמחוץ באמצעות קונפוקלי מיקרוסקופ. קרינה פלואורסצנטית תגובות ביולוגיים או צבעי פרוסות מנוטרים בזמן אמת עם מיקרוסקופ קונפוקלי תוך אספקת סוכנים תרופתי באמצעות זלוף. בעוד השיטה פותחה עבור הדמיה photoreceptors, זה יכול להיות אפשרי להשתמש בו ליצירת אפקטים של תאים, תאים דו-קוטביים, תאים אופקיים, תאי אמקרין או תאי גנגליון מולר עם סמנים פלורסנט המתאים. בנוסף, ניתן לטעון פרוסות עם צבעי פלורסנט תא חדיר דוח תא הכדאיות, תחבורה vesicular, הפונקציה מיטוכונדריאלי או מצב חמצון-חיזור. בתכשיר רב תכליתי מאפשר הדמיה של מגוון רחב של תהליכים subcellular לאורך הרשתית, כולל Ca^{2 +} דינמיקה, אותות, מצב מטבולי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת וושינגטון אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. הכנת בעלי חיים וציוד

הערה: אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא גיליון כהה של רקמות המקיפים את החלק החיצוני של הרשתית פיגמנטציה של מי יכול לטשטש תכונות ברשתית ונזק הרקמה כאשר קונאפוקלית הדמיה vivo לשעבר. בחושך, RPE של דג זברה "ניתק" מן הרשתית; כהה להתאים דג כדי להקל על הסרת בעתיד RPE מן הרשתית לפני הדמיה וגזירה.

1. להעביר דגים טנק ההשרצה מלא דגים מים, ואז עוטפים את הטנק ההשרצה עם בד כהה או למקם אותו בארון חשוך.
   1. כהה להתאים דג זברה במשך לפחות שעה לפני המתת חסד כדי לאפשר ליד הפרדה מוחלטת של RPE מן הרשתית. 30 דקות כהה הסתגלות מספיקה להסיר את רוב RPE, למרות חלקים ממנו עשויים להישאר intercalated בין photoreceptors.
2. להמיס ~ 15 מ"ל של נפט ריבה בתוך 50-mL על פלטה חמה, ואז מצייר 3 מ"ל של הנוזל לתוך מזרק טיפ 3-mL slip. היפוך מזרק, מקום בארון תקשורת מבחנה, ולאפשר וזלין להתקרר.
3. להפוך תא עם פרוסות לשימוש חוזר בשקופית מיקרוסקופ רגיל 7 ס"מ X 2.5 ס"מ.
   1. שימוש ברור לק, צייר קווים צרים כדי ליצור מלבן 3 ס"מ X 2.5 ס"מ במרכז השקופית, לאפשר לו להתייבש, ולאחר מכן להוסיף שכבה נוספת של לק הקווים.
4. הכנת הדמיה סולמות על שער גולשת להחזיק פרוסות במהלך דימות. הפרוסות יהוו "אחזו" של הסולם.
   1. לדימות סטטי או הזרקת ניסויים עם זרימה מינימלית פתרון, להפוך סולמות וזלין בהיקף של שתי רצועות שטוח רחב מקבילים של וזלין על 18 מ מ זכוכית מרובע שער גולשת. השתמש במזרק כדי להחיל שני משוטחים ~ 1 ס מ. מריחות זמן של וזלין מקורר 0.5 ס מ זו מזו על תגית כיסוי.
5. מוכן בפורס רקמות.
   1. לנקות תער קצה כפול עם אתנול ולאפשר לו אוויר יבש. לחתוך את זה לרבעים עם מספריים, תחילה לאורכו חצאים ואז לחצות כל להב.
   2. למקם את התא עם פרוסות על הבמה של בפורס רקמות, מרכז זה בצורה אופקית על הבמה ולסמן מהקצה הארוך עם הסמן הקבע עבור יישור.
   3. טעינת מקטע להב על גבי הזרוע מבצעה רקמות, להבטיח שהלהב שקרים שטוח, ממורכז בשקופית בלי לגעת הלק, ואז בעדינות להדק את המנגנון להב. נמוך הזרוע להב על-ידי התאמת הידית ¼ להפוך, ואז המקום פיסת נייר סינון במרכז הקאמרית הדמיה ובדיקה לחתוך את זה. אם הנייר לא מתאים באופן מלא באמצעות, הרכב מחדש את הלהב.
6. באמצעות המזרק, למקם נקודה קטנה אחת של ג'לי נפט מקורר בצלוחית ס מ-10 ~ 1.5 ס מ בצד ימין של המרכז. לחץ על הסולם הדמיה באמצעות מלקחיים עם הריבה נפט פונה כלפי מעלה. להכין עוד נקודה קטנה וזלין ~ 1 ס מ משולי כניסה לחדר ההדמיה.
7. להתאים את המזרק וזלין עם מחט 20 גרם, הפקק זה. . תחזיקי את המחט לתוך המזרק ולהשתמש בה כדי להפוך שני 1 ס מ זמן מקבילים רצועות דקיקות של וזלין לאורכו במרכז החדר עם פרוסות. מרחב את הרצועות ~ 1 ס מ אחד מהשני.
8. להפוך כלי לולאה של העין תיל הניתן לשימוש חוזר על-ידי גלישת במרכז ~ קטע 4 ס מ של חוט טונגסטן 30 g סביב זוג פעם שהחלונות סגורים מלקחיים. להתאים את הקוטר של הלולאה על-ידי הזזה החוט למעלה או למטה המלקחיים עד שזה מעט גדול יותר יש עין דג זברה, בדרך כלל ~ 2-3 מ מ. לסובב את קצות חוט ולאבטח אותם לסוף מקל עץ 6 ס מ באמצעות הקלטת מעבדה.
9. להכין תמיסת רינגר.
   1. הפשרת 50 X תוספת מניות פתרון (טבלה 1) ולהוסיף אותו טרי לפתרון באגירה HEPES, הלא-ביקרבונט רינגר (טבלה 2) בשעות הבוקר של הניסוי; לדלל 200 µL של פתרון מניות תוספת כל 10 מ"ל של תמיסת רינגר צינור חרוטי צנטריפוגה או בקבוק זכוכית סטריליים. לניסויים הדמיה סטטי, להכין לפחות 30 מ של תמיסת רינגר לכל ניסוי. נפח תמיסת רינגר הדרושים לניסויים זלוף יהיה תלוי קצב הזרימה ואת הזמן הכולל ניסוי.
   2. סימון כי ה-pH של התמיסה שהושלם הוא 7.4 באמצעות בדיקה pH דיגיטלי או נייר pH, להתאים בהתאם עם לדלל NaOH או HCl.
   3. חמצן תמיסת רינגר שהושלם על הקרח על ידי בעבוע בגז חמצן 100% לפחות 5 דקות באמצעות חמצן רפואי רגיל הרגולטור מצויד עם צינור, או יריעה bubbler גז אופציונלי המשמש זלוף. לאחסן תמיסת רינגר מחומצן על הקרח צינור צנטריפוגה חרוט אטום או בקבוק זכוכית סטריליים ליד המיקרוסקופ לנתיחה; השתמש פתרון זה עבור ניתוח, הדמיה, וכדי לדלל צבעי או סוכנים תרופתי.
   4. אם פתרונות אחרים נמצאים בשימוש הניסוי, כגון Na⁺-חינם תמיסת רינגר (טבלה 3), חזור על שלבים 1.9.1.-1.9.3.
10. לאסוף צלחות פטרי, מלקחיים, מיקרו-מספריים וכלים אחרים בקרבת המיקרוסקופ לנתיחה, ולהכין אמבט קרח מים דגים דג זברה המתת חסד.

2. הכנת פרוסות ברשתית (ראה איור 1)

1. עבודה תחת תאורת אדום כדי למזער את הסתגלות אור (אשר יכול להפוך את המקל RPE צמוד יותר ברשתית), המתת חסד דג זברה על ידי טבילה באמבט קרח עד מגע תגובה אובד, בדרך כלל 1-2 דקות להעביר את הדג על צלחת פטרי ולהשתמש אזמל כדי cervically לנקוע אך לא לערוף את הדגים.
2. להשתמש את לולאת תיל כדי לשחרר את רקמת חיבור סביב עין אחת ולאחר מכן משוך את העין קדימה בעדינות עם הלולאה ביד אחת. באמצעות מיקרו-מספריים ביד אחרים, חותכים את עצב הראייה לבן מתחת לעין, מטפל לא לחתוך האחורי של העין.
3. להעביר את העין באמצעות מלקחיים צלחת פטרי של תמיסת רינגר קר על קרח, וחזור על העין השנייה. שמור את העיניים בחושך או באור אדום עד RPE יוסר הרשתית.
4. לנתח את eyecups תחת מיקרוסקופ לנתיחה צריכת חשמל נמוכה בכל טיפת תמיסת רינגר קר על משטח זכוכית פשוטה בצלחת פטרי.
   1. פירס הקרנית עם מלקחיים בסדר, ואז בעדינות להסיר חתיכות של הקליר, קרנית שביר ואת בסקלרה כסוף עם מלקחיים או מספריים. להסיר ולמחוק את העדשה ואת רוב בסקלרה (ראה איור 1A), להתמודד עם עיינית מבודד את מינימלית.
   2. חתיכות של שומן, פיסות קטנות בסקלרה ולאחר RPE שחור יכול להישאר מחוברים עיינית ומוסר מן הרשתית מאוחר יותר. אם הרשתית מפריד בין RPE בשלב 2.4.1, להמשיך עם הפעולות באמצעות לנקוט משנה זהירות לא לפגוע ברשתית מבודד עדין.
   3. הצב עיינית פתוח כלפי מטה (RPE למעלה) בשקופית ולאחר וחותכים שליש או רבעונים עם סכין גילוח קצוות יחיד טריים בתנועה אחת (ראה איור 1B). למחוק את חתיכות רקמה זה מאוד מעוגלים.
5. הר שטוח הרשתית על נייר סינון.
   1. רטוב פיסת נייר סינון עם תמיסת רינגר ומניחים אותו על השקופית ליד החלקים עיינית. השתמש מלקחיים שטוח בעת טיפול בנייר סינון רטוב שלם כדי להימנע ניקב אותו. הוסף תמיסת רינגר קר לכסות נייר סינון והן רקמות.
   2. בזהירות באמצעות מלקחיים בכל יד, גרור נייר הסינון מתחת כל חתיכה עיינית עם RPE, photoreceptors פונה כלפי מעלה, כלומר עם האחורי של העין כלפי מעלה. מקם את החלקים עיינית בשורה בודדת לאורך מרכז נייר הסינון (ראה איור 1C). להתמודד עם החלקים עיינית בעדינות עם מלקחיים בסדר רק ליד קצה או פינה.
   3. כדי לסייע הרשתיות לדבוק נייר הסינון, במקום נייר הסינון הרטוב על מגבת נייר יבש 3 s לפתיל לחות כלפי מטה, אבל לא לתת את רקמת להיות יבש. חזור עד החלקים עיינית לשכב על נייר הסינון. החלת יניקה עדינה על החלק התחתון של נייר הסינון עוזר לשטח את הרשתית, אך השלב זה לא הכרחי.
6. אם שחור יריעות RPE נשארים על חתיכות עיינית, להשתמש מלקחיים בסדר לקלף בעדינות את זה משם החל אחד בפינה (ראה איור 1D) ואילו הרקמה יושב טיפה של תמיסת רינגר. צריך הרשתית תמריא נייר הסינון, חזור על השלב wicking הנגן 2.5.3. הרשתית עשוי להיראות ורוד עקב פיגמנטים חזותי מולבן.
7. חזור על ניתוח רשתית, שטוח הרכבה בשלבים 2.4-2.6 העין השנייה, אם רצונך בכך, שמירה על הרשתית רכוב שטוח הראשון שקוע בתוך תמיסת רינגר קר. כדי לייעל את ההליך עם פרוסות, אפשר למקם חתיכות של שתי הרשתיות על נייר סינון אחד. ברגע RPE הוסר, הפרוטוקול יכול להתבצע תחת אור חדר רגיל אלא אם כן ניסויים מחייבים החושך.
8. למקם את נייר הסינון בשקופית, לקצץ אותו לתוך מלבן עם קצוות יחיד תער, עוזב ~ 0.5 ס מ של נייר סינון משני צדדיו של הקו של הרשתית. להעביר נייר הסינון לתא עם פרוסות מוכנים לדחוף את הקצוות נייר סינון רב הקווים וזלין דק באמצעות מלקחיים, לטבול את הרשתיות ב 3-4 טיפות של תמיסת רינגר קר.
   הערה: צבעים מסוימים, כגון צבעי lipophilic, בצורה הטובה ביותר נטענים לתוך טעינות שטוחה בשלב זה לפני חיתוך. אלה יכולים להיות טעון, רשעים משם עם רקמה, רחץ בבית הבליעה עם פרוסות. למשל, C¹² 558/568 BODIPY בעוצמה כתמי ברשתית תא ממברנות ואת מקטעי החיצוני קולט אור (ראה איור 4A) כאשר נטען בבית ~ 5 µg/mL למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (בדרך כלל 23-27 ° C), ואחריו שטיפה של תמיסת רינגר עודף .
9. להעביר את התא עם פרוסות לבמה מבצעה רקמות, מקם קצה ארוך לאורך הקו מסומן ולאחר לאבטח את הקצוות קאמרית על הבמה עם קלטת מעבדה. מתחיל בקצה אחד, חותכים את הרשתית ואת נייר סינון באמצעות המשרד, עדין הלחץ על הזרוע עם פרוסות. בדוק כי הפרוסה הראשונה. חתכו באופן מלא, ואז השימוש של מיקרומטר לחתוך ~ 400 פרוסות מיקרומטר.
10. להרכיב את הסולם הדמיה.
    1. המקום התא עם פרוסות עם מקטעים ברשתית הפרוס בצלוחית הפטרי מהשלב 1.7 הסמוכים ההדמיה סולם (ראה איור 1E). למלא את הצלחת עם תמיסת רינגר קר ומטביעים את תוכנו.
    2. בעזרת מלקחיים ושמירה על פרוסות מתחת למים, בעדינות להעביר רצועות של נייר סינון ואת הרשתית הסולם על ידי הזזה הפטרי משמאל לימין. לטפל לא כדי לגעת הרשתיות ישירות. סיבוב הפרוסות ב- 90° ולקבור את קצוות נייר סינון ב וזלין.
    3. דק מקם פרוסות ברשתית בסולם עם מלקחיים כך שכבות הרשתית הם נראים בבירור תחת המיקרוסקופ לנתיחה (ראה איור 1 ג'י). עבור פרוסות בכל קצה של הסולם, ודא כי הרקמה פונה פנימה כלפי הפרוסות אחרים כדי למזער את התנועה של הרקמה במהלך זריקה או זרימה. למחוק את כל הפרוסות ברשתית שאינם טוב דבקה נייר הסינון (ראה איור 2 א).
11. אם רצונך בכך, טען צבעי לפרוסות ברשתית בשלב זה ולשטוף בתוך תמיסת רינגר עודף לפני הדמיה.
    הערה: Propidium יודיד (PI) ו Hoechst 33342 robustly כתם הגרעינים של מתים, כל התאים, בהתאמה (ראה איור 2B), כאשר מודגרות עם פרוסות רשתית-5 µg/mL עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. Tetramethylrhodamine (TMRM) שמצטבר המיטוכונדריה respiring באופן פעיל לאורך הרשתית כאשר מודגרות-1 ננומטר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
12. בעוד הם מכתימה הפרוסות, להכין את המנגנון קאמרית, הזרקת הדמיה. השתמש במזרק כדי לשטוף את הצנרור עם תמיסת רינגר, לטהר בועות, לצרף את הקצה הפתוח של הצנרת לים קאמרית הדמיה וסגור את צימוד. הסר את המזרק, למלא אותו reagent(s) להזרקה, לאחר מכן לחבר אותו מחדש אל הצנרת.
13. להשתמש מלקחיים כדי להעביר את coverslip עם פרוסות ברשתית לחדר ההדמיה, הקשת את coverslip אל הנקודה של וזלין סמוך לקצה כניסת לשכת הדמיה (ראה איור 1 H). למלא את התא הדמיה עם תמיסת רינגר כדי לכסות את פרוסות.

3. הדמיה פרוסות רשתית

1. במקום לחדר ההדמיה מלא עם המנגנון הזרקת מחוברים על השלב של מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף מצויד עם 20 או 40 X מים טובלים העדשה. לאבטח לחדר ההדמיה עם קטעי הבמה.
2. הורידו את העדשה וטבלו מעל הסולם, ולהתמקד פרוסה בקצה אחד של הסולם תחת אור עמום מואר טרנס. לבחון כל פרוסה כיוון הדפסה לרוחב, נוכחות של מקטעי החיצוני קולט אור, הדבקה מאובטח על נייר הסינון.
3. בחרו בפרוסה הטוב ביותר עבור זמן לשגות הדמיה ולהגדיר את התוכנה מיקרוסקופ עבור ייבוא תמונות זמן לשגות. בטבלה 4 מתאר הגדרות אופייניות הדמיה עבור פלורסנט סמנים שונים, צבעי.
   הערה: קצב רכישת התמונה משתנה בהתאם המיקרוסקופ marker(s) פלורסנט, תהליך ביולוגי נחקר. למשל, השתמש ברזולוציית 800 x 800 פיקסלים, מהירות סריקה µs/פיקסל 2, קצב מסגרות 10-s הדמיה סידן דינאמיקה של photoreceptors עם GCaMP3, צבע אדום.
   1. אם הוא זמין, להשתמש בתוכנה כדי לעקוב אחר ציוני דרך פיזית ב הפרוסה (מקטעי החיצוני קולט אור, גופי התא, גרעינים) לסייע ולהתפכחות פוטנציאליים במהלך זמן לשגות. גם להגדיר את התוכנה כדי לפקח פלורסצנטיות בזמן אמת על פני הפרוסה.
4. להתחיל הדמיה ונטר פלורסצנטיות בסיסית. כאשר קרינה פלואורסצנטית לאורך הפרוסה מייצבת (בדרך כלל תוך 2-5 דקות), להמשיך את הניסוי. להזרקה, לפתוח את צימוד מזרק, ואז לאט לאט נלחצים, למשוך בחזרה על הבוכנה פעמיים כדי לסייע ערבוב.
   הערה: למשל, לבטל את פונקציית מיטוכונדריאלי באמצעות הזרקה של תמיסה מרוכזת של protonophore CCCP להגיע ריכוז סופי של 1 מיקרומטר בבית הבליעה הדמיה. זה גורם חזקים Ca^{2 +} פרץ ציטוזול קולט אור שדווחו על-ידי GCaMP, ואז ירידה מתמדת בקרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים שדווחו על-ידי TMRM.
5. מקרוב לפקח פרוסות עבור סחיפה במהלך הניסוי, להשתמש בתוכנה כדי לבצע מיקרו-התאמות על פי ציוני דרך פיזית. בדרך כלל להיסחף Z-כיוון במהלך ההזרקה או זלוף < 5 מיקרומטר.

4. הדמיה את פרוסות ברשתית במהלך הניסויים זלוף איפה פתרונות משתנות או זרמו ללא הרף

הערה: הדמיה רשתית פרוסות במהלך הניסויים זלוף איפה פתרונות מוחלפים או זרמו ללא הרף דומה של תוכנית ההתקנה עבור ניסויים לדימות או הזרקת סטטי, עם השינויים הבאים.

1. במקום סולמות וזלין שמתואר בשלב 1.4, להשתמש יציבות סולמות שעווה להחזיק פרוסות ברשתית יציב במהלך פתרון זרימה.
   1. מקום שני צילינדרים מקבילים קטן של שעווה שיניים unflavored מדהים ~ 0.5 ס מ זו מזו על coverslip. על משטח שטוח, השתמש אגודל להקיש כל גליל כלפי מטה והחוצה לכיוון קצה coverslip מקבילים. ציון שני צילינדרים שעברו שיטוח אופקית עם coverslip #1 (ראה איור 1E, בצד ימין) ואז למרוח שכבה דקה של ריבה נפט בין רצועות שעווה עם מרית.
   2. בעת בניית הסולם הדמיה בשלב 2.10.2, לחץ את הקצוות פרוס נייר סינון התוצאות השעווה באמצעות מלקחיים בסדר (איור 1 ג'י).
2. כדי להגדיר עבור זלוף בשלב 2.12, למלא מאגרי מזרק עם פתרונות preoxygenated, או השתמש את סעפת גז אופציונלי לחמצן את פתרונות כל המאגר. ריקון כל צינורות עם תמיסת רינגר, להבטיח שכל קווי זרימה כאשר נפתח ולטהר בועות גדולות.
3. לפני מילוי החדר הדמיה בשלב 2.13, השתמש במזרק כדי למקם נקודה נוספת של וזלין על כל פינה חשוף של coverslip כדי למנוע אפשרות הזזה רוחבית במהלך זרימת.
4. כאשר תא ההדמיה מלא רכוב על הבמה מיקרוסקופ, להפעיל את העצמות וחבר הצנרת העצמות. לבדוק את הזרימה של תמיסת רינגר ולהשתמש את micropositioner כדי ולצלם את הצינור ליניקת על החדר יצוא כך כמויות קטנות של נוזל נמשכים לפני התא גולשת (בדרך כלל ~ 1 מ מ מעל פני השטח פתרון עבור קצב זרימה 2 mL/min). שמור תמיסת רינגר זורם בעת בחירת פרוסות בשלב 3.4.
5. כדי לערוך את הניסוי בשלב 3.4 עבור זלוף, עבור זרימה של פתרונות על-ידי סגירת של צימוד של הפתרון הראשון בעת פתיחת של הפתרון השני.
   1. למשל, כדי לרוקן חוץ-תאי נה⁺ מן החדר הדמיה, השתמש שני מאגרים מזרק מלא רינגר פתרון או נה⁺-ללא פתרון (טבלה 3). זרימה תמיסת רינגר כדי לקבוע תוכנית בסיסית ולאחר מכן לעבור ל נה⁺-הפתרון החופשי. התוצאה גדולה cytosolic Ca^{2 +} מגביר בקטעים החיצוני קולט אור וגופים התא (ראה איור 4).
6. עבור מערכות כוח המשיכה-fed זלוף, לנטר את הרמה של פתרון כל המאגר אז קצב הזרימה היא קבועה במהלך דימות. בנוסף מאגרי מים לפי הצורך בפתרונות מחומצן, או לשמור על רציף חמצן מבעבעים עם סעפת גז.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מיצוב יציב והכיוון רוחבי של פרוסות הם המפתח הדמיה מוצלח עם זריקה או זלוף של סוכנים תרופתי. לבחון ותמקם בזהירות פרוסות לפני קונאפוקלית הדמיה לפי הצורך כדי להבטיח שכל השכבות ברשתית הם גלויים (איור 2 א, הפרוסה השנייה). אם פרוסה מסובבים מעט קדימה (אי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ex-vivo הדמיה של דג זברה טריות פרוסות ברשתית הוכיחה להיות כלי רב-תכליתי ללמוד קולט אור ביולוגיה^20,21,22, הוא ייחודי בכך שהוא מאפשר ניתוח של תאים בודדים בבוגרת, באופן מלא הרשתית הבדיל. בפועל, זה אפשרי לערוך ניסויים מרובים עם רקמת מדג יחיד, אפי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
zebrafish	Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility		stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly	Fisher Scientific	19-090-843	for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe	Fisher Scientific	14-823-436	for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle	Fisher Scientific	14-826-5B	for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide	Fisher Scientific	12-550-A3	for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish	Amazon	B00150LT40	for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542A	for imaging ladders
unflavored dental wax	Amazon	B01K8WNL5A	for imaging ladders
double edge razor blades	Stoelting	51427	for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer	Stoelting	51415	for tissue slicing
filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size	EMD Millipore	HAWG01300	filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish	Fisher Scientific	FB0875712	for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick	Fisher Scientific	23-400-112	for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	for wire eye loop tool
D-glucose	Sigma Aldrich	G8270	component of supplement stock solution
sodium L-lactate	Sigma Aldrich	L7022	component of supplement stock solution
sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256	component of supplement stock solution
L-glutamine	Sigma Aldrich	G3126	component of supplement stock solution
L-glutathione, reduced	Sigma Aldrich	G4251	component of supplement stock solution
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960	component of supplement stock solution
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	component of Ringer's solution
KCl	Sigma Aldrich	P9333	component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O	Sigma Aldrich	C3881	component of Ringer's solution
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282	component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O	Sigma Aldrich	M0250	component of Ringer's solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	component of Ringer's solution
Tris base	Fisher Scientific	BP152	component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl	Fisher Scientific	02-003-063	component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube	Denville Scientific	C1062-P	container for Ringer's solution
Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades	World Precision Instruments	501790	micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips	World Precision Instruments	504510	fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades	Fisher Scientific	12-640	for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps	Fisher Scientific	XX6200006P	flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY	Fisher Scientific	D3835	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI)	Fisher Scientific	P3566	stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342	Fisher Scientific	62249	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Fisher Scientific	T668	stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber	Cell MicroControls	BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]	imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)	Fisher Scientific	N13195	fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000	confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)	Sigma Aldrich	C2759	experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner	Cell MicroControls	FL-1	for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder	Warner Instruments	various	for perfusion