מודל ב Ovo לבדיקת תרכובות מימטי-אינסולין

Summary

במחקר זה, אנו מתארים מערכת ב- ovo ככלי מבטיח לבדוק אינסולין-מימטי תרכובות אורגניזם חי. היתרונות העיקריים כוללים תפוקה הולמת ועלויות מקובל, המאפשרים הזיהוי של פיטוכימיקלים עם אינסולין-מימטי מאפיינים.

Abstract

רמות גלוקוז גבוהות בדם, סוכרת סוג 2 (T2DM), מחלה מטבולית multifactorial ומורכבת, נגרמות על ידי אינסולין ההתנגדות ו β-cell כשל. אסטרטגיות שונות, כולל ההזרקה של אינסולין או השימוש של תרופות sensitizing אינסולין, נרדפים כדי לטפל T2DM או לפחות להפחית את הסימפטומים. בנוסף, היישום של תרכובות צמחיות משכה תשומת לב גדלה והולכת. לכן, זה הכרחי למצוא מערכות הבדיקה יעילה כדי לזהות ולאפיין אינסולין-מימטי תרכובות. כאן פיתחנו מודל העובר אפרוח שונה, אשר מאפשרת בדיקה של תרכובות סינתטי ותמציות צמחי מרפא עם אינסולין-מימטי מאפיינים. באמצעות קרינה פלואורסצנטית מבוסס מיקרוסקופיה הראשי מסך, אשר מכמת את טרנסלוקציה של נשא גלוקוז 4 (Glut4) כדי קרום פלזמה, הצלחנו לזהות תרכובות, בעיקר תמציות צמחים, אשר יוביל לעליה של גלוקוז תאיים ריכוזים ב adipocytes. עם זאת, יעילותם של חומרים אלה דורש אימות של אורגניזם חי. לפיכך, השתמשנו ב- ovo גישה לזהות את תכונותיהם בהפחתת גלוקוז בדם. באישור ועדת אתיקה אינה דרושה מאז השימוש של עוף העוברים במהלך הראשון לשני-שליש התפתחות אינו נחשב ניסוי בבעלי חיים. . הנה, היישום של מודל זה מתואר בפירוט.

Introduction

סוכרת היא מחלה מטבולית מאופיינת היפרגליקמיה והיא נגרמת על ידי ליקויים-הפרשה של אינסולין או פעולה אינסולין¹. תשעים אחוז מכל מקרי הסוכרת הם קטגוריה סוכרת סוג 2 (T2DM), שבו אנשים להדגים תנגודת לאינסולין בעיקר אינסולין מחסור². מספר גורמים ידועים כדי להגביר את השכיחות העולמית של T2DM, כולל שינויים באורח החיים, במיוחד אלה הקשורים overnutrition, הזדקנות, חוסר פעילות גופנית. כ- 400 מיליון אנשים יש סוכרת ברחבי העולם על פי הבינלאומי לסוכרת הפדרציה (צה ל). מספר זה צפוי להגיע 600 מיליון בתוך 20 שנה הבאה³.

סיבוכים סוכרת הנגרמת על ידי היפרגליקמיה ותנגודת לאינסולין, כגון יתר לחץ דם, dyslipidemia, אי סבילות גלוקוז, מחלת לב כלילית, מחלת כלי דם מוחי, להוביל תוחלת החיים מופחתת באופן משמעותי באיכות⁴. אנשים מושפעים דורשים להורדת גלוקוז pharmacotherapy; עם זאת, השימוש של תרופות, כגון מטפורמין⁵ קשורה לעיתים קרובות עם תופעות לוואי דרמטי-^6,-^7,-⁸. לכן, נוסף גישות antidiabetic בטוח, זמינה וזולה נרחב נחוצים.

יש כבר ייחסה תרכובות צמחים שונות, תמציות, צמחייה בריאותיים למאפיינים אינסולין-מימטי תכונה על-ידי להתכוונן תאיים שונים. תכונה חשובה היא גירוי של רוברטסונית של נשא גלוקוז 4 (GLUT4) קרום פלזמה מעל תאי אחסון תאיים, וכתוצאה מכך ספיגה מוגברת של גלוקוז בשריר, רקמת שומן, בהעדר אינסולין, המכונה מאפייני אינסולין-מימטי⁹. בעבר, אנחנו מיושמת גישה מבוסס מיקרוסקופיה של קרינה פלואורסצנטית לכמת את התהליך טרנסלוקציה של GLUT4¹⁰. ניתוח של תמציות צמחים רבים מן הספרייה תמצית¹¹ שימוש assay הזה הביא הזיהוי של מועמדים מבטיחים. עם זאת, בדיקות נוספות היצורים החיים נדרשים. הגישה המתוארת בפירוט רב את הנייר הזה, מודל העובר אפרוח שונה, הוכיחה להיות דוגמנית מבטיח לזיהוי חומרים עם אינסולין-מימטי מאפיינים. הוא מייצג כלי אטרקטיבי מילוי הפער רחב בין הפריה מחקרים ב- vivo ומציע מספר יתרונות בהשוואה למערכות קיימות כגון עלויות מקובלת, נהלי הטיפול הפשוט תפוקה הולמת. בנוסף, אישור על ידי ועדת האתיקה אינה נדרשת.

Protocol

על פי הוראת 2010/63/האיחוד האירופי, ניסויים עם עוברי העופות שאינם סס במהלך הראשון לשני-שליש התפתחות לא צריך הרשאה על ידי ועדת האתיקה.

1. רבייה של ביצי ואחסון

1. השג ביצי תרנגולת מופרית (טבלה של חומרים) תרבית מקומית.
   הערה: ביצים ניתן לאחסן ב 14 מעלות צלזיוס באווירה humidified עד 10 ימים לאחר הנחת לפני השימוש לניסויים.
2. דגירה הביצים ב 38 ° C עם לחות ממוצעת של 40-60% 10 או 11 ימים בתוך אינקובטור כל הזמן שהופך את הביצים.

2. בחירה של ביצים

1. בדוק את הביצים לדישון לאחר דגירה של עד 11 ימים. השתמש אור candling בשלב זה. טבלו את השוליים של המנורה candling inkpad, נרות הצד המחודד של הביצה.
2. כדי לזהות שלפוחית השתן אוויר, בדוק הבדלי בהירות על הביצה.
   הערה: שלפוחית השתן אוויר מופיעה כאזור עגול, שקופים יותר, בזמן אלבומין הוא כהה יותר, כאשר הביצה הוא candled.
3. לאחר גילוי של שלפוחית השתן אוויר, סמן את המיקום על-ידי הקשה על המנורה מעט נגד הביצה עם הדיו שהוחלו בעבר.
4. הכללת שאינה מופרית ביצים בשלב זה, אשר אינם מראים הבדל בהירות בין אלבומין שלפוחית אוויר.

3. הזרקה של חומרים

1. הכן את החומר של הריבית (למשל, תמצית צמחים או אינסולין) על ידי דילול החומר בריכוז הרצוי במאגר מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) של האנק. לדוגמה, 3.3 U/mL של אינסולין זמינים מסחרית אנלוגי ב- HBSS.
2. עבור היישום של המתחם הנבחר, בזהירות פק קליפת עם זוג מלקחיים באזור המסומן של שלפוחית השתן אוויר המחודד. לא יוצרים חור גדול יותר מקוטר המחט של המזרק. להזריק את בופר (300 µL) המכילה את החומר עניין לאזור שמנוקרים באמצעות מזרק.
   הערה: השתמש מזרקים חד-פעמיים סטרילי, 1-ml, טיפים פיפטה וכלי הדם. ללבוש כפפות, חלוק מעבדה לניסויים.
3. כדי לקבוע את האפקט להפחתת גלוקוז בדם של חומר, מקם את הביצים לתוך החממה 60, 120, 180 דקות, בהתאמה. כדי לקבוע את רמות הגלוקוז בדם הבזליים, כוללים לפחות 10-15 שליטה שאינם מטופלים ביצים.

4. בדיקות רעילות

1. לאחר היישום של המתחם הנבחר במשך 24 שעות ביממה, equilibrate את קרום הדקה עם פוספט תמיסת מלח במאגר (PBS) מאגר (מספיק כדי לכסות את הקרום כל הדקה) לפחות ב-30 s.
2. להסיר עודפי PBS מאגר על ידי למזוג משם.
3. משוך את קרום הדקה בזהירות עם זוג פינצטה מחודדת.
4. בדיקת כלי דם לחבלות ואשר חיוניות (למשל, תנועה) של העובר צ'יק.
   הערה: ראה איור 1 להשוואה של חיוני נגד עוברי שאינם חיוניים לאחר היישום של תמצית צמחים רעילים.

5. מדידה של ערך הגלוקוז בדם

1. בנקודת הזמן המתאים, בזהירות להסיר את קליפת מעל שלפוחית השתן אוויר, equilibrate את קרום הדקה עם מאגר PBS (מספיק כדי לכסות את הקרום כל הדקה).
2. להסיר עודפי PBS מאגר על ידי למזוג משם.
3. משוך בזהירות את קרום הדקה עם זוג פינצטה מחודדת.
4. לחתוך ולהסיר את הקרום chorioallantoic עם מיקרו-מספריים, כדי לאפשר גישה טובה לכלי הדם מתאים. לחתוך את הקרום לפחות 2-3 ס מ. Not גזור כל כלי גדול ממברנה עצמו כדי למנוע איבוד דם לא רצויים של העובר.
5. אתר את קיבול גדול שמקורם הבטן של העובר. להרים את כלי השיט הזה מתחום אלבומין עם מיקרו-מספריים סגורה ומניחים אותו על pH-רצועת פלסטיק. להזיז את רצועת ה-pH מתחת הספינה, אשר מתקיים עם המיקרו-המספריים, ומשוך לאחור את המיקרו-המספריים משם בקפידה.
6. הסר 1-2 מ"ל של הנוזל מתחת קרום chorioallantoic עם פיפטה כדי למנוע דילול הדם בשלב הבא. ייבש את הכלי ואת חשפנות-pH עם נייר סינון, לפני הספינה נחתך.
7. חותכים את כלי הדם בזהירות עם מיקרו-מספריים בצד אחד. לא לחתוך כלי הקיבול לחלוטין.
   הערה: כלי הקיבול הוא בערך 1 מ מ עבה. Not גזור יותר ממחצית הספינה כדי למנוע חיתוך באמצעות הכלי לחלוטין, זה עלול להחליק מהרצועה, איסוף דם לא אפשרית.
8. לאסוף את הדם דולף על רצועת ה-pH באמצעות פיפטה. Microliters עשר של דם נדרשים לקבוע רמות הגלוקוז באמצעות מד גלוקוז בדם.

6. הערכות סטטיסטיות

1. לחשב את הערך הממוצע לפחות 10 ביצים בודדות לכל נקודת זמן, לנרמל את הערכים האלה כדי לאחד הביצים שליטה (ביצים שאינם או מאגר-מטופלים).
2. לאחר מכן, לקבוע את אחוזי ירידה. בנוסף, משתמשים אינסולין כפקד חיובי.
   הערה: חזור על ניסוי לפחות שלוש פעמים.

תוצאות

תיאור/הוראות: הגישה Gluc-הט

לאחר דגירה עם חומרים מעניינים, הביצים נפתח, שהוכן עבור איסוף דם על-ידי הסרה של קליפת (איור 2). הכנה נוספת כולל equilibration והסרה של קרום קליפת הביצה כדי לקבל גישה קרום chorioallantoic. זה קרום ואז נחתך בקפידה כדי לספק גישה לכלי דם מתאים עבור איסוף דם. רצוי, כלי גדול שמקורם הבטן של העובר מושם על pH-רצועת פלסטיק. כדי למנוע דילול הדם בזמן האיסוף, כלי השיט ורצועת pH מלוטף יבש עם נייר סינון. כלי הדם ואז נחתך, נוזלת על רצועת ה-pH הדם נאסף עבור ניתוח באמצעות פיפטה.

ההשפעות של תמציות צמחים שנבחרו על רמות הגלוקוז בדם:

עם הוקמה לאחרונה GLUT4-רוברטסונית המבוסס על כימות הראשי מסך, אנו מסוגלים לזהות חומרים האופייניים אינסולין-מימטי¹⁰. הקרנה של מאות תמציות צמחים מסיסים במים גרמו הזיהוי של מספר להיטים. תמציות אלו נבדקו במודל שלנו ב-ovo. ניסויים אלה שימשו תמציות מקריסטלים של Combretum indicum (רנגון מטפס), תמצית שאינו גלוי (הנקרא תמצית 0845). שאנחנו התפזרנו תמציות במאגר HBSS-300 mg/L, ריכוז זה התברר המתאים מחקרים קודמים^12,13. חומרים הוחלו על העוברים הדגירה למשך 11 ימים. כמצוין באיור3, החילוץ מ מטפס רנגון לא לגרום הפחתה גלוקוז הדם משמעותי ב- ovo. עם זאת, ריכוז הגלוקוז בדם בהצלחה צומצם עם תמצית 0845, עם ירידה קטנה לאחר 60 דקות, אשר דומה לאפקט שנמדדו באמצעות זמינים מסחרית אינסולין אנלוגי. אפקט משמעותי נצפתה כאשר תקופת דגירה הביצים הייתה ממושכת.

איור 1: השפעתה של תרכובות רעילים על חיוניות העובר. הביצים מודגרות למשך 11 ימים (A ו- C) או מטופלים עם תמצית צמחים רעילים ביום 10 עבור עוד 24 שעות (B ו- D). היישום של התמצית הובילה חמור נגעים של כלי דם קרום chorioallantoic (ד) , העובר (B).

איור 2: תיאור של הדגם ב- ovo . משמאל לימין: פתיחת והסרה של קליפת (1 - 2); equilibration והסרה של קרום הדקה עם קרום chorioallantoic חשוף (3); כלי השיט מוכן חשפנות-pH (4); האוסף של דם ומדידה של ריכוז הגלוקוז באמצעות גלוקוז מטר (5). מ Haselgruebler et al., 2017¹². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: ההשפעה של תמציות צמחים על רמות הגלוקוז בדם בהשוואה ביצים אינו מטופל או שטופלו אינסולין. הביצים היו הדגירה למשך 11 ימים ו שטופלו החומרים המצוין (זמינים מסחרית אינסולין אנאלוגי: 3.3 U/mL; תמציות: 300 מ ג/ליטר) מומס HBSS מאגר (300 µL נפח) עבור עד 3 ה דם רמות הגלוקוז נקבעו באמצעות מד גלוקוז בדם. התוצאות מוצגות ללא ההשפעה של המאגר. קווי שגיאה מבוססים על שגיאת התקן של הממוצע. * P < 0.05 ו * * * P < 0.0001, משמעותית ירידה ביחס שטופלו HBSS ביצים באותו זמן הדגירה. מ Haselgruebler et al., 2017¹². אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

וזמינותו הט-קאם היא מערכת חלופה מבחן בשימוש נרחב לניסויים בבעלי חיים התעשייה¹². המערכת ב- ovo המתוארים כאן מייצג גירסה שונה של מצלמת הט וזמינותו. בעוד בצורתו המקורית, מצלמת הט ניסויים מבוצעים ללמוד את מאפייני מעצבן של תרכובות ניסוח או הניתוח של אנגיוגנזה^14,15,16, לנו יש להתאים את הגישה כדי לבדוק תרכובות עם מאפיינים אינסולין-מימטי בשם¹². על פי הוראת 2010/63/האיחוד האירופי, ניסויים עם עוברי העופות שאינם סס במהלך הראשון לשני-שליש התפתחות לא צריך הרשאה על ידי ועדת האתיקה מאז ניסויים אלו אינם נחשבים ניסויים בבעלי חיים. מחקרים אחרונים הוכיחו ההתאמה של המערכת ב- ovo לאפיין את היעילות של תמציות צמחים שנבחרו, אשר זוהו GLUT4 רוברטסונית מבוססת על המסך הראשי¹⁰, כדי להפחית את רמות הגלוקוז בדם, היעדרות של אינסולין^12,13. נקודות קריטיות עבור הופעה ממש טובה של המערכת ב- ovo כוללים: הראשון, תרבית אמין אספקת הביצים. לומן. עוף חום קלאסי הוא בחירה טובה של הגזע. שנית, היישום של רעילות בדיקות כדי לא לכלול את ההשפעות הרעילות של הצרכים מתחם ובדוקים להיעשות. בנוסף, הכנת כלי דם מתאים עבור איסוף דם חשובה. חשוב למנוע את חיתוך כלי גדול ממברנה chorioallantoic עצמו, כמו זה יכול להוביל לאובדן שאינו עדיפה של דם. יתר על כן, לפני הספינה הוא נחתך על רצועת ה-pH, זה חייב להיות טפחו יבש באמצעות נייר סינון כדי למנוע דילול הדם שנאספו. בסופו של דבר, מספר מספיק של ניסויים נראה חשוב. מומלץ להשתמש לפחות 10 ביצים על כל נקודת זמן, וחזרה לתרגיל של הניסוי בהתאמה.

באופן טבעי, ישנן כמה מגבלות של גישה זו ב- ovo . מכיוון שצריך עד 30 דקות עד שהחומרים הם נספג דרך קרום הדקה באים במגע קרוב עם קרום chorioallantoic, זה אינה מאפשרת לכמת מענה מהיר של העובר למתחם יישומית. יתר על כן, תרכובות מסוימות עשויים להיות רעילים בריכוז יישומית, אשר לעתים קרובות התוצאות נגעים של כלי דם ברקמה chorioallantoic. לפיכך, cytotoxicity בדיקות בהתבסס על דגירה לטווח ארוך של תרכובות למשך 24 שעות מופיע סבירה. לבסוף, מצאנו כי מערכת מאגר המשמש עבור היישום של תרכובות יש השפעה משמעותית על הביצועים של וזמינותו. ¹² . כעת, HBSS המאגר משמש כי התוצאה היא ההשפעה הקטן ביותר על רמות הגלוקוז בדם של העובר.

עבור יישומים עתידיים, המאגר הנוסף מערכות כחלופה HBSS עשוי להיבדק. יתר על כן, ההשפעה של תמציות צמחים על פרמטרים נוספים דם כגון כולסטרול, טריגליצרידים או lipoproteins יכול להיות שאלה אטרקטיבי.

המערכת החדשה שלנו ב- ovo הוא כלי מבטיח וחשוב לבחון חומרים עם מאפיינים אינסולין-מימטי של אורגניזם חי ללא הצורך של ניסוי בבעלי חיים. לכן, הוא ממלא את הפער בין הגישות הפריה , ב- vivo . לעומת הקיים ב- ovo דגם מערכות¹⁷ שאין צורך לזירוז סוכרת על ידי טיפול streptozotocin (STZ), כפי שאנו משתמשים עוברי ביום 10 או 11 של דגירה. בשלב זה, ייצור האינסולין לא התחיל, אך העוברים כבר רגישים לאינסולין. בנוסף, אישור על ידי ועדת האתיקה ייתכן שיהיה צורך אם העוברים בגילאי 14-17 ימים נמצאים בשימוש¹⁷. יתר על כן, בהשוואה לאסטרטגיות אלטרנטיביות¹⁸, מתחם היישום כפי שמתואר כאן הוא פחות מזיקים ולא מייגעת, הגדלת ניסיוני דרך. תוריד מחירים.

יחדיו, זה ב- ovo הגישה היא מערכת אטרקטיביים אם תופעת דם-הפחתת חומר אינסולין-מימטי צריך להיבחן. אורגניזם חי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Biochrom	L1825
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH30268.02
NovoRapid	Novo Nordisk	8-0905-82-304-6
Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)	Local Breeder
Accu-check performa	Roche	6454011
Accu-check Inform II Teststreifen	Roche	5942861
Incubator  HEKA- Turbo 288	HEKA Brutgeräte
Syringe Omnican F 1 mL	Braun	09161502S
Extracts	PEKISH extract library
Lamp Tempo Nr. 119	ORBAN