JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.

Abstract

דנדריטים הן ההשתקפויות מסועף של נוירון, מורפולוגיה דנדריטים משקף סינפטית הארגון במהלך הפיתוח של מערכת העצבים. דרוזופילה זחל עצביים דנדריטים arborization (da) הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה של דנדריטים העצבית ותפקוד גנים בהתפתחות מערכת העצבים. ישנם ארבעה סוגי נוירונים da. השיעור הרביעי הוא שהמורכב ביותר עם דפוס מסעף המכסה כמעט את כל שטח הקיר גוף הזחל. אנחנו קודם לכן שאפיינו את השפעת להשתיק את דרוזופילה ortholog של SOX5 על השיעור הרביעי arborization דנדריטים עצביים המורכבות (NDAC) באמצעות ארבעת הפרמטרים: האורך של דנדריטים, את פני השטח של כיסוי דנדריט, המספר הכולל של ענפים, ואת המבנה מסעף. פרוטוקול זה מציג את זרימת העבודה של ניתוח כמותי NDAC, המורכב לנתיחה זחל, מיקרוסקופיה קונפוקלית ושגרות התמונה ניתוח באמצעות תוכנת ImageJ. תובנות חדשות ההתפתחות העצבית da ומנגנונים הבסיסית שלה לשפר את ההבנה של תפקוד ולספק רמזים אודות הסיבות הבסיסיות של נוירולוגיות והפרעות התפתחותיות.

Introduction

דנדריטים, אשר ההשתקפויות מסועף של נוירון, לכסות את השדה שמקיף חישה וסינפטית תשומות של הנוירון אחרים1,של הנוירונים2. דנדריטים הם מרכיב חשוב של היווצרות סינפסה ולשחק תפקיד קריטי שילוב תשומות סינפטית, וכן הפצת הגירוי אלקטרוכימי של נוירון. Arborization דנדריטים (da) הוא תהליך שבו נוירונים בצורת הדנדריטים חדשות וסניפים ליצירת הסינפסות חדש. פיתוח, המורפולוגיה של דא, כגון צפיפות סניף ודפוסי הקיבוץ, הם תוצאה של תהליכים ביולוגיים רב שלבי, נמצאים בקורלציה גבוהה תפקוד. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה לניתוח כמותי של המורכבות arborization dendritric עצביים דרוזופילה.

המורכבות של דנדריטים קובעת את סוגי סינפטית, קישוריות, תשומות מן השותף נוירונים. מסעף דפוסים, הצפיפות של דנדריטים מעורבים עיבוד האותות מתכנסת אל שדות דנדריטים3,4. דנדריטים מקבל את הגמישות עבור התאמה בהתפתחות. למשל, איתות סינפטית יש השפעה על הארגון דנדריט נוירון המגע במהלך שלב התפתחותי, את מערכת העצבים בוגרת5. הקמת קישוריות עצביים מסתמך על מורפוגנזה ועל התבגרותם של דנדריטים. מום של דנדריטים מזוהה עם תפקוד לקוי. מחקרים הראו כי חריגות של da נוירון מורפוגנזה עשוי לתרום אטיולוגיה של מספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), ומחלת לו גריג / נוירודגנרטיביות (ALS)6,7,8. שינויים סינפטיים מופיעים בשלב המוקדם של AD, בתאום עם הירידה ואת ירידת ערך של נוירון פונקציה7,8. עם זאת, הפרטים של איך דנדריט פתולוגיה תורמת פתוגנזה מחלות ניווניות אלה נשאר חמקמק.

הפיתוח של דנדריטים מוסדר על ידי גנים אשר קידוד רשת מורכבת של הרגולטורים, כגון משפחת ונ ט של חלבונים9,10, גורמי שעתוק ליגנדים התא קולטנים משטח11,12 . דרוזופילה da נוירונים מורכב ארבע כיתות (מחלקה אני, II, III, IV), של איזה מחלקה IV דה נוירונים יש מסעף הדפוסים המורכבים ביותר, יש כבר מועסקים כמערכת ניסיוני רב עוצמה עבור יותר הבנה מורפוגנזה13, 14. במהלך תחילת מורפוגנזה, ביטוי ו/או RNAi להחרשת גנים class IV דה נוירונים לגרום לשינוי דפוסי מסעף ודנדריט גיזום13. חשוב לפתח שיטה מעשית לניתוח כמותי של arborization הדנדריטים עצביים.

אנחנו הראו בעבר כי להחרשת דרוזופילה ortholog של SOX5, Sox102F, הוביל דנדריטים קצר יותר של נוירונים da, מורכבות מופחתת בשיעור הרביעי da נוירונים15. כאן, אנו מציגים את ההליך של ניתוח כמותי על המורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה. פרוטוקול זה, משנת המתודולוגיה המתוארת הקודם, מספק שיטה קצרה assay הפיתוח של נוירונים חושי דה. זה מדגים תיוג תמונות של נוירון da השלישי לחלל זחל לגוף החומה16,17,18,19. זה פרוטוקול יקר עבור חוקרים המעוניינים לחקור את NDAC ואת הבדלים התפתחותיים ויוו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנה ניסיוני

  1. להכין את ריאגנטים הבאים: פוספט של Dulbecco buffered תמיסת מלח (PBS); טריטון X-100; 0.2 PBST % (PBS + 0.2% טריטון X-100); 32% paraformaldehyde (PFA), מדולל 4% לפני השימוש; סיליקון elastomer בסיס והסוכן ריפוי; antifade הרכבה בינונית (למשל, להאריך זהב); לק....
  2. הכנת הציוד הבא: ניתוח מיקרוסקופ, שניים חדות מלקחיים וזוג מספריים עבור microdissection, מספר סיכות על microdissection, צלחת פטרי להכנת תבשיל לנתיחה, שקופיות מיקרוסקופ, coverslips, מיקרוסקופ קונפוקלי, ו- a מחשב עם מותקנת תוכנת ImageJ פיג'י.

2. הזחלים אוסף

  1. חבר UAS-Sox102F-RNAi זבובים עם UAS-GFP, ממ ק-GAL4 או W1118 פראי סוג זבובים, בהתאמה. תרבות זבובים בתנאים סטנדרטיים ב 25 º C.
  2. ~ 5-6 ימים, לאסוף את הזחל לחלל השלישי של UAS-Sox102F-RNAi / ממ ק-GAL4, UAS-GFP או UAS-GFP, ממ ק-GAL4 / + שליטה בזהירות עם המלקחיים על ניתוח.

3. ניתוח הזחלים

הערה: כל ההליכים בסעיף זה מופעלים תחת מיקרוסקופ microdissection. ההגדלה הוא החוקרים. לנסות להתאים את התצוגה ראייה אופטימלית. ~ 4-6 X הגדלה מומלצת.

  1. במקום זחל על צלחת הקרע העשוי סיליקון elastomer הבסיס ותרבות רקמות פטרי.
  2. להצמיד את הקרס בפה זחל כדי לאפשר את הצד הגבי להתמודד ולאחר מכן להדביק את הזנב של זחל. מניחים בצד הגבי באמצע ככל האפשר לחשוף את האמצע, אשר יהיה דה מרקר פתוח-up.
  3. להוסיף 200 µL ל- PBS הזחל כדי לשמור על לחות הגוף.
  4. לעשות חתך עם זוג מספריים לאורך הקו האמצעי הגבי בין tracheas שני, מסימטרית כדי rostral. לעשות חתך קטן בכל ארבע הפינות של הגוף זחל.
  5. המקום pin בכל ארבע הפינות של הגוף אז הגוף שקרים שטוח.
  6. לתקן את הקיר הגוף זחל 4% PFA במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. לכבס במים PBST עבור 5 דק. חזור עוד פעמיים.
  8. הסר את הסיכות של הרקמה. ואז להעביר את הרקמה על זכוכית, לכסות עם הרכבה antifade בינוני, והר עם מכסה. האוויר יבש עבור 1 h, לאטום את הקצוות עם הלק.

4. עיבוד הדמיה

הערה: התמונות צולמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה. המשתמש יכול לצלם את הדגימה באמצעות מטרה X 20 (מומלץ).

  1. לכידת תמונות מסדרת Z. פתח את תיבת הדו-שיח "ללכוד את Z-סדרת" בתוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי. לקבוע את הטווח עבור לכידת תמונות סדרת Z.
    1. לחץ על לחצן "העליון ואת התחתון". לקבוע העליון והתחתון למקם ולהזין את הערכים "התחתון:" ו "העליון:" תיבות. הגדר את "צעד" בתיבת הדו-שיח "ללכוד את Z-סדרת" 0.5 מיקרומטר. לאחר מכן לחץ על לחצן "הפעל כעת" כדי לרכוש את Z-סדרת תמונות.
  2. שמור את התמונות שהושג כקבצי *.tiff או *.nd2.
  3. אחסן את השקופיות בעל כהה ב 4 ° C לאחר דימות.

5. דנדריט הערכה

הערה: חלבון ה-GFP היה co-overexpressed ב UAS-GFP, ממ ק-GAL4 טס על הנוירונים da עבור זריחה GFP הדמיה ניתוח. אורך, מסעף ומבנה של da נוירונים בהזחלים לחלל השלישית היו לכמת. ניתוח פרמטרי כוללים אורך של דנדריטים (מיקרומטר), פני השטח (2מיקרומטר), המספר הכולל של ענפים ומבנה מסעף (%). איור 1 מציג את הפרמטרים ניתוח בפירוט.

  1. אורכו של דנדריטים
    הערה: האורך של דנדריטים הוא הסכום של דנדריטים כל המסומנות בתוסף מעקב.
    1. ההתקנה ולהפעיל תוכנות20 פיג'י ImageJ (https://fiji.sc/). ואז לפצל תמונות ערוצים נפרדים, אם קיימות מספר ערוצים של תמונות.
      הערה: התמונה בפרוטוקול זה יש רק ערוץ אחד של GFP.
    2. הפעלת "תמונה | ערימות | פרויקט Z"כדי לקבל תחזית Z; יופיע חלון חדש עם השם 'Z-הקרנה.' לחץ על "עוצמת מקסימום" עבור סוג ההקרנה וארגון של מספרים בין ההתחלה פרוסה עצירה פרוסה בהתאם על העדפות אישיות. לחץ על "אישור." תמונת Z-ההקרנה יופיעו הצגת התחזית דנדריט בבירור.
    3. לאתר את neurites.
      1. בחר "תוספים | פילוח | פשוט Neurites מעקב"בחלון לאתר של דנדריטים. למצוא את סומא נוירון ולאחר מכן לחץ על נקודה אחת-דנדריט החל לגוף התא, נקודה נוספת בקצה של זה דנדריט.
        הערה: התוכנית יחברו שתי הנקודות בקו כחול.
      2. הקש "Y" בחלון יישום plug-in אם הנתיב אינו ברור; הנתיב דנדריט נמצא במעקב עד הקצה של הנתיב שנבחר של תמונות גלויות. לחץ "הנתיב המלא" על תוסף באותו החלון; הקטע הושלמה (איור 2).
        הערה: מספר דנדריטים הסתיים רחוק יותר נקודות המוצא, בהם מסלול הייתה מחולקת למקטעים קטנים יותר. המקטעים חברו יחד כדי לספק נתיב מלא עבור רכיב המעקב.
    4. לאחר השלמת נתיב, לחזור לנקודת חדשה איפה הענפים. הנתיב החדש יכול להיות בנוי על; התיבה חלון "כל הדרכים" תציג את הערכים אורך כל הנתיבים (איור 3). שמור את קובץ מעקב והמשך עם עקבות לא גמורים כמוצג באיור2.
    5. ייצוא נתוני האורך דנדריט על ידי לחיצה, "קובץ | ייצוא כמו *.cvs"בחלון 'תוסף'. ואז לסכם את כל אורך נתיב, לייצא את הנתונים לניתוח נתונים/בתכנת. (איור 3).
  2. שטח הפנים של הנוירונים da
    1. בחרו בכלי ציור ביד חופשית בחלון 'פיג'י ImageJ'. הנתיב, ולאחר מכן חבר את נקודות הקצה. מתפריט ' 'נתח' ', בחר ' הגדר מדידות | באזור." לחץ על "מדד" מתוך תפריט 'נתח'. התוצאה מופיעה תיבה חדשה עם הערך עבור האזור שנבחר (איור 4). העתק זה תוכנת ניתוח נתונים.
  3. סה כ מספר של ענפים והמבנה הסתעפות של הנוירונים da
    1. לחשב את המספר הכולל של ענפים על-ידי פתיחת "ניתוח" ולאחר מכן "רינדור | לנתח נתיבי Skeletonized"בחלון תוסף של איתור (איור 5).
      הערה: מבנה סוכת הוא הסכום של הרמות של ענפים. הנתיב הוגדרו בין גוף התא העצות דנדריט, נתיב אחד יכול לכלול מספר ענפים, כגון ובשבילים העיקרי הן דנדריטים של הגוף התא של נוירון. ובשבילים משניים הם ענפים מן הראשית וכן הלאה עם ובשבילים רבעוני, quinary השלישון. המבנה של הסתעפות דנדריט מופרדים זה מזה בהתאם הרמות של סניפים. למשל, האחוזים העיקרי הוא מספר הסניפים מחולקת על ידי המספר הכולל של הסתעפות, וכן הלאה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דנדריטים של נוירונים da הודבקו תוויות על-ידי GFP co-overexpressing (UAS-GFP; ממ ק-GAL4) סומא עצבית da ו דנדריטים ובשבילים עבור זריחה GFP הדמיה ניתוח. המורפולוגיה של דנדריטים נוירון da צולמה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (איור 2).

דנדריטים של נ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

דנדריטים זה innervate האפידרמיס הם אזורי קלט של נוירונים, מורפולוגיות שלהם לקבוע כיצד המידע התקבל, מעובד על ידי נוירונים בודדים. פיתוח דנדריט מורפולוגיה משקף ג'ין אפנון של הארגון דנדריט. הנוירון da זחל דרוזופילה של מערכת העצבים ההיקפית הוא מודל חשוב ללמוד פיתוח דנדריט בגלל: 1) הדמיון פונקצי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ויליאם א אימר לסיוע טכני הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי לקרן תרופה לאלצהיימר [R.E.T], המכון הלאומי לבריאות [R01AG014713, R01MH60009 אל R.E.T; R03AR063271, R15EB019704 ל א. ל.], ואת הקרן הלאומית למדע [NSF1455613 ל א. ל.].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agentDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Fingernail polish CVS72180
Stereo microscopeNikonSMZ800
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
Petri dishFalcon353001
ForcepsDumont11255-20
Scissors Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Insect Pins Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscope slides and cover slipsFisher Scientific15-188-52

References

  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  6. Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
  7. Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer's disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
  8. Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
  9. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
  10. Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
  11. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  12. Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
  13. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
  14. Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
  15. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
  16. Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
  17. Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
  18. Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
  19. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
  22. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  23. Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
  24. Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
  25. Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).
  26. Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
  27. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  28. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143Arborization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved