בידוד של בלוטת Mandibular תוכן המאגר של אפור פרווה "פיצוץ של הנמלים (Formicidae) לניתוח Volatilome על ידי GC-MS ו- MetaboliteDetector

Michaela Hoenigsberger; Alexey G. Kopchinskiy; Alexandra Parich; Karsten Hiller; Alice Laciny; Herbert Zettel; Linda B.L. Lim; Kamariah A. Salim; Irina S. Druzhinina; Rainer Schuhmacher

doi:10.3791/57652

Summary

עובדים מינור של המין נמלה Colobopsis explodens ביתר כדי לבודד את התוכן כמו שעווה המאוחסן שלהם מאגרים בלוטת mandibular מתעצם הממס-מיצוי הבאים וניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית. ביאור וזיהוי של המרכיבים נדיף בתוכנות קוד פתוח MetaboliteDetector מתואר גם.

Abstract

המטרה של כתב יד זה היא להציג את פרוטוקול המתאר את הניתוח metabolomic אפור פרווה "מתפוצץ הנמלים" השייך לקבוצת Colobopsis cylindrica (COCY). למטרה זו, המין דגם explodens ג הוא בשימוש. נמלים השייכים קאסטה עובד קטין בעלי בלוטות mandibular מתעצם ייחודי (המקלעים). בקרב טריטוריאלית, הם משתמשים התכנים צמיגה מאגרי מוגדלות בלוטת הלסת שלהם (MGRs) להרוג יצורים פרוקי רגליים המתחרה באופייני אובדניות 'פיצוצים"מאת קרע מרצון של בעור gastral (autothysis). אנו מראים את הקרע של העובד נמלים ממין זה על הבידוד של החלק gastral של התכנים MGR דמוי שעווה, כמו גם פירוט הצעדים הנדרשים הדרושים עבור הממס-מיצוי של תרכובות נדיפות כלולות בו בגז עוקבות כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS) ניתוח וזיהוי בשם של מטבוליטים הכלול התמצית. ההליך ניתוח מבוצע בתנאים מקורר, ללא השימוש בכל ניתוח בופר כדי למזער את השינויים בהרכב הכימי של התכנים MGR. לאחר החילוץ ממס מבוסס של מטבוליטים נדיף הכלולים בו, מוצגים הצעדים הדרושים לניתוח הדגימות באמצעות נוזלי-הזרקת-GC-MS. לבסוף, עיבוד נתונים וזיהוי מטבוליט בשם עם השימוש של תוכנת קוד פתוח מוצג MetaboliteDetector. עם גישה זו, יצירת פרופיל וזיהוי של מטבוליטים נדיף ב MGRs של נמלים השייכים COCY הקבוצה באמצעות GC-MS, התוכנה MetaboliteDetector להיות אפשרי.

Introduction

המטרה הכוללת של זרימת העבודה המוצגת כאן היא החקירה כללי של יצירות כימיות הפרשות של חרקים. הדבר נעשה במטרה העיקרית שחקרתי את התפקידים האקולוגיים של הפרשה כולה, או של יחיד תרכובות הימנו. יתר על כן, אנו מעוניינים לחקור את מסלולים מטבוליים המשמשים כבסיס תרכובות שנמצאו ההפרשות המתאימות. במיוחד בלוטת התוכן של נמלים (דבוראים, Formicidae) השיגו עולה הריבית בשנים האחרונות, משום שהם מספקים מקורות של תרכובות ביו פוטנציאל הלא־נודע עד אז (דבקים, antimicrobials, וכו ')¹^, ². עובד קטין נמלים של מינים אחדים השייכים COCY³^,של קבוצה⁴ עשוי לספק תרכובות כגון הכלול שלהם MGRs מביצה אשר להאריך מן mouthparts⁵^,גסטר⁶. כאשר מאוים על ידי אויבים בשם, מינורי עובדים של explodens ג⁷ , כמה הקשורות מינים יכול לעשות שימוש MGR שלהם תוכן בצורה יוצאת דופן: הם הקריבו את עצמם על ידי קריעה שלהם קיר gastral כדי להוציא את תוכן דביק MGRs מטען אל היריב, אשר האויב בשם נעצר, אולי אפילו למות⁵^,⁶^,⁸^,⁹. מטרת הפיתוח והשימוש מהשיטות שהוצגו במסמך זה היה כדי לשפר את ההבנה של ההרכב הכימי ואת טבעה של המרכיבים רעילים באופן לא סופי של הפרשת זה נמלה.

למטרה זו, אנו מציגים עבור ניתוח explodens ג נמלים העובד כדי להשיג את החלק gastral של התוכן MGR שלהם כמו שעווה עם הממס-מיצוי הבאים וניתוח על ידי GC-MS פרוטוקול.

GC-MS ניתוח הוא אחת השיטות ומבוססת על פרופיל ועל זיהוי של מטבוליטים נדיף (volatilome) מפני חרקים. Analytes הטיפוסי עניין בנמלים כוללים פחמימנים cuticular¹⁰, semiochemicals¹¹, באופן כללי, תרכובות עם פעילות ביולוגית¹². ניתן לקבל דוגמאות חיות שלם או חלקי גוף ונוזלים מבודדים באמצעות ניתוח של חרקים¹³^,¹⁴. טכניקות להכנת מדגם כוללים חילוץ של מטבוליטים כלולות בו עם השימוש בממיסים¹⁴ או קראוון-מוצק-שלב-microextraction (HS-SPME)¹⁵.

ללימודים metabolomic, זה חיוני כי הדגימות מוקפאים במהירות ישירות לאחר דגימה, על מנת לצמצם לשינויים כימיים בהרכב וכמות של תרכובות. הנמלים נעשה שימוש במחקר זה נהרגו על ידי הקפאה מהירה באתר בתוך תיק מגניב ממולא חבילות קר בהקפאה עמוקה. הדגימות אוחסנו ואז במקפיא-20 ° C באמצעות מונחי-מחולל חשמל, לפני שהם מועברים למעבדה בקרח יבש. ההליך לנתיחה המובאת כאן מציעה את האפשרות לבודד MGR תוכן ללא ניתוח כל נמלה או את גסטר בכללותה, כפי שנהגו לעשות לפני¹⁷^,¹⁶^,מינים COCY שונים¹⁸. יתר על כן, הפרוטוקול הציג גם מאפשרת גישה ישירה וניתוח של בלוטות, רקמות, כמו ארס בלוטת (VG)⁵^,⁸, של דופור בלוטת (ג'י)⁸או המעיים במחקרים ביולוגיים אחרים, או שמסביב בדוק אם אפשרי קרוס-מציג הציג במהלך הטיפול או לקרע של הנמלים. כדי למזער את השינויים בהרכב הכימי של התכנים MGR במהלך ניתוח, דגימות שהביקושים או באמצעות שימוש בכימיקלים, תהליך ניתוח היה מותאם יבוצע על חבילת קר (-20 ° C), ללא שימוש כלשהו מאגרים נוספים, פתרונות כביסה, או ממיסים. הדגימות להשיג באמצעות שיטה זו מתאימים לענות על שאלות כמותיים.

ניתוח נתונים לצורך ביאור מטבוליט בשם וזיהוי מתבצעת באמצעות תוכנת קוד פתוח MetaboliteDetector¹⁹, אשר פותחה לניתוח אוטומטי של נתונים מבוססי-GC-MS גליקומיקס. זה יזהה יון בודד פסגות נוכח chromatograms, מבצעת צעד deconvolution, תמציות ספקטרום המוני deconvoluted של תרכובות כימיות הכלול הדגימות שנותחה. זיהוי בשם של תרכובות עם MetaboliteDetector מבוסס על מדד השמירה נחוש (RI; Kovats רי יכול להיות מחושב באופן אוטומטי על ידי התוכנה) כמו גם הדמיון של ספקטרום המוני deconvoluted. אר אי ההתאמה ספקטרלי גורם יכול להיות הצלבת נגד או ספריות ההפניה הקיימת (זה יכול להיות מיובאים, אם הם בתוך התבנית הנפוצה NIST), או ספריה הוקמה. זאת בהתאם להנחיות לזיהוי (בשם) מתחם הציע, למשל, על ידי כימי ניתוח עובד קבוצה (CAWG) של גליקומיקס סטנדרטים יוזמה (MSI), שם לפחות שני נתונים עצמאי אורתוגונלית ביחס תרכובת אותנטי (כאן החזקת זמן (RT) /RI וספקטרום המוני) ניתח תחת בתנאים זהים ניסיוני מוצעים לפי הצורך כדי לוודא שאינם-רומן מטבוליט ההזדהויות²⁰.

הניסוי מלאה מתנהל על התוכן MGR של המין דגם COCY explodens ג, אך השלבים לנתיחה ניתן להתאים גם לבודד את בלוטות אחרות נוכח גסטר נמלה. יתר על כן, בזמן שאנו מציגים עבור ניתוח מקיף של volatilome של התוכן MGR, החלקים כללית יותר של זרימת העבודה המתארת החילוץ, פרוטוקול GC-MS מדידה והערכה נתונים יכול לשמש גם לצורך ניתוח ו (בשם) זיהוי של מטבוליטים הפכפך באופן כללי.

מאז הניסויים המתוארים בכתב היד מתבצעת על חרקים, נדרש אישור לא אתית. עבודת שטח, דגימה של הנמלים, כמו גם את השימוש שלהם לפרסום הם בהתאם להנחיות המסדיר את הפרויקט הזה דרך את Universiti ברוניי דארוסלאם, מחקר של ברוניי, מרכז חדשנות, של ברוניי היערנות, ברוניי דארוסלאם דארוסלאם.

Protocol

1. אוסף של נמלים

לאסוף נמלים העובד משנית עם שימוש העצמות (איור 1).
מיד לאחר דגימה, לתקן את הנמלים על-ידי הקפאה מהירה ב-20 ° C, לאחסן אותם זה או בטמפרטורה נמוכה עד הניתוח.

2. בידוד של מונסיניור תוכן, די. ג'י מן הנמלים

לפני ניתוח נמלים, הכן את הפעולות הבאות:
1. ניקוי זכוכית הפטרי והמכשירים לנתיחה באמצעות תערובת מים מתנול (MeOH/H₂O; 1 + 1 v/v) ורקמות.
  התראה: MeOH הוא רעיל לבני אדם. תמיד ללבוש כפפות המתאימות, חלוק מעבדה, משקפי מגן, לבצע את הניקוי ברדס fume.
2. להקפיא את הקור ואת חבילת הזכוכית, צלחת פטרי ל-20 ° C.
3. לקבוע את ההמונים של 1.5 mL פתיל קצר בקבוקונים כולל מזרקי עם סיליקון/טפלון (PTFE) septa ולשמור אותם על קרח ישירות לצד המיקרוסקופ.
  הערה: הבחירה של הבקבוקון הדגימה היא אופציונלית. . כאן, התוכן MGR מוכנסים ישירות לתוך mL 1.5 מקורר צלוחיות מזכוכית. פלסטיק יכול להכיל תרכובות (למשל, כי) שעלולות לגרום חפצים, המפריעים האותות של מטבוליטים היעד.
4. המקום הלהקה קרים קפואים לתוך תיבת עשוי extruded קצף פוליסטירן. מקום הפטרי על גבי חבילת קר ולשים נמלת קפוא לתוך המנה. לטעון את תיבת תחת מיקרוסקופ סטריאו. התאם את רמת ההגדלה (20-40 X) ואת המיקוד עד נמלה כל ניתן לראות בבירור.
בדוק הנמלה קפוא לאמינותה של תאים gastral שלה. דיסקציה, סעו רק נמלים עם אזור גסטר שלם (איור 2 א, ב'). הכללת נמלים עם gasters שטוח או עקבות של תוכן MGR מוקשח על משטחים הגוף שלהם מניתוח נוסף (איור 2C, יח).
לתפוס את הנמלה שנבחרו עם זוג מלקחיים שקצהו בסדר-propodeum (קטע בטן ראשון) ועם אחרים זוג מלקחיים-הפטוטרת (מקטע השני בטן). ניתוק האזור גסטר על-ידי בעדינות משיכתו הרחק משאר הגוף נמלה (איור 3 א).
לתקן את גסטר נמלה עכשיו מופרדים על-ידי החזקתה עם מלקחיים שקצהו פיין-tergite 4. עם עוד זוג מלקחיים שקצהו בסדר תפוס tergite 1 (ממוקם ליד הפטוטרת), בעדינות להסיר אותו באמצעות פילינג זה ביטול (איור 3B). חזור על הפעולה גם עבור tergites 2 ו- 3 (איור 3C, D) עד החלק gastral של MGRs (צהוב הצבעוניים explodens ג העובד נמלים, אבל הצבע של התוכן מ ג יכול לנוע בין לבן מעל צהוב אדום במינים אחרים) גלוי ביותר חלק.
הערה: על-ידי הסרת שלד חיצוני, הקרום של מונסיניור גם חלקית יוסרו.
על ידי שימוש מחט לנתיחה, בעדינות להסיר תוכן כמו שעווה MGRs לזווג על ידי גירוד אותם מתוך תא gastral (איור 3E). רק להסיר אותם חלקים של התוכן MGR ניתן לבודד בלי לקרוע נוכח גסטר נמלה בלוטות אחרות. אם כוח או מאמצים יותר צריך להיות מיושם כדי לקבל את התוכן MGR בכללותה, לקבל הוצאתה לא שלם (איור 4).
לאסוף את התוכן MGR. מלנגוע בעדינות עם קצה המחט לנתיחה עד דבוקים אליו. ואז להעביר את התוכן MGR לתוך בקבוקון פתיל קצר 1.5 מקורר עם הידוע להקרע מסה.
1. כדי להסיר את התוכן MGR דביק קצה המחט לנתיחה, להזיז את מחט אל הקיר של הבקבוקון לדוגמה, למרוח אותם על גבי הקיר. סוגרים את הצנצנת ומניחים אותו על הקרח עד התכנים MGR הבא מבודדים.
כדי לבדוק מאוחר יותר עבור זיהום לחצות אפשרי של המדגם תוכן MGR תרכובות שמקורן DG סמוכים (סעיף 6), גם לאסוף DGs נמלים, שבו הם נמצאים עדיין שלם (איור 4) ולשים אותם לתוך בקבוקון HPLC נפרדים.
תמיד מנקה את צלחת פטרי וכלי ניתוח עם MeOH/H₂O (1 + 1 v/v), בעת שינוי בלוטת בלוטת או נמלים נמלים.
דוגמא אחת אנליטית, לשלב את תוכן המאגר או בלוטות של נמלים מרובים.
הערה: מספר בלוטות או התוכן שלהם משמש דוגמא אנליטית אחת עשוי להשתנות בהתאם לעיצוב הניסוי. כאן, או MGR תוכן או ביחידות נתונים של נמלים חמש היו איחדו להשיג דוגמא אחת אנליטית.

3. הממס-הפקת תוכן בלוטת מבודד

לקבוע את ההמונים הדגימות אנליטי (כאן, מונסיניור תוכן או בלוטות סמוכות איחדו בין נמלים חמש).
להוסיף טוהר גבוהה כקרח אתיל אצטט (EtOAc) על יחס קבוע של 1:14 w/v ו מערבולת הדגימות למשך 5 דקות בתנאים מקורר; . הנה, הופיעה ב 7 ° C במעבדה thermostated.
Centrifuge את הדגימות 10 דקות ב g x 3,820 ב 7 ° C ולהעביר את supernatants (בערך 55-75 µL עבור תמצית התוכן MGR המתקבל נמלים חמש) לתוך mL 1.5 טרום מקורר פתיל קצר שבקבוקי המכיל 0.1 mL מיקרו-מוסיף. חותם בחוזקה את הבקבוקונים עם מזרקי המכיל חורים, septa גומי אדום/PTFE.
הערה: אם ניתוח לא יכול להתבצע באופן מיידי, שמור את התמצית ב-80 מעלות צלזיוס עד הניתוח, אבל זה מומלץ לנתח דגימות מיד לאחר ההכנה כדי למזער את הסיכון של שינויים כימיים במהלך מחזור הקפאה \ הפשרה.

4. GC-MS

עבור רצף מדידה מלאה של GC-MS, הכן את הפתרונות הבאים, כל בקבוקון פתיל קצר 1.5 מ:
1. הכן תערובת calibrant רי על ידי דילול אלקאן זמינים מסחרית פתרונות סטנדרטיים ריכוז סופי של 8 מ ג/ליטר לכל המתחם באמצעות הקסאן.
2. להכין הממס-ריק המורכב EtOAc טהור.
המקום לחלץ הבקבוקונים המכיל 1) הממס-בלנק, 2) רי calibrant תערובת, 3) MGR תוכן ותוכן 4) DG לחלץ במגש מקורר (10 ° C) של תעשיה מצמידים שמוצאים (GC).
הערה: מומלץ לצמצם את משך הזמן שכל בקבוקון נשמרת על תעשיה לפני המדידה. לקבלת דוגמאות קריטיים, כמו MGR לדגימה התוכן, המבחנה עלולה להיות מוצב בתוך תעשיה מיד לפני ניתוח.
עבור כל דגימה, להזריק µL 1 aliquot לתוך GC-MS להפרדה כרומטוגרפי על עמודה מתאים תרכובות היעד (כאן: HP - 5MS UI עמודה).
1. קבע את הפרמטרים המתאימים GC, אשר עשוי להיראות כדלקמן:
  1. שתשמש המוביל גז הליום ולהגדיר זרם טור קבוע של 1 מ"ל לדקה סט הרמפה טמפרטורת התנור החל מ- 40 ° C עם חסימה למשך 2 דקות, ואחריו כבש של 10 ° C/דקה עד 330 ° C, עם זמן המתנה של לפחות 7 לקבוע את הטמפרטורה כניסת 270 מעלות ג.
  2. לבחור, במידת הצורך, התאם את היחס פיצול להזרקה GC-MS כתוצאה בצורות שיא נאותה ועוצמות עבור תרכובות של הריבית (איור 5).
    הערה: בדוגמה הציג היה צורך למדוד את תמצית DG פיצול יחס של 2:1, את התערובת calibrant רי במצב splitless. תמצית התוכן MGR נותחו פיצול יחס של 2:1, בפעם השנייה ב- 50:1.
  3. הגדר את הטמפרטורה עזר 350 מעלות צלזיוס.
2. להגדיר את הפרמטרים של המסה-ספקטרומטר (MS) כדלקמן: MS מקור הטמפרטורה 230 ° C, טמפרטורה MS Quad 150 ° C, סריקה נעות בין 30 מסה נמוכה למיסה גבוהה 500, solvent לעכב 4.1 min (לדוגמאות הממס-blank ו ניסיוני) או מין 6.1 (עבור RI calibrant תערובת) , בהתאמה. הגדר את קצב הסריקה סריקות כ 3/s.
  הערה: הפרמטרים MS, במיוחד MS סריקה-, קצב, הדגימה זמן מחזור עשוי להשפיע על שיא האיסוף, ספקטרום deconvolution, יש לקחת בחשבון בעת בחירת הגדרות הפרמטר להערכה הנתונים המתאימים בתוכנת ה-MetaboliteDetector.
כאשר המדידה הושלם, לייצא את הנתונים כטקסט. AIA פרוייקט קובץ (מתבצעות כאן עם השימוש של תוכנת ניתוח נתונים הנכללת GC) בהתקן אחסון נתונים יביל.
1. בחר קובץ | ייצוא נתונים לתבנית AIA., ואז לבדוק את יצירת ספריה חדשה , לחץ על אישור. בחר את מיקום האחסון המבוקש (למשל, כונן הבזק מסוג USB) ולחץ על פתח. בחר את הקבצים להיות מיוצא וללחוץ על הסמל ---> . אשר עם לחיצה על התהליך.

5. מטבוליט איתור וזיהוי עם השימוש של MetaboliteDetector תוכנה

לפני תחילת הניתוח של קבצי נתונים, פתח את MetaboliteDetector, בחר בפקודה כלים | הגדרות, ולהגדיר את הפרמטרים הנדרשים כמפורט (גליונות בודדים של MetaboliteDetector מסומנים באותיות מודגשות):
1. בגיליון של המראה, הגדר ציר הזמן מין ולאפשר באפשרות תוויות צירים.
2. בגליון Deconvolution, קבע את הפרמטרים כדי שההגדרות שיא: שיא הסף: 10 ומינימום שיא גובה (רעש יחידות): 10. בטל הפעלת התאמה בסיסית. קבע את הפרמטרים לגילוי מטבוליט: פחי/סריקה: Deconvolution 10, רוחב (סריקות): 5, בעוצמה הנדרשת (% של הבסיס שיא): 0, המספר הנדרש של פסגות: 10.
3. בגיליון של זיהוי, הגדר את האפשרות ספריית חיפוש: מתחם Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes' וכדי NIST (NIST sqlite ספריה ניתן לכלול בתבנית .lbr). הגדר את פרמטרי כדלקמן: מקס. רי ההבדל: 10, הפסקת הציון: 0.9, קומפוזיציה טהור/Impure: 0.5, מספר קטעים: 2, המספר המינימלי של השבר זהים.: 1. שימוש בגווני lib: תיקתק; דמיון ציון: ואסתטיקה דמיון; מסנן המונים: מ/z 207, 221, 281, 355 ו- 1147 (עבור מזהמים ידוע הנובעים השלב נייח של העמודה GC).
4. בגיליון כימות קבע את הפרמטרים עבור: מספר כימות יונים: מרחק מינימלי 3, יונים הבאים: 5 ומדד האיכות הנדרשת מינימלי: 1. אל תכלול היונים כימות 207, 221, 281, 355 ו- 1147.
  הערה: במקרה של רזולוציה גבוהה נתונים MS, בנוסף להגדיר את הפרמטרים הבאים בגיליון Centroid כדי: שיא סף מתחילים: 10, שיא סף סוף:-5, והמרחק בסיסית מקסימלי: 30, FWHM: 0.5.
לייבא את הקבצים. תבנית CDF הכלול את שנוצר. AIA פרוייקט תייק בתור. NetCDF לתוך התוכנה MetaboliteDetector על-ידי בחירה קובץ | ייבוא | ייבוא NetCDF. בחר בסמל בצורת תיקייה, ולאחר מכן בחר את הקבצים עבור הקטגוריות המדגם להיות מיובאים, עיבוד: 1) הממס-blank, 2) רי calibrants, תמצית התוכן 3) MGR ואת תמצית תוכן 4) די. ג'י. אשר עם אישור להתחיל עיבוד נתונים. לאחר עיבוד, בחר סגור בחלון הופעה.
כיול RI ונחישות של ערכי RI של תרכובות הכלול תמצית MGR, בחר קובץ | פתוח ובחרו את הקובץ המכיל את הנתונים של calibrants רי.
1. לאחר פתיחת הקובץ calibrant רי, בחר על סמל זכוכית המגדלת . לאשר את החלון המופיעים עם אישור.
2. לכיול RI נכונה, בדוק את טווח alkanes לזיהוי בקובץ calibrant רי.
  1. לשם כך, בחר את המשולש המופיעים מתחת המרבי של הפסגה הראשונה, שמקורם הראשון אלקאן (עם RT הנמוך, איור 6) לזיהוי על-ידי לחיצה אחת על זה.
  2. בדוק את המכה עם הדמיון הספקטרום הגבוה ביותר ('ואסתטיקה sim..', מקסימום הניקוד = 1) לעומת הערכים ספריית אלקאן (איור 6).
  3. כדי לאמת את זהותו של אלקאן הציע המתחם, השווה שלה ספקטרום המונים ספקטרום המונים נתנו בספרות, למשל, NIST כימיה WebBook²².
  4. לקבוע את אלקאן האחרון לזיהוי בתערובת calibrant רי על ידי ספירת האחרון שיא אלקאן המופיעים chromatogram.
3. לכיול RI, בחר כלים | אשף כיול רי. בחר הבא.
4. לחץ על הסמל בצורת תיקייה ובחר את הקובץ המכיל את chromatogram של תערובת calibrant רי. בחר הבא.
5. בחר את הספריה המכילה את הערכים עבור calibrants אלקאן בחלון הופיעו.
6. בחר את ערכי ספריה של לזיהוי כל alkanes בקובץ calibrant רי ולחץ >> סמל. לאחר בחירת >>, לבחור הבא.
7. בדוק את RTs המפורטים עבור כל אלקאן לזיהוי המופיעים בטבלה. למטרה זו, בדוק את RTs מתואר בחלון הראשי עבור כל אלקאן בלחיצה על המשולש בהתאמה (איור 7). אם הכרחי (איור 8), לתקן את RT לטבלה כיול באופן ידני על-ידי לחיצה כפולה על תוך השדה המתאים, בחירת התפריט הנפתח, ובחירה שהנכון הציע RT. לחילופין, הקלד RT בעזרת המקלדת ( איור 9).
8. כאשר RT עבור כל אלקאן הנכון, בחר הבא. לחץ על הבא בחלון המופיעים המציג את הטבלה כיול RI.
9. בחרו בסמל ירוק + בחלון הבחירה Chromatogram הופעה, לבחור את קובץ הנתונים של הממס-הריק ואת הקבצים של בלוטת תמציות ובחר הבא. קבע את הגדרות הפרמטר בחלון המופיעים כדלקמן: ביטול של התאמה בסיסית, שיא הסף: 5, גובה מינימלי שיא: 5, פחי/סריקה: 10, ורוחב Deconvolution: 5. מכה הבאה ולאחר מכן להתחיל לבצע חישוב רי תרכובות הכלולה בקבצים הדגימה שנבחרה.
עבור ביאור וזיהוי של מטבוליטים שבחרת תמצית MGR, פתח את קובץ הנתונים של התמצית נמדד MGR תוכן, אשר RIs חושבו כמתואר לעיל (שלב 5.3.9), על-ידי בחירה קובץ | פתוח ובחירה בקובץ הנתונים המבוקשים.
1. בחר כלים | הגדרות | Deconvolution ושנה הסף שיא, כמו גם מינימום שיא הגובה (רעש יחידות) הן ל- 5. בחר בסמל זכוכית מגדלת ואשר החלון אזהרה המופיעים שוב עם אישור.
2. לחץ על משולש המופיעים מתחת המרבי של שיא של הריבית ולהשוות ספקטרום המונית שלה עם אלה המאוחסנים בספריה NIST על-ידי בחירה בסמל NIST .
3. בחר את המכה הראשונה המתקבלת NIST-החיפוש (איור 10).
4. אם הדמיון הספקטרום המתקבל של המתחם של עניין הוא מעל הציון דמיון ספקטרום שבחרת (כאן ≥ 0.9) לעומת NIST-ערך (איור 10), לחפש את המהלכים הנכונים (עבור שלב נייח דומה GC, עובי הסרט, וטורים קוטר) על תרכובת זו בספרות (למשל, WebBook כימיה NIST²²).
5. לחשב את ההפרש היחסי בין ההפניה NIST RI (או את RIs בממוצע כאשר מקבלים ערכים מרובים רי) את המהלכים הנכונים נגזר השפעול. אם ההפרש שווה או קטן מהערך מוגדרים על-ידי המשתמש המקסימלי נסבל (כאן, ≤ ±1%), לייעד את המתחם כמו "מוערת".
6. חזור על צעדים 5.4.2–5.4.5 עבור כל התרכובות עניין הכלול בקובץ הדוגמה MGR.
7. עבור זיהוי המורכב, להשוות את רי ואת ספקטרום המונית של פתרונות סטנדרטיים (למשל, 2 – 100 mg/L) שנמדד תחת באותם התנאים כמתואר בסעיף 4 לאלו של תרכובות המבואר.
8. לנתח את התקן כמבואר בסעיף 4 ולעבד את הנתונים המתקבלים כמתואר אלקאן - ו MGR נתונים בלוטת תוכן בשלבים 4.4 ו- 5.2.
9. לכייל את הנתונים שנרכשה מן התקן על-ידי בחירה בכלים | אשף כיול RI | הבא בוחרת את אותו קובץ calibrant של רי המשמשים לפני. בחר הבא, ואז שוב הבא , בחר הקובץ המכיל את הנתונים שנרכשה מן הפתרון סטנדרטי על ידי לחיצה על הסמל הירוק + . פגע הבא ולאחר מכן להתחיל לחשב את המהלכים הנכונים עבור המתחם סטנדרטי.
  הערה: אם לא ניתן לבצע הניתוח של התקן מיד לאחר ניתוח המדגם, מומלץ לנתח RI calibrants שוב כדי לבצע חישוב וניסוי רי החדש עבור התקן.
10. פתח את הקובץ המתאים עבור התקן, לאשר את זהותו על ידי השוואה של הספקטרום שלה עם NIST-הספריה כמוסבר בשלב 5.4.2.
11. לאחר אישור של זהותו של התקן, הוסף את הספקטרום המונית ואת RI של תקן מתחם לספרייה ללא צורך במיקור חוץ. למטרה זו, לחץ על הסמל הירוק + , הזן את השם המועדף של ערך הספריה. אשר עם אישור כדי להוסיף את הספקטרום המוני, את המהלכים הנכונים של תקן מתחם לספרייה. אם לא ניתן לראות ערך חדש בספריה, הפעילו את כפתור רענון .
  הערה: אם הכיול RI בוצעה בהצלחה, המהלכים הנכונים נקבעים על-ידי MetaboliteDetector יופיע הערך-ספריית בהתאמה. לאחר יצירת ערך ספריה עבור התקן, זיהוי זה המטבוליט במ ג תמצית המבוסס על שילוב של רי, ספקטרה דמיון אפשרי.
12. פתח את קובץ הנתונים תוכן MGR שוב. בחר כלים | הגדרות | זיהוי. עכשיו, המהלכים הנכונים של המתחם רגיל הוא מחושב, הוסיף לערך הספרייה, לשנות את הציון דמיון דמיון ספקטרום ציון משולב.
13. לחץ על סמל זכוכית המגדלת ובחר את המשולש מתחת למתחם זה יש כבר מבואר בשלב 5.4.5.
14. לחץ על ההתנקשות ולבדוק לערך הניתן עבור 'הציון הכולל דמיון' (OSS, מקוצר על ידי מטבוליט גלאי כמו 'הכולל אש..'), בהתחשב בשילוב של ספקטרום דמיון ודמיון RI ניקוד (איור 11).
  הערה: אם להיט נמצא בספריה ללא צורך במיקור חוץ, הוא יוצג בצד ימין של החלון הראשי.
15. אם האסטרטגיים מעל הסף על-ידי המשתמש (כאן ≥ 0.9, המצוין גם על-ידי הצבע הירוק של המשולש), תייעד את המתחם "מזוהה" (איור 11).

6. בדיקה של תמצית התוכן MGR עבור מציג מאת DG תוכן

פתח את הקובץ מכוילת של דגימת די. ג'י עבורו RIs של תרכובות כבר חושבו עם MetaboliteDetector (שלב 5.3.9).
עבור כיסוי של chromatogram שהושג לאחר מדידה של המדגם תוכן מ"ג ו את דגימת די. ג'י, בחר כלים | כיסוי chromatogram ובחרו את שני הקבצים המתאימים באמצעות הסמל הירוק + . אשר עם אישור.
כדי להציג את הכיסוי, בחר את גליון Chromatogram כיסוי המופיעים בתחתית החלון.
בדוק אם יש חפיפה של תרכובות בין התוכן MGR לחלץ (איור 12), התוכן DG לחלץ ולהשמיט תרכובות חופפים של ניתוח תוכן נוסף MGR.

תוצאות

זרימת עבודה סכמטית המפרט את הצעדים ניסיוני בשם מטבוליט זיהוי ב בלוטת ההפרשות של explodens ג מוצג באיור13. יתר על כן, מבט סכמטי של חלקי הגוף החשוב ביותר COCY העובד נמלים המשמשים את הניסוי הציג מסופק S1 איור משלים A, B. הצעדים העיקריים של דיסקציה של הנמלים עד מטבוליט בשם זיהוי בתוכן MGR מומחשים S2 איור משלים.

כדי לבודד MGR תוכן מתאים לניתוח volatilome, מדינה מקורר נשמר לאורך כל הובלה, אחסון, וגם במהלך תהליך ניתוח. לשם כך, הנמלים היו קפואים מיד לאחר באוסף שלהם עם השימוש של העצמות חרקים (בסעיף 1, איור 1) של בחיי עיר. לאחר אחסון 2 ימים במקפיא-20 ° C, הדגימות נמלה הוסעו על קרח יבש לאוסטריה, איפה הם היו מיד לשים ב-80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף. נמלים מתאימים שייבחרו עבור בידוד של התוכן שלהם MGR מוצג אזור גסטר אשר הוא עגול ולא שלם (איור 2 א), במקרה הטוב מצויד היטב עם מונסיניור תוכן, כפי שמציין את MGR גלוי בין tergites (איור 2B). Gasters של נמלים אשר אינם מתאימים לצורך ניתוח נוסף מוצגים באיור 2C, D. שלבים עיקריים (שלבים 2.3-2.6) מעורב בתהליך בידוד של התכנים MGR מ COCY נמלים מומחשים באיור3. התכנים MGR מבודד (צהוב של explodens ג, אך צבעים יכול לנוע בין לבן עד אדום. של מינים אחרים השייכים לקבוצת COCY) מוצגים באיור14.

כאשר לנתח את הנמלים לתוכן MGR שלהם, להקפיד לא לנקב או להיקרע כל בלוטות אחרות או המעיים (שלב 2.5). איור 4 מראה על גסטר נמלה ביתור עדיין מכילה שני, ללא פגע בלוטות אחרות (DG ו- VG) לאחר בידוד של התוכן MGR. דוגמה של זיהום גלוי על ידי תוכן המעיים נמלה מוצג באיור15. מאז לא ניתן למנוע את הזיהום, עם די. ג'י תוכן, הממוקם מתחת מונסיניור, לחלוטין, חלק הפרוטוקול מתואר לנתח את בלוטות אלה לשם השוואה של האותות שנוצר עם האותות של התמצית תוכן MGR (סעיף 6). כאשר ההליך ניתוח מתבצע כראוי, זה ניתן לקבל כ- 0.75-1.2 מ ג של מונסיניור תוכן לכל נמלה. עבור פרוטוקול המתוארים כאן, מונסיניור התוכן של נמלים חמש היו איחדו לקבל דגימות חוזרות של 3.9-5.9 מ"ג כל.

תוכן המאגר מבודד בלוטת חילוץ עם EtOAc (סעיף 3), נותחו על ידי GC-MS (סעיף 4). המדד של תמצית תוכן מ"ג של explodens ג העובד נמלים תוצאות chromatogram הכוללת של פסגות, ספקטרה המוני של עשרות רבות של מונסיניור בשם תוכן תרכובות (איור 5). שני דומיננטי מטבוליטים 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (מזהה 4), 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (מזהה 5) ב- MG תוכן התמצית גרמה עמודה עומס יתר, ולכן המדגם אותו ניתחנו שוב ב גבוה יותר לפצל את יחס של 50:1 ( איור 5, כניסה). זיהום צולב אפשרי של תוכן MGR לפי המרכיבים של די. ג'י לדוגמה, יהיה גלוי כמו פסגות נוספות ב chromatogram GC-MS מפגין RTs מאוחר, החל בערך דקה 29 (איור 12). למעט פסגות כרומטוגרפי ויש המונים ספקטרום של תרכובות נמצא גם העיבוד הממס-blank שמקורם השלב נייח של העמודה GC, או בתוכן DG נוכח גסטר נמלה, הבאים עם MetaboliteDetector תוכנה הביא כ-110 MGR תרכובות תוכן עם אות לרעש יחס ≥ 10. מאוחר יותר מטבוליט ביאור והזדהות עם התוכנה MetaboliteDetector, chromatograms היו מכוילים ועל הערכים RI נקבעו עבור הקבצים מדגם נמדד (שלב 5.3 ושלבי, איור 6, איור 7 , איור 8 , איור 9). זוהה בשם MGR תוכן מטבוליטים היו מבואר המבוסס על שילוב של הדמיון בין ספקטרום NIST-הספריה, שהיוו חלק בלתי נפרד של התוכנה MetaboliteDetector בדוגמה הציג (שלב 5.4 ואת שלבי משנה, איור 10 ). יתר על כן, RI הערכים שנמצאו בספרות עבור שלב נייח זהה או דומה, עובי הסרט, בקוטר של העמודה GC נחשבו עבור מתחם ביאור (שלבים 5.4.4 ו 5.4.5). לאחר הגדרת קריטריונים תואמים קפדני ואישור RIs וגם ספקטרה המונית על ידי השימוש של תקנים, כמוסבר בסעיף פרוטוקול סטנדרטי אחד המורכב (שלבים 5.4.7-5.4.15, איור 11), ניתן היה לאשר את הזהות של בערך 10 % מטבוליטים שזוהו. מאז דו ח מפורט על volatilome של התוכן MGR של explodens ג יפורסמו במקום אחר, המחקר הנוכחי התמקד מטבוליטים אלה אשר כבר תוארו בפרסום הקודם על ידי ג'ונס. et al. ¹⁷ (מינים בזאת כמנהל KB02-108; ראה גם לבשל. et al. ²³). טבלה 1 מספק סקירה של תרכובות אלה שזוהו.

figure-results-4639
איור 1: הסכימטי של העצמות חרקים. לתוך מכסה כי החותמות של מבחנה או מיכל, שני חורים נעשים, שבו עוברים שני צינורות גמישים. הפתח של שפופרת אחת (T1) הפונה הפנים של הבקבוקון אטומה עם רשת שינוי מספיק בסדר כדי לחסום את החרקים. בנוסף, חורים עשויים לתוך הצינור כדי להקל על חילופי אוויר. הסוף של שפופרת T2 הוא הצביע מקרוב לכיוון החרקים אשר נשאבים לתוך המבחנה דגימה על-ידי כ רפה בעברית דרך T1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5330
איור 2: ללא שינוי לעומת גסטר שבור. (א) נפגע גסטר מתאים לנתיחה. גסטר שלם (B) מלא כמעט לחלוטין MGR תוכן, מתאים גם ניתוח. (ג) (ד) שבור gasters נמלה עם תוכן MGR בשניה ו מוקשה (צהוב), יכול להיות שבור במהלך שבר בעור גסטר במהלך הדגימה. נמלים אלו אינם נכללים לנתיחה, חילוץ, ניתוח נוסף. T: tergite. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5997
איור 3: רס ן השלבים הכרוכים בתהליך לנתיחה. (א) הפרדה בין אזור גסטר משאר הגוף נמלה. (B) מתקלפת שלד חיצוני: tergite 1 tergite 2 (ג), tergite 3, אחרי אשר MGRs בצבע צהוב לזווג שתוכן גלויה כמעט לחלוטין (D). (E) להסיר את התוכן MGR דביק על ידי העזרה של מחט לנתיחה. T: tergite. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6661
איור 4: נמלה גסטר לאחר ניתוקה של תוכן MGR. שתי בלוטות אחרות להציג גסטר (VG: בלוטת ארס, די. ג'י: בלוטת דופור של) ניתן לראות. לאחר ההסרה של התוכן MGR (שמאל-מהלך לאחר בידוד רואים בצהוב), התאים שניכם עדיין אמורים להישאר שלמים. בלוטות אלה ניתן לנתח באופן זהה כתוכן MGR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7235
איור 5: נציג יון סה כ chromatogram (טיק) הנוכחי של התמצית תוכן MGR. שתי הפסגות GC-MS הנפוץ ביותר, גרמו יותר סימטרי בצורת פסגות כרומטוגרפי, כאשר יחס גבוה יותר של פיצול (50:1) נבחר במקום קבוע 2:1 יחס (ראה שיבוץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7776
איור 6: קביעת אלקאן לזיהוי הראשון ב- RI calibrant chromatogram. המשולש מתחת המרבי השיא של השיא אלקאן הראשון נבחרה. אלקאן elutes ב דקה 6.31 ומציג את הגבוה ביותר ספקטרום קווי הדמיון (כאן, 'ואסתטיקה sim..') הכניסה לספריה 'Alkane_C09'. כדי לאשר את הזהות אלקאן, הספקטרום המוני מושווה ספריה (למשל, WebBook כימיה NIST²²). בדוגמה שהוצגו, nonane מזוהה על ידי יון המולקולרי שלה שערכו מ/z 128. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8501
איור 7: כיול RI עם השימוש של תערובת תקן n-אלקאן. את calibrant רי נפתח קובץ נתונים, הפונקציה 'רי-כיול-אשף' נבחר. ההתאמה הנכונה של זמן השמירה רי מתוארים בטבלה כיול צריך להיבדק. RT של מין 6.31 עבור alkane_C09 (nonane) מוצג כראוי בטבלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9043
איור 8: הלא RTs מוצגים בטבלה כיול. RTs אינם מוצגים כראוי (גם המוצג על-ידי ערך RT שגוי או חסר ערך RT המוצגת כ-1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9465
איור 9: תיקון ידני של שגוי RTs בטבלה כיול. הערכים הלא נכונים יכולים להיפתר באופן ידני על-ידי הוספה של RT הנכון עבור אלקאן בהתאמה, כמוצג כאן עבור Alkane_C39. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9931
איור 10: השוואה של ספקטרום המונית של המתחם שבחרת לערכים NIST-ספרייה- לאחר בחירת את שיא מרבי eluting-6.16 min (RI 891) והפעלה של הפונקציה 'NIST-חיפוש' (עיגול אדום), מוצג דמיון ספקטרום של 0.99 2-heptanone. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-10447
איור 11: זיהוי מטבוליט תמצית התוכן MGR. הספקטרום המוני, את המהלכים הנכונים שמקורם מתחם eluting-891 רי ב chromatogram של המדגם לעומת הערכים ספריה המכילה RIs וגם ספקטרום של תרכובות הסטנדרטי נמדד. אם 'דמיון הציון הכולל' (OSS, באופן מקוצר בגלאי מטבוליט כ 'הכולל אש.' יישום ספקטרום המונית ואת RI) בין תרכובת מהספריה שבאתר תרכובת במדגם הוא קובץ ≥ 0.9, המתחם המיועד שתוארו' '. כאן, במשרד השירותים האסטרטגיים בין הכניסה ספריה של 2-heptanone מתחם eluting-RI 891 הוא 0.96, אילו תוצאות הזיהוי של 2-heptanone בתוכן MGR לחלץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-11272
איור 12: כיסוי סעיפים chromatogram טיק (29 דקות מינימום 35) של התוכן DG לחלץ (אדום) ולחלץ התוכן MGR (כחול). שיא אזורים המתאימים חופפים תרכובות (בשם) גבוהים בדי. ג'י תוכן תמצית מאשר בתוכן MGR לחלץ; תרכובות אלו פוטנציאל מקורן די. ג'י, ולכן נחשבים מזהמים (מינור) בתוכן MGR לחלץ. במקרה של התמצית תוכן MGR ג explodens , ניתן למצוא את הפסגות כרומטוגרפי שמקורם זיהום DG בשם כ- 29 דקות, יכול להיות כלולים זה חלק chromatogram ניתוח נוסף של התוכן MGR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-12039
איור 13: זרימת העבודה סכמטית מדגימות נמלה מטבוליט ביאור/זיהוי תוכן המאגר בלוטת תמציות לאחר ניתוח GC-MS- פרוטוקול המובאת כאן מסביר ניסיוני כל השלבים החל מבידוד של התכנים MGR באמצעות ניתוח של נמלה וניתוח GC-MS כמו גם הערכת נתונים (מסומן בצבע שחור). כחלופה, הפרשה חרקים עשוי גם להיות שנוצר ומאופקים בחיי עיר (מסומן באפור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-12680
איור 14: מבודד תוכן MGR שעווה לפני חילוץ. (א) התוכן של MGRs שני להישאר ביחד, אבל (B) הם יכולים גם להיות מופרדים לאחר בידוד. ב explodens ג, הצבע של התוכן MGR הוא כתום-צהבהב, אך נע בין לבן אדום במינים אחרים של קבוצת COCY. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-13255
איור 15: איור של הפרשת MGR מבודד צלב-שזוהמו על ידי המרכיבים של המעיים החרק (חום). סוגים אלה של מונסיניור מבודד אינם נכללים החילוץ, ניתוח נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מזהה	מטבוליט	Trivial שם	מחרוזת אינץ	נוסחת סכום
1	Heptan-2-אחד		InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3	ג₇H₁₄O
2	n-Undecane		InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3	ג₁₁H₂₄
3	n-Heptadecane		InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3	₁₇H ג₃₆
4	-(2,4,6-Trihydroxyphenyl) 1-ethanone	Monoacetylphloroglucinol	אינץ = 1/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3 - 7 (8) 12/h2-3,10-12 שעות, 1H 3	C-₈H-₈O-₄
5	5,7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-one	Noreugenin	אינץ = 1/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, ה' 13, 1H 3	C-₁₀H-₈O-₄

טבלה 1: מטבוליטים שתוארה EtOAc תמצית של התכנים MGR מבודד מן הנמלים עובד קטין explodens ג . מטבוליטים שנבחרו מוצגים.

איור משלים S1. סקירה של חלקי גוף החשוב ביותר השייכת COCY נמלים (עובדים מינור) הציג בכתב היד. MGRs ה (א) מוצגים בצהוב. חלק gastral שלהם משמשת לניתוח volatilome. (B) חלק gastral MGRs ממוקם מתחת tergites 1 עד 3. T: tergite. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

איור משלים S2. סקירה סכמטי של הניסוי הציג. הצעדים העיקריים של דיסקציה של הנמלה עד זיהוי בשם של מטבוליטים נוכח התוכן MGR מומחשים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

כתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מלא לניתוח את volatilome של התוכן שנמצא את MGRs מביצה של explodens ג עובד קטין נמלים. מאז הנמלים המשמש כאן עשוי "להתפוצץ" והוצא את התוכן MGR שלהם בצורה לא מבוקרת כאשר נגע עם מלקחיים, מומלץ להשתמש בטכניקה אוסף "רכים" כפי שנמסרו על ידי העצמות חרקים (איור 1). עבור מינים מסוימים נמלה כולל נמלים COCY, ייתכן צורך להגביל את המספר המרבי של נמלים ליחידים חמישה לכל מבחנה 50 מ ל, שכן אחרת הרעלה עצמית של הנמלים (למשל, על ידי הצטברות של חומצה פורמית קראוון) עלולה להתרחש. עבור הקפאת הנמלים בשטח, שקית קריר ממולא בהקפאה עמוקה חבילות קר עשוי לשמש. צריך להיות קפוא והם מאוחסנים בתנאים מקורר (כגון: -20 ° C, הטוב ביותר ב-80 מעלות צלזיוס) במהירות הדגימות, אך לא מומלץ כדי להרוג, לאחסן את הנמלים חנקן נוזלי, שכן נזק מוגברת של בלוטות שלהם נצפתה בשיטה זו.

המתודולוגיה לנתיחה הציג מאגר - ו הממס נטול מתאים קבלת תוכן המאגר בלוטת mandibular דמוי שעווה, כמו גם בלוטות אחרות נוכח העובד קפוא נמלים. ניתוח volatilome של התוכן MGR של explodens ג, היבטים עיקריים כדי להיחשב במהלך ניתוח הם קירור רציפה של הנמלים (שלב 2.1.4) ומזעור קרוס-מציג של הדגימות MG בנוזלים אחרים בלוטת תוכן/נוכח גסטר נמלה (שלב 2.5, איור 4 ואיור 15). חלק ניכר של הנמלים קפואים עלולים להינזק, או בגלל הנמלים "התפוצצה" במהלך דגימה או נפגעו במהלך ההובלה על קרח יבש מאתר דגימה למעבדה. אם האזור גסטר שבור, הנמלים הללו אינם מתאימים לצורך ניתוח נוסף (איור 2C, יח). אם רק מחושים ברגליים הם חסרים או מנותקים, ניתן להשתמש הנמלים הללו עדיין לחילוץ של מונסיניור תוכן, ניתוח נוסף. מאז תכולת MGR מקורר explodens ג נמלים יש עקביות דמוי שעווה. זה ישר קדימה כדי לבודד אותם עם השימוש של מחטים לנתיחה (שלב 2.5 3E איור, איור 14). טיפול נוסף צריך להילקח תוך כדי טיפול MGR דביק את התוכן. הוא עלול לדבוק בכלום בא במגע פיזי עם זה, גם לעתים קרובות דוגלים המלקחיים לנתיחה, אשר מגביר את הסיכון של זיהום של דוגמאות אחרות. זה הכרחי רק לגעת בהם את התוכן MGR עם מחט לנתיחה ולהעביר אותו מיד לתוך הבקבוקונים זכוכית המשמש להפקת (שלבים 2.5 ו- 2.6). יתר על כן, מומלץ לנקות את הציוד לנתיחה בתערובת₂O MeOH/H בעת מעבר בין נמלים או בלוטת-סוגים (שלב 2.8).

בלוטת התוכן של מינים אחרים נמלה עשוי להיות נוכח במצב נוזלי אפילו בזמן קירור עם חבילות קר. במקרה זה, בלוטת כולו כולל הקרום יכולים בהתחלה להיות מבודדת, ניקב לאחר מכן לקבל את התוכן. הפרשות נוזלים ניתן לקבל גם עם העזרה של פיפטות נימי משובחים. עם אורך גוף ממוצע כ 4-5 מ מ (ללא אנטנה), עובדים של explodens ג שייך מינים קטן יותר של קבוצת COCY. גסטר שלהם לעתים קרובות נפוח מונה כ 2-2.5 מ מ באורך ו 1-1.5 מ מ רוחב. העובדים של המין ידוע אז-המרחק הגדול של קבוצת COCY יכולים להגיע בגודל של בערך 8 מ מ אורך הגוף עם גסטר בגודל של 3 מ מ אורך ו- 2.5 מ מ רוחב. מאז הפרוטוקול מתאים גם לנתח ולחקור gasters בגודל זה שונה ונמלים בודדים COCY מינים, הכאן משמש כלי ניתוח, מיקרוסקופ, ייתכן שיהיה עליך להתאים אותן להיות ישימים עבור נמלים קטנים יותר או קטן יותר לאיברים. יתר על כן, מספר נמלים לדגימה אנליטית, ייתכן שיהיה עליך להיות מוגברת גם כן.

תוך כדי לנתח את הנמלה עבור התוכן MGR, זה קריטי שלא יגרמו נזק כלשהו בלוטות אחרות או המעיים - התכנים אשר עשויים קרוס-לזהם את המדגם (שלב 2.5, איור 4 ואיור 15). במקרה האופטימלי, אחרי החילוץ של התכנים MGR, די. ג'י, כמו גם VG בעליל נשמרים שלם (איור 4). מציג עם התכנים של DG, הממוקמת מתחת MGRs, קשים להימנע לחלוטין. סיבות לכך עשוי לכלול גם תקינות בלוטת שיבוש חלקית במהלך ההובלה על קרח יבש מהאתר הדגימה למעבדה. זה גם אפשרי DGs להינזק במהלך דגימה או בתהליך מתפוצץ, כמו שמנו לב עבור MGR במספר נמלים ובדוקים. מאחר שתוכן DG ניתן לנתח באותו האופן כמו MGR תוכן (סעיפים 3 ו- 4), התוצאות ניתן להשוות את הנתונים המתקבלים לאחר ניתוח של הדגימות תוכן MGR (סעיף 6). במקרה של מונסיניור תמציות תוכן המתקבל explodens ג נמלים, תרכובות הכלול גם די. ג'י להתחיל elute בסוף chromatogram (איור 12). כדי למנוע ספק DG תרכובות עבור MGR המרכיבים, יכולים להיות כלולים מטבוליטים בהתאמה ניתוח נוסף. ממחקרים על מינים אחרים נמלה זה ידוע כי DGs יכול גם מכילים תרכובות נדיפות (מאוד)¹^,²⁴, אשר בדרך כלל elute בתחילת GC-chromatogram.

במחקרים קודמים, התמודדות עם ההרכב הכימי של תוכן MGR COCY נמלים, נמלים שלם או gasters כל שלהם היו שנותחה¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,²³, ואילו כאן MGR התוכן עצמם התקבלו באמצעות ניתוח של הנמלים.

ניתוח תוכן MGR ביתור מאפשר החוקרים לבצע מגוון רחב של מחקרים ביוכימיים, כולל זיהוי של מטבוליטים הכלולים בו. מאז המחקר שבוצעו כאן התמקד זיהוי המרכיבים נדיף הכלול את MGR של explodens ג, GC-MS נבחר לניתוח שלה (סעיף 4). בשביל זה, תמציות צריך אידיאלי נמדד מיד לאחר ההכנה או המאוחסנים ב- 80 ° C עד הניתוח. יצוין, כי אחסון (מורחבים) עלולה לגרום שינויים כימיים של תמציות (ראה הערות לאחר שלבים 3.3 ו- 4.2). מאז הריכוז של התכנים MGR עשוי לכסות טווח במספר סדרי גודל, ייתכן צורך לנתח תמציות MGR ב GC שונים לחלק יחסי. מאז המתחמים העיקריים שני בתוכן MGR תמצית של הנמלים נלקחה לצורך המחשה פרוטוקול גרם עמודה העמסת בעת פיצול יחס של 2:1 שימש דוגמה זו נותחו בפעם השנייה ביחס פיצול גבוה יותר של 50:1 (שלב 4.3.1.2and איור 5). קביעות הפרמטר GC-MS שהוצגו בסעיף 4 מתאימים נתונים שנוצרו עם התקני GC-MS המצוין בטבלה של חומרים. ליד calibrants רי (שלב 4.1.1), הממס-ריק (שלב 4.1.2) צריך גם להיות מנותח לזהות חפצים הלא-ביולוגיים, מזהמים במהלך ניתוח הנתונים הבאים. עבור זיהוי מטבוליט, חשוב גם למדוד את הסטנדרטים אותנטי של תרכובות המבואר מתחת לאותם תנאים GC-MS המשמשים לניתוח תמציות מדגם (צעדים 5.4.7and להלן). כדי לשפר את הדיוק והאמינות של הנתונים הסופי, מומלץ לנתח כל מדגם קטגוריות (הממס-ריק, RI calibrants, דוגמת תמציות, ותקני) בתוך אותו רצף מדידה. יתר על כן, צריך להיות מנותח הסטנדרטים אותנטי-ריכוז דומה לזה שנצפה על תמציות הדגימה. פעולה זו מסייעת לשפר את הדיוק של דמיון בין מדגם רגיל ספקטרה המונית, אשר יוביל לבסוף מטבוליט מוגבר ומשמעותי יותר ביאור/זיהוי וערכים RI. לשם כך, הסטנדרטים שוב ושוב נמדד באמצעות גורמים שונים פיצול.

עבור זיהוי מטבוליט, התוכנה מתוחכמים, MetaboliteDetector משמש להשוואה ספקטרה deconvolution ואת RI ספקטרה לספריית מיושמים NIST-גם לגבי הוקמה ספריה (סעיף 5). מומלץ להפעיל את MetaboliteDetector על 64 ביט מבוססת לינוקס מערכת הפעלה (למשל, קובונטו) וכדי להעתיק את שנוצר *. CDF קובצי נתונים (שלב 4.4) מהתקן אחסון נתונים יבילים לכונן הקשיח המקומי. MetaboliteDetector הוא מסוגל ייבוא נתונים גולמיים GC-MS בתבנית netCDF centroid או פרופיל. התוכנה של רוב המכשירים GC-MS אמור להיות מסוגל להמיר את הנתונים הגולמיים מוקלט תבנית זו¹⁹. לפני שמתחילים ניתוח הנתונים, מומלץ לקרוא את הספרות זמין עבור גירסאות קודמות של התוכנה MetaboliteDetector להכיר את התכונות ואת המשתמש הגרפי ממשק¹⁹^,²⁵^, ²⁶.

כיול RI, חישוב ערך RI עוקבות של הפסגות מתחם נוכח תמציות לדוגמה, משמש ספריה המכילה RIs וגם ספקטרום של רי calibrants (כאן, n-alkanes). ספריה כזה יכול להיות עצמי הוותיקה, או שישנו ('CalibrationLibrary_Alkanes') יכול להיות שהורדת²⁷. ספריית ברירת המחדל שסופקו calibrant מכיל RIs spectra עבור n-alkanes ועד C09 C39 אשר נותחו כמתואר בסעיף 4. הספרייה שסופקו מאפשרת למשתמשים לעבוד עם גלאי מטבוליט להתחיל ישירות עם תהליך כיול של הנתונים שלהם. במידת הצורך, ניתן להאריך בספריה זו גם עם ערכים נוספים עבור עוד יותר alkanes. על סמך הדמיון של הפניה ואת RIs השפעול נגזר המוני ספקטרה (ראה צעד 5.3 ושלבי, איור 7, איור 8, איור 9), ביאור או זיהוי של תרכובות יכול להיות ביצעה (שלב 5.4 ושלבי, איור 11). חשוב גם כי לאחר עיבוד נתונים אוטומטי עם MetaboliteDetector, המשתמש לבדוק באופן ידני אם deconvolution האיסוף, ספקטרום שיא הנכון באמצעות בדיקת מסת ספקטרה הבסיסית של 'משולש' עבור כל תרכובת בשם עניין. יתר על כן, בהתאם את המכשור GC-MS קביעות הפרמטר המשמש עבור נתונים הדור, adaptions של ההגדרות MetaboliteDetector הציג ייתכן שיהיה צורך. התוכנה MetaboliteDetector הוא מסוגל לבצע פעולות רבות יותר יעיל מאשר להסביר את כתב היד, למשל, התצוגה של יון שחולצו הנוכחי (EIC) chromatograms, הייצוא של chromatograms. csv, אצווה אוטומטיות-כימות תרכובות, ועוד רבים.

פרוטוקול שהוצגו בכתב יד זה יכול לשמש הצעה עבור ניסויים המבוצעת על ידי חוקרים אחרים התמקדות בידוד של בלוטות או בלוטת התוכן של חרקים, ניתוח volatilome, כמו גם מטבוליט זיהוי.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

מימון למחקר זה הושג דרך וינה מדע טכנולוגיה קרן (WWTF) LS13-048 אל קצר הסיפור. תודה מיוחדת ללכת דוידסון וו דיאן (אוניברסיטת יוטה; עכשיו בדימוס) עבור שיתוף הידע שלה אודות הנמלים COCY אפור פרווה איתנו. אנחנו מעריכים הממשלים של קואלה Belalong שדה לימודי מרכז (KBFSC), Universiti ברוניי דארוסלאם (UBD) לאישור הפרוייקט, כמו גם של ברוניי היערנות, של ברוניי ומחקר מרכז חדשנות הרשאה לאסוף נמלים, אישור, הנפקת היתרי יצוא. תודה מיוחדת לך לצוות UBD, KBFSC, במיוחד בת החודש מוחמד בן עבדאללה Li קטן Chua טדי, Masnah Mirasan, Rafhiah עליזה ליבנה, Roshanizah Rosli, מיכאל Rodzay, מיי צ'ין צ'אן, Tennakoon קושאן על הקלת המחקר שלנו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP	Sarstedt	62,559,001	see Figure 1 in manuscript
PVC Tubings	Rehau	290 4489	see Figure 1 in manuscript
Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size	Antstore	1000378	see Figure 1 in manuscript
Freezer	Severin	KS 9890	-20 °C or lower
polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm	Thorsten Koch	4260308590481
Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm	Aldrich	BR455742
Cold pack 150 mm x 100 mm	Elite Bags	1998	freeze to -20 °C
Bucket with crushed ice
1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening	La-Pha-Pack	11090500
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm	La-Pha-Pack	9151799
Stereomicroscope	Bresser	5806100
Forceps, Superfine Tip curved	Medizinische Instrumente May, Norman May	PI-0005B
Forceps, Superfine Tip straight	blueINOX	BL-3408
Dissection needle 140 mm, pointed, straight	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1110301
Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën	fisher scientific	15654740
Distilled water
Rotizell-Tissue-Tücher	Carl Roth GmbH + Co.KG	0087.2
Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 %	Carl Roth GmbH + Co.KG	4442.1	freeze to -20 °C
Vortex Genie 2	neoLab	7-0092
0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip	La-Pha-Pack	06090357
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm	La-Pha-Pack	9151819
Alkane standard solution C₈-C₂₀	Sigma-Aldrich	04070
Alkane standard solution C₂₁-C₄₀	Sigma-Aldrich	04071
n-Hexane SupraSolv	Merck	104371
GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister	Gerstel
Agilent Gas chromatograph 6890 N	Agilent
Gooseneck splitless Liner	Restek	22406
Helium (5.0 - F50)	Messer	102532501
GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm	Agilent	19091S-433UI
Agilent Mass Selective Detector 5975B	Agilent
MSD ChemStation Data Analysis Application software	Agilent
MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)	Hiller K		download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
Calibration Library for MetaboliteDetector	Hiller K		download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
MD Conversion Tool for NIST-library	Hiller K		download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10

References

Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183(2016).
Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151(2009).
Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16(2008).
Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 Colobopsis cylindrica Colobopsis explodens volatilome MetaboliteDetector

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: