גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons

Summary

עבודה זו מספקת שיטה הזיוף של פלטפורמות מבוססות-droplet microfluidic לבין היישום של microspheres לזיהוי עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. שיטת ננו-ספירה-PCR מאפשר לקבל חד גדילי DNA amplicons מבלי המפריד בין שני גדילי ה-DNA.

Abstract

מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet מאפשרים ייצור אמין microspheres הומוגנית בערוץ microfluidic, מתן הגודל מבוקרת של המורפולוגיה של ננו-ספירה שהושג. ננו-ספירה copolymerized עם בדיקה acrydite-DNA היה מפוברק בהצלחה. ניתן להשתמש בשיטות שונות כגון PCR אסימטרי, עיכול אקסונוקלאז, בידוד על מצופים streptavidin beads מגנטי לסנתז DNA חד-גדילי (ssDNA). עם זאת, שיטות אלה לא ניתן להשתמש ביעילות כמויות גדולות של ssDNA נקיים במיוחד. כאן, אנו מתארים ננו-ספירה-PCR פרוטוקול המפרט איך ssDNA יכול להיות ביעילות מוגבר, הופרדו dsDNA פשוט על-ידי pipetting של צינורית תגובת ה-PCR. ההגברה של ssDNA יכול להיות מיושם כמו ריאגנטים פוטנציאליים עבור DNA microarray ותהליכים (שיטתית האבולוציה של ליגנדים על ידי העשרת מעריכית) דנ א-SELEX.

Introduction

דנ א חד גדילי (ssDNA) בהרחבה נחשב כרכיב הכרה מולקולרית (MRE) בשל תכונותיו מהותי עבור ה-DNA-DNA הכלאה^1,2. פיתוח מערכות סינתטי ssDNA יכול להוביל יישומים ביולוגיים כגון ה-DNA מיקרו-מערכים³, oligotherapeutics, אבחון משולב חישה מולקולרי המבוסס על אינטראקציות משלימים^4,5.

עד כה, חלקיקי הפולימר בקנה מידה מיקרומטר בהצלחה הוכחו באמצעות מכשירי microfluidic. מספר טכניקות microfluidic הוכחו להיות חזק להפקת microspheres מאוד הומוגנית על זרימה רציפה ב^6,הסביבה microchannel⁷.

במחקר של Lee. et al. ⁸, פלטפורמה מבוססת-droplet microfluidic לסינתזה microfluidic של הגברה oligo-ננו-ספירה, ssDNA copolymerizable, דווח. פלטפורמת microfluidic מורכב שתי שכבות PDMS (polydimethylsiloxane): חלק עליון עם רשת ערוץ microfluidic ליצירת ננו-ספירה ו תחתון חלק שטוח. הבאנדש שלושה סוגים של ערוצי fluidic PDMS: 1) זרם התמקדות ערוץ לדור droplet 2) ערוץ סרפנטין לערבוב שני פתרונות, 3) ערוץ הפילמור רציפים התמצקות ננו-ספירה. לאחר שני זורם immiscible הם הציגו לתוך ערוץ fluidic PDMS אחד, שאפשר להכריח את הזורם דרך מבנה צר דיזה. ההתנהגויות זרימה כגון ערוץ גאומטריה, קצב הזרימה צמיגות להשפיע על הגודל ועל מורפולוגיה של ננו-ספירה. לכן, ניתן לחלק לזרם המרכזי נוזלי microscale monospheres^9,10.

. הנה, ננו-ספירה מפורט-PCR פרוטוקול מסופק עבור ההגברה של ssDNA. ראשית, מתואר תהליך עיצוב של התקן מבוסס-droplet microfluidic. לאחר מכן, הדרך באילו לזיהוי microspheres יכול להיות functionalized עם תבנית ה-DNA אקראית באופן משלים הוא הסביר. לבסוף, מוצג עבור הגברה ssDNA פרוטוקול ננו-ספירה-PCR.

Protocol

1. ייצור של פלטפורמה Microfluidic PDMS

1. הכן 20 מ של נוזל PDMS prepolymer על ידי ערבוב בסיס פולימר ו זרז על יחס נפח של 10:1. יוצקים 10 מ"ל של הנוזל PDMS על גבי תבנית מוכנה SU-8 על רקיק סיליקון עבור החלק העליון של הרשת microfluidic. עבור החלק התחתון שטוח, יוצקים באותו אמצעי אחסון של PDMS נוזלי-פרוסות הסיליקון ללא מבנה עובש.
   הערה: הרשת microfluidic הוא תוכנן בתוכנית CAD והוסב ואז photomask על מנת לפברק מאסטר באמצעות תהליך פוטוליתוגרפיה טיפוסי (ראה דמויות משלימה). המאסטר הזה מורכב כייר SU-8 photoresist שלילי פרוסות סיליקון¹¹.
2. מניחים שתי פרוסות סיליקון מצופים prepolymer PDMS הנוזלי על פלטה ועל התרופה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   1. באופן ידני לקלף את השכבה PDMS ריפא מ כייר SU-8. ישר בקוטר 1.5 מ מ סביב החור כלי חבטות אל יציאת שמן על הרשת microfluidic משוכפל עבור התממשקות בקנה מידה מיקרון ערוצי זרימה עם דגימות הנוזל מאקרו. אגרוף החוצה דרך-החור באופן ידני.
   2. חזור על פעולה זו ניקוב תהליך שלוש פעמים על היווצרות שני פתרונות והנמל עודפים.
3. מבצע הטיפול הידרופילית המשטח העליון והן PDMS הפקדות באמצעות treater corona ידניים¹² עבור מספר שניות עבור כל דגימה.
   1. מחסנית שני שטופלו פלזמה PDMS השכבות ומחממים ב 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות צלחת חמה עבור תהליך האיחוי PDMS-אל-PDMS. אספקת מים בלחץ באמצעות המשאבה מזרק לתוך שלוש יציאות כניסת מליטה מבניים ולבדיקה דליפה של המכשיר מפוברק.

2. הפקת לזיהוי Oligo-Microspheres

1. להכין חרוז-תערובת מפורט בטבלה1.
2. מערבולת, בקצרה צנטריפוגה acrydite ssDNA תקן תוויות החללית (Ap, 100 μM) ואת acrylamide:bis (19:1) מניות פתרון.
3. להכין פתרון אני על ידי ערבוב 25 μL של 40% אקרילאמיד המחייבת פתרון, 10 μL של ssDNA (acrydite העצמית), μL 10 5 מאגר x TBE (1.1 מ' טריס; מ מ 900 בוראט; 25 מ מ EDTA) ו- 5 μL של מים. להכין את הפתרון השני עם 50 μL של 20% קירור.
4. להכין שני מזרקים בנפרד מלא פתרון אני והפתרון II, והר אותם לתוך למשאבה להציג פתרון זורם לתוך פלטפורמת microfluidic. להכין שמן מינרלי מעורבב עם 0.4% TEMED על משטח ייבוש של ננו-ספירה.
   הערה: TEMED הינו ידוע כמייצב רדיקלים חופשיים. רדיקלים חופשיים יכולים להאיץ את קצב היווצרות פולימר עם קירור (APS) על מנת לעודד אקרילאמיד הפילמור.
5. למלא בקבוק זכוכית עם 4 מ של שמן מינרלי כדי ליצור זרימה רצופה.
6. להוסיף שני צינורות כדי שתי יציאות הפקק של הבקבוק זכוכית כמו מאגר microfluidic: הנמל פנאומטיים להחלת ואוויר דחוס לתוך בקבוק הזכוכית את מדחס אוויר והנמל נוזלים לאספקת הנפט מווסת לרשת מיקרו ערוץ מהבקבוק זכוכית. לחבר את הצינורות בין בקבוק הזכוכית את נמל הנפט במכשיר microfluidic.
   1. להתחבר הצינורות פתרון שתי היציאות בהתקן microfluidic כדי לספק את הפתרונות שני ממשאבות מזרק. להכניס צינורות ליציאת ה-outlet כדי להעביר את ננו-ספירה שנוצר לתוך הספל.
7. הגדר את קצב הזרימה של משאבת מזרק 0.4 - 0.7 מ ל/ה, התאם אוויר דחוס בלחץ של מדחס באמצעות הרגולטור (82-116 kPa). הגדר את מהירות הסיבוב (500 סל ד) של שורת פגים במיכל זכוכית על פלטה חמה. לנתח את משאבת מזרק והענק ואוויר דחוס שנוצר על ידי מדחס חיצוני לתוך בקבוק הזכוכית באמצעות הפקד ON/OFF של שסתומים אלקטרומגנטית¹³.
8. להתבונן היווצרות של microspheres ב גאומטריה זרימה-התמקדות ומיצוק של microspheres שנוצר במיכל זכוכית עם מיקרוסקופ דיגיטלי.
   הערה: גודל וייצור ממהירות ננו-ספירה תלויים flowrate של פתרונות, למידת הלחץ המופעל על זרימת שמן מינרלי (טבלה 2).

3. ביצוע לזיהוי Oligo-Microspheres נחשב

1. על כימות hemocytometer, לקחת כמות קטנה (כ-100 μL) של תמיסה מימית לזיהוי oligo-microspheres ומקום על hemocytometer זכוכית, ומלא בעדינות ההשעיה ננו-ספירה את הבאר לשכת ספירה.
   הערה: לקבלת פרטים נוספים, עיין http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. השתמש מונה טלי מיקרוסקופ ויד לספור microspheres במערכת אחת 16 ריבועים. לאחר מכן, להעביר hemocytometer את הסט הבא של התא, תמשיכו לספור עד כל ארבע קבוצות של 16 פינות נספרים.
3. לקבוע את ספירת הממוצע ננו-ספירה, לחשב את מספר microspheres חרוז ההשעיה המקורית.
4. העברת μL 100 של microspheres צינור microcentrifuge 1.5 mL. הסר את תגובת שיקוע דרך עדין צריך שתוציאו (400 x גרם) ו pipetting.

4. ביצוע את ה-DNA הכלאה על פני השטח של Oligomicrosphere לזיהוי

הערה: זהות DNA בדיקה עם 5'-NH₂-הקבוצה, במקום 5'-acrytide שינוי נוסף לתוך פתרון אני ונבדק המכילות Ap microspheres במקביל. תוצאות הדנ א הכלאה מוצגים באיור2. הפתרון רגשים (cAp) התווית על-ידי Cy3 oligonucleotide משלימים יוצב בחדר חשוך.

1. Resuspend Cy3-קאפ באמצעות μL 100 1xTE מאגר (TE מאגר: 10 מ מ EDTA טריס, 1μM, pH 8.0) על מנת להשיג ריכוז סופי של 100 μM. לדוגמה, resuspend pmol 1 של קאפ ב- 100 מ של מאגר TE ואת העברת צינור microcentrifuge מכוסה ברדיד אלומיניום.
   הערה: רצפים סטרנד, עיין בטבלה 3.
2. להוסיף 100 μM של Cy3-קאפ צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי המכיל microspheres Ap-copolymerized.
3. הקש על הצינור כמה פעמים כדי לערבב דגירה בטמפרטורת החדר בחושך 1 h.
4. למחוק את תגובת שיקוע ולהסיר מאגר שיורית דרך pipetting.
5. לשטוף שלוש פעמים עם μL 500 טה המאגר.
6. Resuspend microspheres על-ידי הקשה בעדינות את הצינור microcentrifuge. . אז, חזור על שלב 4.4.
7. במקום microspheres על שקופיות זכוכית (75 מ"מ x 50 מ"מ) ומכסים ברדיד אלומיניום לפני הדמיה.

5. אסימטרית PCR עבור הגברה ssDNA

1. להכין תערובת ריאגנט PCR אסימטרי הגברה ssDNA כדי להיות מנותח. להפשיר את ריאגנטים בטבלה 4 על קרח. אל תשמור את האנזים פולימראז Taq (U 50/µL) על קרח, אבל מעדיף לאחסן אותו ב-20 ° C עד שהוא נדרש.
2. מערבולת בעדינות כל ריאגנטים, אז בקצרה צנטריפוגה צינורות ב 10,000 g x 10 s.
3. שילוב כל ריאגנטים כפי שמתואר בטבלה 4.
4. למקם את דגימות thermocycler ולהתחיל את ה-PCR אסימטרי בתנאים הבאים: 25 מחזורי (95 ° C ל 30 s, 52 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s), 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק ב 4 º C.

6. ננו-ספירה-PCR עבור הגברה ssDNA

הערה: סעיף זה מתאר הפרוטוקול עבור הגברה ssDNA בשפופרת תגובת ה-PCR. ננו-ספירה-PCR תגובות בוצעו ב- 50 μL של התגובה האחסון. רצפי מפורט נהגה להגביר ssDNA מפורטים בטבלה 5. במקרה זה, Ap על פני השטח של microspheres יכולים anneal לתבניות DNA אקראית באופן משלים. זהו צעד חשוב מאוד לייצור גדילי DNA משלימים (צירוף ד. נ antisense, איור 3). ה-DNA מורחב משמש כתבנית עבור הגברה ננו-ספירה-PCR.

1. להכין תערובת ריאגנט ננו-ספירה-PCR. להפשיר את ריאגנטים טבלה 6 על הקרח; עם זאת, אל תשמור את האנזים פולימראז Taq על הקרח. אחסן אותו ב-20 ° C עד שהוא נדרש.
2. מערבולת בעדינות כל ריאגנטים, אז בקצרה צנטריפוגה צינורות ב 10,000 g x 10 s.
3. להשיג כ ~ 25 microspheres דרך ספירת מיקרוסקופיים.
   הערה: מספר microspheres בצינור אחד תגובה מחושבים באמצעות מיקרוסקופ אור עם 40 X הגדלה. על 25 ~ microspheres משמשים עבור הגברה ננו-ספירה-PCR. מידע מפורט יותר הוא בשלב 3.
4. שילוב כל ריאגנטים כפי שמתואר טבלה 6-
5. למקם את דגימות thermocycler ולהתחיל את ה-PCR אסימטרי בתנאים הבאים: 25 מחזורי (95 ° C ל 30 s, 52 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s), 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק ב 4 º C.
6. הגברה הבאים, להוסיף 8 μL של 6 x טעינת מאגר וטען μL 15 של כל מדגם לתוך 2% agarose ג'ל. לאחר מכן, לבצע אלקטרופורזה ב- 100 וולט למשך 35 דקות ב- 1 x TAE (טריס-אצטט-EDTA, 40 מ מ טריס אצטט, 1 מ מ EDTA, pH 8.2) מאגר.

7. מיקרוסקופיה קונפוקלית רכישה

הערה: התוצאות של ננו-ספירה-DNA בדיקה הכלאה הם עם תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. ניתוח תמונות מתבצעת באמצעות ImageJ.

1. לתקן את microspheres hybridized לשלב של המיקרוסקופ בעל.
2. בחר את הלייזר (לייזר הליום/ניאון, 543 קו ננומטר) ולהדליק בשליטה לייזר.
3. בחר את העדשה המטרה בשליטה מיקרוסקופ.
4. בחר את המסנן הרצוי עבור Cy3 וערוץ בבקרת תצורה.
5. להתחיל את הניסוי ולבחון את הדגימה. הגדרות עבור מיקרוסקופ קונפוקלי מסוכמות בטבלה 7.

תוצאות

פלטפורמת ה-microfluidic מבוסס-droplet פולימריים מפוברק מורכב PDMS שתי שכבות (איור 1 א'). שלושה סוגים של רשתות ערוץ microfluidic משמשים ליצירת microspheres: 1) זרימה-התמקדות הגיאומטריה כפי שמוצג איור 1b, 2) ערוץ סרפנטין לערבוב פתרון אני והפתרון II ו- 3) ערוץ הפילמור ננו-ס...

Discussion

מזהמים של dsDNA הם נושא מרכזי ב- ssDNA הגברה. זה נשאר קשה למזער את dsDNA הגברה קונבנציונאלי אסימטרי PCR הגברה¹⁵. בנוסף, למרות שיפורים טכניים ליצירת ssDNA אפשרו לנו להגדיל את היעילות של תפוקה של הדוגמה, בידוד ssDNA הוא עדיין בעייתי בשל העלויות הגבוהות שלה טיהור לא שלם לקידומם.

PCR ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres