שומן-מים פאנטום עבור אימות תהודה מגנטית: פרוטוקול מדרגיים וגמישים

Summary

מטרת עבודה זו היא לתאר את פרוטוקול ליצירת פאנטום שומן-מים מעשי יכול להיות מותאם אישית כדי לייצר מטוסי פאנטום עם אחוזי שומן שונים ואמצעי אחסון.

Abstract

כמו רקמת שומן התמונה פותחו טכניקות חדשות, שיטות לאימות כזה פרוטוקולים הופכים יותר ויותר חשובים. מטוסי פאנטום, ניסיוני עותקים משוכפלים של רקמה או איבר של עניין, לספק פתרון בעלות נמוכה, גמיש. עם זאת, ללא גישה לציוד יקר ולא מיוחדים, בניית פאנטום יציב עם שברים שומן גבוה (למשל., > 50% שומן שבר רמות כגון אלה ראה רקמת שומן חום) יכול להיות קשה בשל אופיו הידרופוביות של ליפידים. עבודה זו מציגה פרוטוקול מפורט, בעלות נמוכה ליצירת פאנטום 5 x 100 מ עם שברים השמן של 0%, 25%, 50%, 75% ו 100% באמצעות ציוד מעבדה בסיסית (פלטה, ספלים, וכו '.) ורכיבים נגיש בקלות (מים מזוקקים, אגר, מסיסים במים חומרים פעילי שטח, סודיום בנזואט, הסוכן ניגוד גדוליניום-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), שמן בוטנים, חומרים פעילי שטח מסיסים). הפרוטוקול תוכנן להיות גמיש; זה יכול לשמש כדי ליצור פאנטום עם שברים שמנים שונים ומגוון רחב של אמצעי אחסון. מטוסי פאנטום שנוצרו באמצעות טכניקה זו הוערכו במחקר היתכנות כי בהשוואה ערכי שבר שמן שמן מים תהודה מגנטית לערכי המטרה ברוחות נבנה. מחקר זה הניב של מקדם המתאם קונקורדנציה של 0.998 (95% מרווח הביטחון: 0.972-1.00). לסיכום, מחקרים אלה מדגימים את התועלת של שמן פאנטום עבור אימות רקמת שומן הדמיה טכניקות על פני מגוון של הרלוונטית קלינית רקמות ואיברים.

Introduction

עניין לכימות רקמת שומן ותוכן הטריגליצרידים באמצעות שיטות הדמיה, כגון דימות תהודה מגנטית (MRI), משתרע על פני שדות רבים. תחומי המחקר כוללים החקירה של רקמת שומן לבן וחום מחסני חוץ רחמי לאגירת השומנים ב איברים ורקמות כגון הכבד¹, הלבלב²וכן שרירי השלד³. כמו אלה טכניקות הרומן על כימות אדיפוז מפותחות, שיטות נדרשים לאשר כי הפרמטרים הדמיה תקפים עבור מחקר ויישומים קליניים.

מטוסי פאנטום, ניסיוני עותקים משוכפלים של רקמה או איבר, מספקים בעלות נמוכה, גמישות מבוקרת כלי כדי לפתח ולאמת טכניקות הדמיה⁴. באופן ספציפי, ניתן לבנות מטוסי פאנטום כדי להכיל שומן ומים בשבריר נפח יחס או שומן (FF) לזו של הרקמה עניין קליניים. קלינית, הערכים FF רקמות ואיברים יכולה להשתנות: FF ברקמת שומן חום נופל בין 29.7% ל- 93.9%⁵; הכבד הממוצע FF בחולים steatosis היא 9.0% 18.1 ±⁶; FF הלבלב אצל מבוגרים בסיכון לטווחים סוכרת סוג 2 בין 1.6% 22.2%⁷; ויש במקרים מסוימים של התקדמות המחלה, חולים עם ניוון שרירים דושן FF ערכים של כמעט 90% בכמה שרירים⁸.

כי מולקולות לא קוטביים כגון שומנים אינם מתמוססים היטב פתרונות מורכבים ממולקולות הקוטב כגון מים, יצירת פאנטום יציב עם מטרה גבוהה FF נותר מאתגר. בשביל FF עד 50%, קיימות שיטות רבות יכול לשמש ליצירת מים ושמן פאנטום^9,10,11,12. שיטות אחרות להשיג FFs גבוה יותר בדרך כלל דורשים ציוד יקר כגון מהמגן או של תא קולי מפצל^13,14. למרות הטכניקות הללו לספק מפת דרכים עבור מטוסי פאנטום FF גבוהה, ציוד אילוצים, כמויות משתנות של פרטי ניסיוני להגביל את המאמצים ליצירת מים ושמן חזקים הדירים פאנטום.

בניין על שיטות קודמות אלה, פיתחנו שיטה לבניית מטוסי פאנטום מים שמן יעיל ויציב על פני ערכים טווח להתאמה אישית של FF. פרטים זה פרוטוקול הצעדים הדרושים כדי לעשות 5 x 100 מ של שמן פאנטום עם FF ערכים של 0%, 25%, 50%, 75% ו 100% באמצעות פלטה אחת. זה יכול בקלות להיות מותאם כדי ליצור אמצעי אחסון (10 עד 200 מ"ל) השונות אחוזי שומן (0 ל- 100%). היעילות של הטכניקה פנטום הוערך היתכנות המחקר בהשוואת שומן-מים MRI FF בערכי לערכים FF היעד של הפאנטום נבנה.

Protocol

1. מכינים את תחנת עבודה וחומרים

1. מקפידים על כל כללי הבטיחות במעבדה. לענוד הגנה העין וכפפות. קרא גיליון בטיחות חומרים עבור כל אחד ריאגנטים והם זהירות הולמים. סקור את חומרי, רשימת ציוד הפרוצדורות כימיים, כלי זכוכית אמצעי זהירות.
   התראה: פרוטוקול זה מחייב שימוש פלטה בטמפרטורות גבוהות. שימוש באזהרה, ללבוש כפפות חום עמיד בעת אינטראקציה עם חם מכולות ואל תגעו השטח של פלטת הבישול.
2. נקה את סביבת העבודה ולנקות את המשטחים עם חומר חיטוי. לשטוף את הידיים שלך, לשים כפפות.
3. לעקר את כל הכלים ואת החלק הפנימי של כל הצנצנות כדי להפחית את הסיכון הפוטנציאלי של זיהום להגדיל את תוחלת החיים של הפאנטום.
   הערה: אם הפאנטום ישמש עבור יותר מ כמה ימים, מדי פעם לנקות את השטח של הפאנטום השלים עם אתנול למניעת התפתחות חיידקים.

2. מכינים את הפתרון מים

1. להכין את סביבת העבודה של הפתרון מים. מקם את חומרים וציוד הבאים על הספסל: בוגר צילינדר, ביקר 400 מ ל, מערבבים בר, סולם, סירות שוקלים x 2, מרית, 2 x 1.0 מ"ל מזרקים עם המחט, מים מזוקקים, הסוכן ניגוד גדוליניום-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), חומרים פעילי שטח מסיסים במים, אגר, סודיום בנזואט.
   הערה: מזרקים יכול לשמש עם או בלי מחטים. עם זאת, באמצעות מחטים לשפר את דיוק המדידה ולעזור למנוע מתיז כאשר התוכן מתווספות לפתרונות מים או שמן.
2. במקום בר מערבבים לתוך גביע 400 מ. השתמש גליל 100 או 200 מ ל, בוגר כדי למדוד 300 מ ל מים מזוקקים, שופכים את המים לתוך הספל. להציב את הספל על פלטת הבישול ולהגדיר ב 90 ° C עם קצב מערבבים של 100 סל"ד.
   הערה: טמפרטורות גבוהות נמצאים בשימוש פרוטוקול זה כדי להשיג תוצאות מהירות. כי הפתרונות לא השאיר על פלטת הבישול במשך פרקי זמן ארוכים, הטמפרטורה קבע-נקודה על פלטת הבישול אינו משקף את הטמפרטורה של הפתרון.
3. להשתמש בקנה מידה המכויל למדידת g 0.30 של סודיום בנזואט לתוך סירה שוקלים. להוסיף סודיום בנזואט הפתרון מים.
4. להשתמש במזרק כדי למדוד 0.6 מיליליטר חומרים פעילי שטח מסיסים במים. ודא כי ישנם אין בועות אוויר. . תחזיקי את המחט כמה מילימטרים מעל המרכז של הפתרון, ולשחרר לאט של חומרים פעילי שטח מסיסים במים כדי למנוע מתיז על קירות הספל.
5. באמצעות מזרק נקי, למדוד 0.24 מ"ל של הסוכן ניגוד גדוליניום-DTPA. הוסף לזה הספל, באותה שיטה כמו שלב 2.4.
   הערה: גדוליניום-DTPA משמש להתאמת מאפייני הרפיה MRI של הפאנטום לאלה של הרקמה עניין. הקורא יכול לכוונן את העוצמה של גדוליניום-DTPA נוסף כדאי להתאים את מאפייני הרפיה של הרקמה עניין.
6. למדוד 9.0 גר' אגר לתוך סירה השקילה. לאט לאט כפיות של אגר עם מרית לתוך. הספל עם מים.
7. ברגע הכל נוספה לפתרון של מים, מעלה את הטמפרטורה פלטה עד 350 ° C ומערבבים בר מהירות ל 1100 סל ד למשך 5-10 דקות להמיס את אגר.
   1. כדי לבדוק אם אגר מומס, בקצרה להסיר הפתרון מים פלטת הבישול, תפסיק לערבב, ולבדוק את הצבע של הפתרון. אגר מומסת צריך להיות נקי (אין צליינים או גושים), צהוב או אמבר בצבע.
8. ברגע אגר מלא מומס, השתמש מזרק או שופכים כ 3.5 מ"ל של הפתרון מים לתוך בקבוקון קטן. אם הפתרון המבחן אינו מוגדר או מפריד לאחר 5-10 דקות, אגר לא נמס. מעלה את הטמפרטורה פלטה בחזרה עד 350 ° C ולהמשיך חימום הפתרון.
9. חזור על שלב 2.8 עד המים פתרון בערכות המבחנה מבחן כראוי.
10. להשאיר את הפתרון מים על פלטת הבישול-50 ° C ו 100 סל"ד. לנקות את שטח העבודה ולהתכונן הפתרון שמן.
    1. להסיר את החומרים הבאים מן הספסל: גודל, 2 x שוקלים סירות מרית, 2 x 1.0 מ"ל מזרקים עם המחט (משמש), מים מזוקקים, הסוכן ניגוד גדוליניום-DTPA, חומרים פעילי שטח מסיסים במים, אגר, סודיום בנזואט.
    2. מקם את חומרים וציוד הבאים על הספסל: ביקר 400 מ ל (נקי), מערבבים בר (נקי), 2.0 mL מזרק עם מחט, שמן בוטנים, חומרים פעילי שטח מסיסים.

3. שמן פתרון

1. במקום בר חדש מערבבים לתוך גביע נקי 400 מ. השתמש משורה של כדי למדוד 300 מ של שמן בוטנים ויוצקים לתוך הספל. להסיר את. הספל המכיל את הפתרון מים ומניחים את הספל פתרון שמן על פלטת הבישול. הגדר 90 ° C עם קצב מערבבים של 100 סל"ד עבור 1 דקות.
   הערה: שמן בוטנים משמש כי יש לו מגוון תהודה מגנטית גרעינית דומה בהשוואה טריגליצרידים רקמת שומן אנושי¹⁵.
   1. אין להשאיר את השמן על פלטת הבישול ללא התערבות. אם השמן חם מדי ומתחיל לעשן, להסיר אותו פלטת הבישול ולהפחית את הטמפרטורה לפני שחזר את השמן פלטת הבישול.
2. מודדים מ 3.0 ל חומרים פעילי שטח מסיסים עם מזרק נקי. תוך שימוש באותה טכניקה שמתואר בשלב 2.4, להוסיף את חומרים פעילי שטח מסיסים כשהספל. הגדר פלטת הבישול 150 ° C ו 1100 סל ד במשך 5 דקות לערבב באופן מלא את הפתרון שמן.
3. . קח את הפתרון שמן את פלטת הבישול ולנקות את סביבת העבודה לקראת יצירת הפאנטום.
   1. להסיר את החומרים הבאים מן הספסל: 2.0 mL מזרק עם מחט (משמש), שמן בוטנים, חומרים פעילי שטח מסיסים.
   2. מקם את חומרים וציוד הבאים על הספסל: 250 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק, מערבבים בר (נקי), פיפטות נפחי בעל נפח פיפטה, צנצנות זכוכית 5 x 120 מ"ל.

4. ליצור אמולסיה פנטום

1. להכין פיפטות הנפחי עבור פתרונות מים ושמן. פיפטות אמור לשמש רק עם פתרון בהתאמה שלהם למניעת זיהום צולב.
   1. התאמה לגודל פיפטה לאמצעי האחסון בשימוש בפרוטוקול. לדוגמה, השתמש פיפטות נפח 2 x 50 מ"ל (50 מ ל מים פתרון + 50 מ ל שמן פתרון) כדי ליצור 100 מל פנטום עם מטרה FF של 50% שומן.
2. להציב את הפתרון מים על פלטת הבישול ולהגדיר פלטת הבישול עד 300 ° C ו 1100 סל ד. לאחר 4-5 דקות, לכבות את בחישה.
3. באמצעות פיפטה של נפחי, בדוק אם הפתרון מים הוא מוכן לחילוץ מאת חלקית ממלא את פיפטה כמות קטנה (5-10 מ ל) של הפתרון ושחרור בחזרה לתוך הספל. אם הפתרון המים יכול להיות בקלות להסיר שוחרר ללא שאריות מופרז ב פיפטה, נעבור לשלב הבא, אחרת, להשאיר את זה על פלטת הבישול ולבדוק שוב בעוד 2-3 דקות.
   הערה: מרכיבי הפתרון מים הם רגישים יותר הגדרת ומפריד, כך שעדיף לשמור את הפתרון מים מלהיב ו/או חם לעיתים קרובות ככל האפשר. אם הפתרון מים הוא לא חימם ונסערת לפני העברת, זה יהיה קשה מאוד למדוד כרכים מדויקת בשל הנטייה של אגר יקפאו כשהוא מקורר.
4. בזהירות להוסיף בר נקי מערבבים 250 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק. לקחת את הפתרון מים את פלטת הבישול, למדוד את עוצמת הקול הנכון (טבלה 2), להעביר אותו הבקבוק Erlenmeyer.
5. להציב את הפתרון שמן על פלטת הבישול ולהגדיר ב 90 ° C ו- 1100 סל ד כדי להבטיח שהתמיסה אחידה. לאחר 1-2 דקות, להסיר את הפתרון שמן פלטת הבישול ולהחליף אותו עם הבקבוק Erlenmeyer.
6. למדוד את הכמות הנכונה של הפתרון שמן (טבלה 2) ולהוסיף לאט לאט הפתרון מים ב. הבקבוק Erlenmeyer.
7. לאחר כל פתרון שמן נוספה, מעלה את הטמפרטורה עד 300 ° C ולתחזק את ערבוב ב 1100 סל ד. מערבבים פתרונות משולבים עבור 4-5 דקות (שם צריך להיות מערבולת מהבר stir). האמולסיה להיות לבן, בעל מרקם קרמי.
8. השתמש רטריבר בר מערבבים מגנטי כדי להסיר הבר מערבבים.
   הערה: רטריבר בר מערבבים אמור לשמש כדי להסיר בפסי מערבבים כל אמולסיות בעתיד. לנקותו ביסודיות בין כל שימוש.
9. להשתמש בזהירות שופכים את התערובת בתוך הבקבוק Erlenmeyer לתוך צנצנת זכוכית נקי 120 מ ל כפפות חום עמיד. מוזגים את התערובת בצד צנצנת הזכוכית כדי למנוע בועות התערובת כשהיא מתקררת.
10. לנקות את הבקבוק Erlenmeyer ובר -מערבבים ולאחר מכן חזור על שלבים 4.2-4.8, התאמת הסכומים של פתרונות מים ושמן, עד כל מטוסי פאנטום נוצרים.
    הערה: ודא שהזכוכית מגניב לפני ניקוי.

תוצאות

אם הפתרון מים הוכן כראוי, כמות קטנה של הפתרון צריך ולריפויו במהירות בבקבוקון מבחן (איור 1, שמאלה). אם הפתרון מפריד (איור 1, ימינה), הפתרון צריך להיות מוכן שוב (שהומלץ בשלב 3.8 לפרוטוקול). אם האמולסיה מפריד (דוגמאות א...

Discussion

אנו מתארים שיטה חזקה ליצירת מים ושמן פאנטום מתאים עבור אימות של טכניקות הדמיה רפואית השתמשו כדי לכמת את התוכן, רקמת שומן, טריגליצרידים vivo בתוך. על-ידי יצירת שני מאגרים (אחד עבור הפתרון שמן) ואחד עבור הפתרון מים, נבנו פאנטום יציב עם מגוון רחב של ערכים FF – כולל ערכים העולה על 50% – ללא צורך ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Distilled Water	Amazon	B000P9BY38	Base of water solution
Agar	Sigma Aldrich Incorporated	A1296-100G	Gelling agent
Water-Soluble Surfactant	Sigma Aldrich Incorporated	P1379-500ML	Surfactant/emulsifying agent
Gadolinium-DTPA Contrast Agent	Bayer Healthcare	50419-0188-01	Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent.
Sodium Benzoate	Sigma Aldrich Incorporated	71300-250G	Preservative
Peanut Oil	Amazon	54782-LOU	Base of oil solution
Oil-Soluble Surfactant	Sigma Aldrich Incorporated	S6760-250ML	Surfactant/emulsifying agent
Hotplate w/ Stirrer	Fisher Scientific	07-770-152
Stir bars (Egg-Shaped)	Sigma Aldrich Incorporated	Z127116-1EA
400 mL Beaker	Sigma Aldrich Incorporated	CLS1003400-48EA
250 mL Erlenmeyer Flask	Sigma Aldrich Incorporated	CLS4450250-6EA
25 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2P	Quantity = 2
50 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2S	Quantity = 2
75 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2T	Quantity = 2
3.0 mL Syringe	Sigma Aldrich Incorporated	Z248002-1PAK
1.0 mL Syringe	Sigma Aldrich Incorporated	Z230723-1PAK
Spatula	Sigma Aldrich Incorporated	S3897-1EA
Scale (100g X 0.01g Resolution)	Amazon	AWS-100-BLK
Weigh Boats	Sigma Aldrich Incorporated	Z740499-500EA
120 mL Glass Jars	McMaster Carr Supply Co	3801T73
Heat Resistant Gloves (pair)	Amazon	B075GX43MN
Syringe Needles	Sigma Aldrich Incorporated	Z192341-100EA
18" stir bar retriver	Fisher Scientific	14-513-70
1 Dram Clear Glass Vial	Fisher Scientific	03-339-25B