JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כל המינים לישמניה פתוגניים שוכנים וישכפלו בתוך המקרופאגים של מארחיהם חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדביק מאתר מקרופאגים הנגזרות מח עצם בתרבות עם לישמניה, ואחריו כימות מדויק של קינטיקה גידול תאיים. שיטה זו שימושית עבור לימוד בודדים הגורמים המשפיעים על אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, לישמניה התקפה אלימה.

Abstract

מחזור החיים של לישמניה, סוכן סיבתי של שושנת יריחו, נחליף בין שלבים promastigote, amastigote פנימה החרק ומארח חוליות, בהתאמה. בעוד תסמינים פתוגניים של שושנת יריחו, יכולה להשתנות מ שפיר נגעים עורית לטפסים מחלה קטלנית מאוד מהבטן תלוי בזן זיהומיות, כל המינים לישמניה שוכנים בתוך המקרופאגים מארח במהלך שלב חוליות מחזור החיים שלהם. לישמניה infectivity ולכן קשורה ישירות את יכולתו לפלוש, לשרוד, לשכפל בתוך וקואלות parasitophorous (PVs) בתוך המקרופאגים. לפיכך, הערכת היכולת של הטפיל לשכפל intracellularly מגישה כשיטה אמין לקביעת התקפה אלימה. לימוד פיתוח שושנת יריחו באמצעות מודלים בעלי חיים היא גוזלת זמן, מייגע, לעתים קרובות קשה, במיוחד עם הטפסים הקרביים pathogenically חשוב. נתאר כאן מתודולוגיה לעקוב אחר התפתחות תאיים לישמניה ב מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs). טפיל תאיים מספרים נקבעים במרווחי 24 שעות ביממה עבור h 72-96, בעקבות זיהום. שיטה זו מאפשרת נחישות אמין של ההשפעות של גורמים גנטיים שונים על לישמניה התקפה אלימה. לדוגמה, אנו מציגים כיצד אלל יחיד מחיקה של הגן לישמניה מיטוכונדריאלי ברזל טרנספורטר (LMIT1) וביכולתם של המתח מוטציה לישמניה amazonensis LMIT1/ΔLmit1 לגדול בתוך BMMs, המשקפים ירידה דרסטית התקפה אלימה לעומת פראי-סוג. Assay הזה גם מאפשר שליטה מדויקת על תנאי הניסוי, אשר ניתן לטפל בנפרד כדי לנתח את השפעת גורמים שונים (חומרים מזינים, מינים חמצן תגובתי, וכו '.) על האינטראקציה פתוגן-פונדקאי. לכן, ביצוע המתאימה ואת כימות של מחקרים זיהום BMM לספק חלופה לא פולשנית, מהיר, חסכוני, בטוחה ואמינה ללימודים במודל חיה קונבנציונלי.

Introduction

שושנת יריחו מתייחס לקשת רחבה של מחלות האדם הנגרמת על ידי טפילים protozoan מינים של הסוג לישמניה. כ- 12 מיליון אנשים נגועים כרגע לישמניה ברחבי העולם, בלמעלה מ-350 מליון נמצאות בסיכון. המחלה פתולוגיה תלוי על מינים לישמניה מארח הגורמים, הסימפטומים משתנים בין נגעים בעור ריפוי עצמי לא מזיק לטפסים visceralizing קטלני. אם אינה מטופלת כראוי, מהבטן לישמניה קטלנית, הדירוג רק לאחר מלריה כמו המחלה האנושית הקטלני ביותר הנגרמת על ידי זיהום עם טפילים protozoan1. למרות ההבדלים למחשוב המחלה פתולוגיה ותסמינים, כל המינים לישמניה יש digenic-מחזור חיים לסירוגין בין promastigote ו amastigote שלבים בתוך חרק מארחים חוליות, בהתאמה. בתוך החוליות, לישמניה המטרה המארח מקרופאגים לפלישה, לגרום להיווצרות וקואלות parasitophorous (PVs), תאי חומצי עם המאפיינים של phagolysosomes שבו לשכפל הטפסים amastigote מאוד מידבק. Amastigotes נמשכות ברקמות מארח במהלך זיהומים כרוניים, ניתן להעביר זבובי־חול מצפים נגוע, להשלמת המעגל שידור. לכן, בהקשר של התפתחות מחלות אנושיות, amastigotes הם החשובים ביותר לישמניה מחזור טופס2. חוקר איך לשכפל את amastigotes בתוך מקרופאג PVs הוא קריטי עבור הבנה לישמניה התקפה אלימה3,4,5,6,7 ועבור פיתוח טיפולים חדשניים אפקטיבי.

נתאר כאן שיטה המשמשת באופן קבוע על ידי מעבדה שלנו ללמוד דלקת לישמניה ושכפול של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs), אשר כוללת הערכה כמותית של מספר תאיים לישמניה לאורך זמן. התהליך כרוך קצירת ומונוציטים מ מח עצם העכבר ובידול מקרופאגים בתרבות, זיהום במבחנה עם צורות זיהומיות (metacyclic promastigotes או amastigotes) של לישמניה , כימות מספר תאיים טפילים-בכל פרק זמן של 24 שעות ביממה לתקופה של 72-96 שעות בעקבות זיהום. נעשה שימוש assay הזה במעבדה שלנו כדי לקבוע את ההשפעה של מספר גורמים סביבתיים, טפיל גנים, כולל זיהוי של תפקיד קריטי של ברזל בקידום התקפה אלימה ל' amazonensis היה עוד יותר לאימות על ידי לו טביעות רגל לימודי התפתחות הנגע עכברים6,8,9,10,11,12,13,14,15 . מאז כל המינים לישמניה פתוגניים לבסס את הנישה replicative שלהם בתוך המארח מקרופאגים, וזמינותו הזה יכול לשמש אוניברסלית האישושים התקפה אלימה על כל המינים לישמניה .

ביצוע BMM זיהומים מאפשר ניתוח אינטראקציות מארח-טפיל ברמה תא בודד, ובכך הבנה רחבה יותר של מה טפילים לישמניה לקיים אינטראקציה עם microenvironment מארח המועדפת שלהם, PVs של מקרופאגים. מקרופאג זיהום מבחני בהצלחה שנוצלו על ידי מספר קבוצות16,17,18,19,20,21,22 לחקור פונקציות הן מקרופאג מארח את גנים ספציפיים לישמניה , ואת מעורבותם פוטנציאליים הגומלין המורכבים המאפיינת את זיהום תאיים. זיהומים BMM לאפשר כימות של צמיחה טפיל כמו read-out ההשפעה של המארח גורמים המשפיעים על ההישרדות תאיים, כגון ייצור תחמוצת החנקן microbicidal, דור של מינים חמצן תגובתי, התנאים לוואי אחרים המערכת נתקלה בפנים PVs ליזוזום דמוי23. מקרופאג זיהום מבחני גם כבר מנוצל כדי לזהות הפניות סמים אנטי-leishmanial פוטנציאליים עבור פיתוח טיפולית13,24.

הטבע במבחנה של זיהומים BMM מספקת מספר יתרונות על פני שיטות אחרות כדי להעריך לישמניה התקפה אלימה. עם זאת, מספר מחקרים קודמים בחינת מנגנונים תאיים טפילים לשרוד לאורך זמן לא לכמת זיהום כמו בגודל21,20,קצב24. יתר על כן, מחקרים רבים התמקדו בעקבות זיהומים ויוו לאורך זמן עשו זאת על ידי מדידת גודל הנגע עורית וסימפטומים פיסיולוגיים אחרים הקשורים רק בעקיפין טפיל שכפול25,26 , 27. in vivo זיהום היא גישה מחמירה כדי להעריך את הטפיל התקפה אלימה, אבל מדידות גודל הנגע על סמך לו טביעות רגל ונפיחות לבדו לעיתים לקוי, כפי הם משקפים את התגובה דלקתיים ברקמות נגוע ולא המספר המוחלט של טפילים. מסיבה זו, התפתחות הנגע לו טביעות רגל מבחני חייבת להיות מלווה כימות של עומס הטפיל ברקמות נגוע, תהליך שדורש דילול המגביל ממושך מבחני28. בנוסף, מחקרים ויוו לעתים קרובות כרוך הקרבת בעלי חיים מרובים בנקודות שונות בזמן כדי לחלץ לרקמות של הריבית6,8,9,10, 11 , 13. לעומת זאת, ניתן להשיג מספר רב של BMMs חיה אחת, תאים אלה יכול להיות מצופה בתנאים לאפשר הערכה של זיהום בנקודות שונות בזמן. יתר על כן, בהשוואה ל ויוו מחקרים, ביצוע במבחנה BMM זיהומים מאפשר שליטה רבה יותר על תנאי הניסוי. לכימות של מקרופאגים להידבק יחד עם טפילים עצמם מאפשר שליטה מדויקת של הריבוי של זיהום (MOI) ושל תרבות תנאים. שליטה טובה על גורמים אלה יכולים להיות מפתח לזיהוי מאפייני דיסקרטית מסלולים סלולר, להבין את השפעתם על מהלך של זיהום.

לאור יתרונות אלו, זה די מפתיע כי מעט מאוד קבוצות לימוד לישמניה התקפה אלימה כה מנצלים מלא הערכה כמותית של שכפול תאיים ב מקרופאגים. במאמר זה נדון מלכודות נפוצות עשוי להיות פוגעות ניצול נרחב יותר של זה וזמינותו, ומספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להקל על ביצועה נאות. בהתחשב הדיוק שלה ואת צדדיות, וזמינותו זיהום BMM שנתאר כאן יכול לא רק להיות מנוצל כדי לחקור את האינטראקציות פתוגן-פונדקאי המשפיעים על התקפה אלימה לישמניה , אלא גם ללמוד אחרים המיקרואורגניזמים לשכפל בתוך מקרופאגים29. חשוב, זה וזמינותו יכולים גם להתפתח כשיטת הקרנת טרום קליניים מהיר וחסכוני עבור פיתוח תרופות אנטי-leishmanial.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני נערכו בהתאם להמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים ואושרו על-ידי IACUC של אוניברסיטת מרילנד. כל השלבים המתוארים בסעיפים 1 עד 4 צריכה להתבצע גילוח ורחיצה כירורגית בתוך למינאריים ביולוגי. הגנה אישית אמור לשמש, יש לנקוט זהירות בעת טיפול מטפילים לישמניה בשידור חי לאורך כל השלבים של ניסויים.

1. בידוד ובידול של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs)8,30,31

  1. יום 0: להקריב 4 - נקבה בת שבוע 6 C57BL/6 או BALB/c עכבר בחדר2 CO ואשר מת דרך נקע בצוואר הרחם. להבטיח עיקור של מלקחיים ומספריים על-ידי שמירתן טבולים 70% אתנול. תרסיס כפפות עם 70% אתנול כדי לאפשר סטרילי טיפול לאורך כל תהליך בידוד תאי מח העצם.
  2. באבטחת שהקריבה עצמה העכבר ללוח לנתיחה על-ידי הצמדת שלה forelimbs ולחטא ע י ריסוס בכיף עם 70% אתנול.
  3. עושים חתך קטן (בערך 1 ס מ) עם מספריים ליד מפרק הירך. להוסיף בזהירות מספריים מתחת לעור כדי להפריד את השריר שמתחת. ולחתוך את העור כל הדרך סביב מפרק הירך.
    הערה: ייתכן ניתן לסובב את הלוח לנתיחה כדי לאפשר גישה משופרת מפרק הירך.
  4. בזהירות להפשיל את העור מן הרגל על ידי משיכת לכיוון הקרסול והסר. חתוך את הרגל הקרסול, נזהרים מאוד לחתוך או מתחת לקרסול משותפת לעזוב את השוקה במלואה ללא פגע.
    הערה: השוק בשלב זה מחובר באופן רופף, ניתן להפריד בקלות עם המלקחיים.
  5. אתר באופן ידני מפרק הירך על-ידי מניפולציה עצם הירך כדי לזהות את נקודת הסיבוב. בזהירות להשתמש במספריים לחתוך את הרגל מעל מפרק הירך לעזוב את הראש הפרוקסימלית של עצם הירך ללא פגע.
  6. הסר כמה שיותר שרירים ורקמות ככל האפשר הרגל עם מספריים. הסר כל העור הנותרים הקרסול של חומר עצם עודף מעל מפרק הירך.
  7. מקם את עצמות הרגל נקי RPMI סטרילית בתוספת פניצילין/סטרפטומיצין (1% ריכוז סופי) בצלחת פטרי על קרח.
  8. חזור על שלבים 1.4 עד 1.6 לבודד את שוקה, עצם הירך של הרגל השנייה האחוריות.
  9. הסר כל הנותרים משרירים ורקמות תודה לספוג את RPMI באמצעות מלקחיים סטיריליים ולהב #10 סטרילי.
  10. במקום עצמות על המכסה פטרי. לחתוך עצם השוקה בזהירות הלהב מיד מעל המפרק הקרסול כדי לגשת את מח העצם. להסיר את עצם השוקה משאר חלקי הרגל על ידי חיתוך מיד מתחת הברך.
  11. לצייר 10 מ"ל RPMI סטרילית בתוספת פניצילין/סטרפטומיצין (1% ריכוז סופי) לתוך מזרק 10-mL ולצרף מחט 25 גרם.
  12. החזק את השוקה בחוזקה עם מלקחיים, אנכית על צינור חרוטי 50-mL על קרח. השתמש במזרק להחדיר בעדינות כ- 5 מ ל RPMI לתוך סוף עצם לרוקן את לשד העצם השני לתוך הצינור חרוט. לרוקן את מח העצם עם סך של 10 מ"ל RPMI עד העצם יהפוך לבן.
    הערה: לאחר שטיפה יסודית, העצם צריך להלבין. אם לא, ממשיכים שטיפה להסרת מח. בקצה הדיסטלי של עצם השוקה ייתכן שתצטרך להיות מעוטרים עם הלהב אם זה צר מדי להכניס את המחט.
  13. לחתוך עצם הירך מיד מעל הברך ומתחת מיד מפרק הירך לחשוף בשני קצוות העצם כדי לגשת את מח העצם. ריקון מח העצם של עצם הירך עם סך של 10 מ"ל RPMI באותו אופן כמו עצם השוקה.
  14. חזור על ניקוי וריקון צעדים 1.6 דרך 1.13 עם העצמות הנותרות ולאסוף את התאים במח העצם סמוקות צינור חרוטי בודד 50 מ
    הערה: אם עצם נשברת בשלב כלשהו במהלך ניתוח לפני עצם שטיפה, אין להשתמש את מח העצם מן העצם הזו.
  15. צנטריפוגה צינור חרוטי המשמש לאיסוף מח עצם ריקון מהעצמות ארבע כל 10 דקות ב 4 ° C-300 x g.
  16. 60 מ של אמצעי BMM סטרילי מקם (RPMI עם ריכוז סופי של 20% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1.2 מ מ נה-פירובט, 25 µg/mL מ' אנושי-CSF) לתוך בקבוקון התרבות התא של2 -175 ס מ עם מכסה המסנן.
  17. למחוק את צנטריפוגה הבאים supernatant, resuspend בגדר תא על-ידי בעדינות לאורך pipetting באמצעות 5 מיליליטר BMM בינוני מן הבקבוק.
  18. להעביר תא הבולם הבקבוקון תרבות ולשטוף את הצינור חרוט פעמיים עם BMM בינוני מן הבקבוק תרבות כדי להבטיח התאוששות תא מקסימלי. להבטיח תא ההשעיה ביסודיות שילובו בינונית ולפזר 30 מ ל מן הבקבוק התרבות הראשונית 175 ס' ' מ תא2 אל השנייה 175 ס' ' מ2 תא תרבות בקבוק עם מכסה המסנן.
  19. דגירה בשתי מבחנות המכילות 30 מ ל תא הבולם כל לילה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לאפשר הפרדה של כל fibroblasts מזהמים, מקרופאגים תושב אחר תאים חסיד.
  20. יום 1: להעביר את תגובת שיקוע המכיל תאים במח העצם מובחן של מבחנות 100 מ"מ x 15 מ"מ שאינם TC-מטופלים פוליסטירן צלחות פטרי-כ 10 מ ל/צלחת, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. למחוק את המבחנות.
  21. יום 3 או 4: להוסיף כל צלחת פטרי של בינוני BMM נוספים מ ל 5 (טרום התחמם עד 37 ° C) ולהמשיך הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.

2. ציפוי BMMs על Coverslips זיהום (יום 7 או 8)

  1. להכין תרביות רקמה. ובכן 6 צלחות על-ידי הצבת ארבעה (4) 12 מ מ סטרילי coverslips זכוכית דקה (בלוק, המאוחסן במיכל זכוכית סגור) בחלק התחתון של ריק כל טוב.
    הערה: לאסוף כל coverslip סטרילי 12 מ מ עם הטיפ שואבת מצויד לקו ואקום. מניחים coverslips הבארות ללא חפיפה, שחרור במיקום הרצוי על-ידי צובט את הצינור להפריע ואקום.
  2. וביופסיה מדיה (ומשם תאים שאינם מחסידי) צלחות פטרי מצופה עם מח עצם חסיד נגזר מקרופאגים, בעדינות שטיפה מחסידי תאים 2 x בתמיסת פוספט באגירה של Dulbecco סטרילי ללא סידן, מגנזיום כלוריד (PBS- / -) מראש להתחמם ל- 37 מעלות צלזיוס.
  3. Dropwise, הוסף 5 מ ל 1 סטרילי x PBS- / - עם ריכוז סופי של 1 מ מ EDTA על כל צלחת פטרי ' תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 ° C כדי לנתק מחסידי BMMs. ודא כי התאים מנותקים באמצעות מיקרוסקופ.
  4. איסוף תאים כל תלוש הושעו ב- PBS 1 x- / - בתוספת 1 מ"מ EDTA צינור חרוטי 50 מ. יש לשטוף כל צלחת 2 x 5 מ ל PBS- / - ולהוסיף למאגר ההשעיה התא.
    הערה: תא ההשעיה עשוי להיות מדולל עם PBS נוספים- / - כדי להגן על מקרופאגים מפני רעילות EDTA בתהליך איסוף.
  5. צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend מקרופאגים במדיום BMM 5-10 מ"ל על-ידי pipetting. המקום resuspended תאים על קרח כדי למנוע את הקובץ המצורף כדי הצינורות הצליעה.
  6. ספירת התאים קיימא באמצעות Trypan blue הדרה hemocytometer.
    הערה: כדי לספור תאים BMM resuspended מ ל בינוני, דילול-ערבוב של הבולם תא µL 25 ב- PBS µL 445- / - והפתרון Trypan blue 0.4% 30 µL בדרך כלל מאפשרת כימות קל ב hemocytometer (לקחת בחשבון גורם לדילול 20 x עבור החישוב הסופי ). לספור רק תאים לא להתלכלך עם Trypan blue (התאים קיימא). הנפח של התא ההשעיה עשויה להשתנות אם תערובת זו גם מרוכז, או מדולל. באופן כללי, התשואה של BMM לכל הכנה משתנה בין 2 x 107 ו- 5 x 107 תאים עכבר אחת.
  7. להכין התליה תא BMM בינוני-ריכוז בציפוי הרצוי (5 x 105/mL) ומעוררים ההשעיה ללוחות טוב 6 מ ל 2 בינוני לכל טוב, כך כל אחד טוב מקבל 1 x 106 מקרופאגים.
    הערה: זהו צעד קריטי המבטיחה לכל מקבל היטב מספר הולם של מקרופאגים כדי לכסות על coverslips בצורה אחידה. בדוק כי coverslips בבארות לא חופפים או צף המדיום. אם כן, להתאים בעדינות עם טיפ פיפטה סטרילי.
  8. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.

3. טיהור זיהומיות צורות של amazonensis ל'

הערה: להכין לישמניה זיהומים - לטהר promastigotes metacyclic promastigote נייח תרבויות8,13, או להבדיל promastigotes בתרבות לתוך טופס amastigote באמצעות תקן ל' amazonensis axenic בידול פרוטוקול6,8.

  1. טיהור של promastigotes metacyclic לישמניה שימוש דחיסות צבע media(Materials) 33
    1. להכין תמיסת צפיפות מדיה הדרגתיות במים סטריליים, ללא אנדוטוקסין מניות 40%.
    2. לדלל פתרון הדרגתי צפיפות בינונית 10 x M199 (ללא סרום) להכין 10% ריכוז של המדיום M199.
    3. לסנן את כל הפתרונות דרך מסנן מיקרומטר 0.22.
      הערה: ניתן לאחסן מלאי פתרונות בבית 4 oC בחשכה לא יותר מ- 1 חודש.
    4. להוסיף 2 מ של 40% צפיפות מדיה הדרגתיות פתרון בתחתית של שפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL.
    5. שכבה 2 מ של 10% צפיפות מדיה הדרגתיות פתרון M199 מעל 40% צפיפות מדיה מעבר צבע השכבה בקפידה, באמצעות פיפטה פסטר כדי למנוע כל ערבוב בין שתי השכבות.
    6. לאסוף עונה 1 פרק 109 טפילים מתרבות נייחים-שלב על ידי צנטריפוגה-1,900 g x עבור 10 דקות.
    7. Resuspend תאים של 6 מ ל Dulbecco שינוי מהותי בינוני (DMEM).
    8. שכבה 2 מ"ל של התליה תא ישירות מעל 10% צפיפות מדיה הדרגתיות שכבה, בעדינות, בעזרת פיפטה פסטר כדי למנוע ערבוב בין שכבות.
    9. Centrifuge מעבר הצבע 10 דקות ב 1300 g x בטמפרטורת החדר.
      הערה: עקב הבדלים במאפייני הפיזי בין מינים לישמניה , צנטריפוגה התנאים עבור כל אחד ייתכן יותאם מעט כדי להבטיח מקסימום תשואה.
    10. לאסוף טפילים (מועשר בצורה metacyclic promastigote) הלהקה שהוקמה על הגבול מדיה מעבר הצבע העליון 10% צפיפות (ממשק בין 0% ל- 10% צפיפות מדיה הדרגתיות השכבות).
    11. לדלל טפילים עם אמצעי אחסון אחד של DMEM, לאסוף על ידי צנטריפוגה (1,900 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר).
    12. Resuspend 500 µL DMEM בינוני, בפנים hemocytometer לכמת את התשואה.
  2. דור של ל' amazonensis amastigotes בתנאים תרבות axenic (pH נמוך / גבוה טמפרטורה)6,8,13
    1. מיקס 5 מ של יומן-שלב promastigote התרבות (pH 7.4-26 oC) עם אמצעי אחסון שווה amastigote בינוני (pH 4.5), באמצעות 25 ס מ2 מבחנות (סה כ 10 מ"ל בינוני), דגירה בטמפרטורה 26 ° C בלילה.
    2. להעביר את הבקבוקון של 26 מעלות צלזיוס 32 ° C.
    3. אחרי 3 או 4 ימים, לפצל את תרבות 1:5 בתקשורת amastigote-32 מעלות צלזיוס.
    4. בדוק הטפילים תוך ימים 3-4 (מקסימום 7 ימים) כדי לראות אם הם מוכנים לשימוש זיהומים.
      הערה: amastigotes axenic בריא צריך צורה אליפטית, בלי שוטון גלוי. Amastigotes הבדיל חלקית יש צורה אובלית גדולה עם שוטון קצר. התרבות לא צריך הרבה גושים - גושים רבות מעידות על שאינם בצמיחה, גוסס טפילים. התרבות amastigote ניתן יהיה לפצל 1:5 ומתוחזק לתקופה מקסימלית של 3 שבועות.

4. זיהום עם ל' amazonensis

  1. לדלל טפיל המתלים לפי הרצוי MOI (בדרך כלל 3-5 metacyclic promastigotes לכל מקרופאג [MOI של 1:3 או 1:5]), amastigote 1 לכל מקרופאג [MOI 1:1]. להוסיף לישמניה ב- PBS- / - באמצעי אחסון של 50-100 µL כל טוב כבר המכיל 2 מ"ל בינוני.
  2. תקופת דגירה BMMs של h 1 עם amastigotes ו- h 3 עם promastigotes metacyclic-34 oC זיהום.
    הערה: טמפרטורה אופטימלית זיהום עשויים להשתנות על ידי מינים.
  3. בעקבות דגירה, ביסודיות לשטוף טפילים חינם בכל טוב 3 x 2 מ ל PBS- / - מראש ומחוממת ל- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: לפזר PBS בעדינות כדי להבטיח כי coverslips לא לרחף מעל אחד את השני. מערבולת בעדינות את הצלחת, אז תשאף החוצה הנוזל. השתמש עצה שואבת נפרד אם משתמש זנים רבים של טפילים כדי למנוע זיהום צולב.
  4. תקן 1 h או 3 h דגימות נקודות זמן על-ידי המקננת בכל טוב עם 1.5-2 מ ל 2% מחברים ב- PBS- / - במשך 10 דקות לשטוף 3 x עם PBS- / -. לא תשאף שטיפה אחרונה ומעבירים צלחות המכיל coverslips ב- PBS עד מכתים.
  5. להוסיף 2 מ"ל טריים BMM בינוני מכל קידוח על צלחות במשך יותר זמן-נקודות, דגירה ב 34 מעלות צלזיוס.
  6. לתקן הנותרים בזמן נקודות כמו הרצויה כפי שמתואר בשלב 4.3, ומעבירים לוחות עד מכתים.

5. דאפי מכתים מכשירי הרכבה Coverslip

  1. האחות PBS מבארות המכיל coverslips ולהוסיף 1.5 mL PBS- / - עם חומר ניקוי ללא יונית 0.1%. תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שטיפת 3 x 2 מ ל PBS- / -.
  2. להוסיף 1 מ"ל PBS- / - עם 2 µg/mL דאפי (מדולל מהפתרון מניות 5 מ"ג/מ"ל מים) וולס המכיל coverslips, תקופת דגירה של עוד 1 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: זמן הדגירה עם דאפי חיוני להמחשת נאותה של טפילים לישמניה תאיים. מקרופאג גרעינים כתם במהירות, עקב שלהם גדול יותר, ה-DNA תוכן אך מכתים של הגרעינים של טפילים תאיים הוא איטי יותר. לפיכך, הארכת זמן הדגירה מעבר מה נדרש כדי להמחיש את הגרעינים BMM יש צורך לאפשר דאפי לחדור דרך קרום פלזמה טפיל, ואת קרום גרעיני טפיל. עם הכתם דאפי נכונה, kinetoplast דנ א מיטוכונדריאלי ליד כיס השוטוניים של הטפיל גם להיות visualized, בנוסף ה-DNA הגרעיני.
  3. רחיצת כל טוב המכיל coverslips 3 x עם 2 מ"ל PBS- / - ומעלית ואז ו- flip coverslips עם מלקחיים למקם את הצד תא למטה, הר על זכוכית מיקרוסקופ שקופיות עם ריאגנט הרכבה antifade זמינים מסחרית.
    הערה: Coverslips הם רגישים במיוחד ואני צריך טיפול זהיר. למנוע הפעלת לחץ עליהם, במיוחד נגד sidewall הבארות בעת הרמת. הוספת כמה טיפות של PBS- / - מפחית מתח בין coverslip לבין טוב ואסטמה ומקילה על תהליך הרמת. מחט מד בסדר עשוי לשמש כדי לסייע חטטניות על coverslips מתחתית הבאר. לאחר הנחת coverslip בשקופית, לחץ בעדינות למטה עם מלקחיים לדחוף החוצה כל בועות האוויר בכלי התקשורת הרכבה. אם coverslip שבור או יכול להיות זונה, במהלך תהליך הרמת, לא טען מחדש; פשוט להשתמש את חילוף coverslip הרביעי.
  4. להכניס למקרר שקופיות עד כמת.

6. זיהום כמת

  1. לבחון שהוכתמו דאפי שקופיות תחת מיקרוסקופ זריחה על ידי התמקדות מקרופאגים באמצעות 100 X עדשה המטרה בשמן טבילה (עירור-358 ננומטר; פליטת אופטימלית-461 ננומטר).
    ודא כי המוקד על השכבה של מקרופאגים בין שקופיות זכוכית coverslip.
  2. לכמת את המספר של מקרופאגים (גרעינים גדולים צבעונית עם דאפי) ומספר קטן יותר גרעינים amastigote סביב כל גרעין מקרופאג (ראה איור 2A, דאפי) עבור כל שדה הראייה, באמצעות מונה ידנית.
    הערה: גרעינים Amastigote ייתכן לא כולם יהיו גלויות במישור אחד של המוקד בשל גודלם הקטן. נחשב הנראים לעין כאשר ממוקדת מקרופאג גרעינים, ולאחר מכן להשתמש להתמקד בסדר כדי לבדוק אם הטפיל גרעינים במישורים מעל ומתחת גרעינים מקרופאג.
  3. להעביר עוד שדה הראייה לחזור על כימות. להשתמש במפתח מונה נפרד כדי לעקוב אחר מספר שדות נספרים. להזיז visual השדות בשורות מקבילות על פני כל coverslip, כדי למנוע ספירת חפיפה.
  4. לכמת מינימום של מקרופאגים 200 לכל coverslip. לכמת כל הזמן-נקודה של זיהום שהפקידים (3 coverslips). לספור את coverslip הרביעי אם לאחד הקודמת אינה מתאימה עבור ספירה בשל חפיפה coverslip, הרכבה המסכן, זכוכית שבירה, וכו '
    הערה: אם מקרופאגים 200 שאי אפשר לסמוך על כל אחד coverslip, לסמוך את הגלגל הרזרבי הרביעי.
  5. לחשב שיעורי הזיהום מקרופאגים מקרופאג/amastigotes או amastigotes/100 ולקבוע מקרופאגים נגוע אחוז מהנתונים הגולמיים כמת.

תוצאות

לישמניה יש שתי צורות זיהומיות - promastigotes metacyclic, זאת להבדיל procyclic promastigotes בשלב נייח של התרבות, amastigotes, אשר נמצאים בשלבים תאיים (איור 1). במינים מסוימים לישמניה כגון ל' amazonensis, amastigotes גם ניתן להבחין בין תרבות axenic על ידי הסטת התאים promastigote להורדת pH (4.5) ?...

Discussion

הנתונים הכמותיים המיוצר על ידי זיהום BMM וזמינותו שתוארה לעיל, מאפשר חוקרים כדי להשיג את המחירים של זיהום ונחישות אמין של שינויים במאפייני התקפה אלימה בתוך פרק זמן קצר יחסית (מקסימום 2 שבועות, בהשוואה ל- 2 חודשים הדרושים לניסויים ויוו ). שיטה זו מתבססת על ה-DNA ספציפיים לצבוע דאפי, במיוחד כ?...

Disclosures

המחברים מצהירים שיש להם אינטרסים כלכליים, מתחרה לא

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק RO1 AI067979 NWA.
YK היא זוכת מלגת תואר ראשון מ הווארד יוז המכון/האוניברסיטה הרפואית של מרילנד קולג פארק.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well cell culture plateCellstar657160
AdenineAcros OrganicsAC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL)Fisherbrand02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL)Fisherbrand02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL)Fisherbrand02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10Aspen Surgical371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL SyringeBecton Dickinson (BD)309604
BD Precisionglide Needle, 25G Becton Dickinson (BD)305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mmCellstar627 160
Cell Culture FlaskCellstar660175
Cover Glasses: 12 mm circlesFisherbrand12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306
D-BiotinJ.T. BakerC272-00
EDTASigma AldrichEDS
Ethyl alcohol 200 proofPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dishCorning351029
Fetal Bovine SerumSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
Fluorescence MicroscopeNikonE200
Goat anti-mouse IgG Texas redInvitrogenT-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LTDH0008
HEPES (1M)Gibco15630-080
Isoton II DiluentBeckman Coulter8546719
L-GlutamineGemini400-106
Medium 199 (10X)Gibco11825-015
Na pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
ParaformaldehydeAlfa Aesar43368
Penicillin/StreptomycinGemini400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-)ThermoFisher14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mLCellstar188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mLCellstar227 261
ProLong Gold antifade reagentThermoFisherP36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank1D4B
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer Hausser Scientific1492
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Triton X-100 SurfactantMillipore SigmaTX1568-1
Trypan BlueSigma AldrichT8154
Delicate Scissors, 4 1/2"VWR82027-582
Dissecting Forceps, Fine TipVWR82027-386
Microscope SlidesVWR16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual ThresholdBeckman Coulter6605699

References

  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133macrophageparasitophorous

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved